利用生命内成像和固定组织分析评估与癌细胞传播相关的转移门道介导血管渗透性的肿瘤微环境

摘要

我们描述了两种方法,用于评估与转移(TMEM)的肿瘤微环境(TMEM)和癌细胞内溢相关的瞬态血管渗透性,使用静脉注射高分子量(155 kDa)dextran小鼠。这些方法包括活体动物的活体成像和使用免疫荧光的固定组织分析。

摘要

癌症相关死亡的最常见原因是转移,这个过程需要将癌细胞从原发性肿瘤传播到继发位点。最近,我们确定,原发性乳腺癌和肺部转移部位的癌细胞传播只发生在称为肿瘤微环境(TMEM)的门口。TMEM 门数是乳腺癌患者转移性疾病远程复发的预后。TMEM 门由癌细胞组成,该细胞在与血管周围、原兆噬细胞直接接触时过度表达行为蛋白调节蛋白 Mena,该细胞表示高水平的 TIE2 和 VEGF,其中这两个细胞都与血液紧密结合血管内皮细胞。癌细胞可以通过TMEM门内血管,由于由TMEM相关巨噬细胞和TMEM相关的梅纳表达癌细胞的联合活动编排的瞬态血管渗透。在本手稿中,我们描述了两种评估 TMEM 介导的瞬态血管渗透性的方法:生命内成像和固定组织免疫荧光。虽然这两种方法各有优缺点,但两种方法的结合可以最完整地分析 TMEM 介导的血管渗透性以及 TMEM 功能的微观环境先决条件。由于乳腺癌的转移过程,可能还有其他类型的癌症,涉及通过TMEM门传播癌细胞,因此必须采用成熟的方法来分析TMEM门活动。此处描述的两种方法为分析 TMEM 门性提供了一种全面的方法 , 无论是幼稚的还是药物治疗的动物 , 这对预防癌细胞的制剂的临床前试验至关重要通过TMEM传播。

引言

最近对癌症转移的理解的进步发现,上皮到间质过渡(EMT)和诱导迁移/侵入性癌细胞亚群本身不足以进行造血传播^1.确实,以前人们认为,通过整个与癌症相关的内皮物转移癌细胞,因为肿瘤新血管学通常具有低围肠覆盖率的特点,因此具有很强的渗透性和渗透性。不稳定2,^3,4。虽然肿瘤内功能缺陷的暗示性很强,但致癌过程中的血管修饰本身并不提供肿瘤细胞能够以不受控制的方式轻易穿透血管的证据。从生命内成像(IVI)研究的见解,其中肿瘤细胞荧光标记和血管标记通过静脉注射荧光探针(如dextran或量子点),表明,虽然肿瘤血管是均匀的可渗透至低分子量的extrans(例如70 kD)、高分子量的extrans(155 kD)和肿瘤细胞只能在位于血管分支^点5的专门内血管内分部穿过内皮。^6,7.使用动物模型和人类患者衍生材料进行的免疫组织化学(IHC)分析表明,这些部位是专门调节局部和瞬态血管渗透性的"门道",提供了一个简短的窗口。迁徙/侵入性癌细胞进入循环的机会。这些门道被称为"转移的肿瘤微环境"或"TMEM",而且,相当预料的是,它们的密度与乳腺癌患者患转移性疾病的风险增加有关8,9, ¹⁰.

每个TMEM门由三种不同类型的细胞组成:血管内大噬细胞,肿瘤细胞过度表达行为蛋白哺乳动物启用(Mena),和内皮细胞,所有直接物理接触对方1^{, 5,9,10,11,12,13}。TMEM作为血管内门的功能的关键事件是血管内皮生长因子(VEGF)通过血管内大噬^细胞14向基础血管的局部释放。VEGF 可以破坏内皮细胞 15、16、17、18、19 之间的同型结点,这种现象会导致瞬态血管泄漏,也称为"爆裂"渗透性,如IVI研究5所述。 TMEM 巨噬细胞已被证明表达酪氨酸激酶受体TIE2,这是VEGF介导的TMEM功能和这些巨噬细胞的定位到血管周围利基5,^20,21,22.除了调节癌细胞传播和转移外,TIE2⁺巨噬细胞已被证明是肿瘤血管生成21、22、23的中央调节^{器, 24,25,26,27,28,29,30,31}。因此,TIE2⁺巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分,是转移级联的主要调节器。

为了更好地概念化TMEM介导的血管渗透性(即"爆裂"),将它与与内皮细胞-细胞结的溶解无关的其他血管渗透性模式区分开来非常重要。在完整的内皮内皮(其紧和粘结未中断),有三种主要类型的血管渗透性:(a) 细胞化,可能,也可能不,与摄入的物质的转细胞;(a) 细胞虫症,可以,也可能不,与摄入的物质的转细胞;((d) 细胞内渗透。(d) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(d) 血管渗透性。(a) 血管渗透性。(a) 血管渗透性,可能或可能不会与摄入材料的转细胞结合;(b) 通过内皮芬斯特雷运输材料;和(c) 通过副细胞通路运输材料,由内皮紧接15、16、17、18、19、32调节^,33,34.虽然在许多肿瘤中解除管制,但上述血管渗透模式主要在正常组织生理学和平衡的背景下加以描述,其极端是渗透性有限的组织(例如,血脑屏障,血检屏障),或丰富的渗透性(例如,肾肾肾小球仪的芬芳毛细血管)34,35,36,37 。

使用多光子生命内成像和多路免疫荧光显微镜,我们能够区分TMEM介导的血管渗透性("爆裂")和乳腺肿瘤中其他血管渗透性模式。为此,我们在小鼠中单次静脉注射高分子量荧光标记的探针。然后,使用活小鼠的活体成像捕获自发性爆裂事件;或者,通过血脉(如CD31+或内杜木明+)和使用免疫荧光显微镜的TMEM门分,可以量化探针的外化。此处介绍的协议描述了这两种技术,这些技术可以独立使用,也可以相互结合使用。

研究方案

所有使用活体动物的实验必须按照动物使用和护理准则和条例进行。本研究中描述的程序是按照国家卫生研究院关于照料和使用实验动物的规定,并经阿尔伯特·爱因斯坦医学医学学院动物护理和使用学院批准进行的。委员会。

1. 利用活体动物成像评估"爆裂渗透性"

1. 将合成乳腺肿瘤移植到具有荧光巨噬细胞的小鼠宿主中
   1. 生成适合移植的肿瘤组织片段。
      1. 通过跨越自发的、自生的、基因工程的小鼠乳腺癌模型 MMTV-PyMT 小鼠与表达荧光记者³⁸的转基因小鼠,在小鼠乳腺癌模型中生成荧光标记^{肿瘤, 39} [例如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)或Dendra2]。
      2. 允许带有荧光标记肿瘤的 MMTV-PyMT 小鼠长到不超过 2 厘米(大约 10-12 周的年龄)的大小。
      3. 将携带MMTV-PyMT小鼠的肿瘤放入一个有5%的黄曲的腔室,直到所有呼吸停止30秒后,将其安乐死。
      4. 进行宫颈脱位。
      5. 使用局部脱毛霜从安乐死小鼠的腹部去除头发。
      6. 将带有 DMEM/F12 细胞培养基培养基的培养皿放在冰上。
      7. 将鼠标和培养皿放在冰上,放入烟罩。
      8. 用70%的乙醇消毒小鼠的腹部。
      9. 使用无菌手套和手术工具(消毒剪刀、钳子和刀片)去除肿瘤并将其放入培养皿中。
      10. 将肿瘤切成小块(+2毫米 x 2毫米 x 2毫米大小),丢弃任何坏死部分,而它们在培养皿中。
   2. 将肿瘤片移植到受体宿主中。
      1. 用转基因荧光标记巨噬细胞饲养小鼠,例如 MacGreen⁴⁰或 MacBlue ⁴¹小鼠(Csf1r -GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. 允许带有荧光标记的巨噬细胞的FVB小鼠长到+4-6周)。
      3. 用5%的半分面胶作为载体气体,用荧光标记巨噬细胞对FVB小鼠进行麻醉。
      4. 将麻醉量降低至±3%异二苯,并在小鼠眼睛上涂上眼膏,以防止干燥。
      5. 从小鼠的第 4^个乳腺上去除头发。
      6. 用贝他当素清洁皮肤。在整个程序的其余部分保持无菌条件非常重要。这包括使用消毒仪器和试剂。
      7. 使一个小切口 +2-3 毫米只是低于^{第 4 个}奶嘴。
      8. 解剖,直到乳腺脂肪垫暴露。
      9. 从培养皿中取一块肿瘤,用人工细胞外基质涂上。
      10. 移植肿瘤下的第4个乳腺脂肪垫。
      11. 使用氰丙烯酸酯粘合剂关闭切口。
      12. 持续监测动物,直到它从麻醉中完全恢复,并能够保持胸腔回肠。此外,在完全恢复之前,不要将动物归还给其他动物的公司。
      13. 为了尽量减少感染,在动物的饮用水瓶(8液体盎司)中加入1 mL的100毫克/mL苯丙沙辛抗生素。
      14. 让肿瘤生长到明显(+5毫米;+4周)。
      15. 根据实验情况,将小鼠分配到治疗组,并执行相应的治疗(如果适用)。
2. 用于生命内成像的设置
   1. 打开显微镜的双光子激光和探测器。
   2. 打开加热盒并预热显微镜的 x-y 级。
   3. 将定制的舞台插入⁴²到 x-y 阶段。
3. 成像窗口的准备
   1. 在设置成像之前,高压灭菌器定制圆形成像窗口框架⁴²。
   2. 使用移液器或胰岛素注射器将一层薄薄的氰丙烯酸酯粘合剂放在窗框上,并贴上 8 mm 圆形盖玻璃。
      注:1) 避免在盖玻璃的透明孔径上残留,这一点很重要。2) 在进行成像前,必须将盖玻璃粘附在窗框上至少 1 小时。
   3. 使用用少量丙酮润湿的实验室擦拭,仔细擦拭盖玻璃透明孔径上多余的氰化。
4. 制备尾静脉导管,用于在成像过程中给给液体和荧光染料
   1. 切割一块30厘米的聚乙烯管,以构建一个尾静脉导管。
   2. 将 30 G 针头的针部从 Luer 尖塔上分离,轻轻来回弯曲针头,直到其断裂。
      注:针头应靠近 Luer 角针,而不是针尖。这可以通过钳子或钳子来抓住针头,以防止针棒受伤。
   3. 将针头的钝端插入聚乙烯管的一端。
   4. 将另一根 30 G 针头的锋利端插入管的另一端,保持其 Luer 分管连接。
   5. 用磷酸盐缓冲盐水填充 1 cc 注射器,将其连接到组装导管的 Luer 分管,并冲洗尾静脉导管,确保系统中没有气泡。
   6. 对于血管标签,用 100 μL 的 100 μL 10 mg/kg 155 kDa dextran-四甲基二甲胺 (TMR) 或量子点填充 1 cc 注射器。
5. 用于成像的鼠标制备
   1. 使用 4%-5% 的杂散物与 100% 氧气混合在下面的笼子(+1 英尺以下)中麻醉小鼠,流量为每分钟 1.5-2 L。
   2. 打开手术工作区上的热灯。此步骤对于在手术期间保持小鼠的核心生理体温至关重要。
   3. 将鼠标放在热灯下,在手术期间将麻醉降低至2%-3%。
      注:请务必将热灯与鼠标保持安全距离(约 1 英尺),以避免过热。
   4. 将眼膏放在小鼠眼睛上,以防止眼睛干燥和失明。
   5. 通过执行脚趾夹测试测试鼠标是否被麻醉。如果动物退出,将异曲兰的剂量增加1%,并在1-2分钟内重新测试。
   6. 将尾静脉导管插入尾部最远端。
   7. 用一小块实验胶带将尾静脉导管固定在尾巴上,胶带包裹在尾巴上,粘在针上,以确保它不会脱落。
   8. 通过尾静脉导管注入每h 50 μL的PBS,以提供足够的水化。避免向导管中注入过多的液体(不超过每小时 200 μL)或任何气泡,这一点至关重要,因为这可能对鼠标造成致命。
   9. 使用脱毛霜去除第4和第5乳腺腹部的头发。
   10. 用贝他当素清洁皮肤,让皮肤干燥。
   11. 使纵向中线切口开始立即优于生殖器,并携带切口到^第4乳腺的优越方面的水平。
   12. 将切口横向至第 4^乳腺的优越方面。在这一点上,避免损害血液供应至关重要。
   13. 使用无菌钳子和剪刀将乳腺脂肪垫从围膜上分离出,形成组织皮瓣。
       注:皮肤皮瓣成像易受显著运动伪影和组织脱水的影响。如前^所述,通过在皮瓣的皮肤侧贴上一块坚硬的橡胶(使软组织变硬并将其与身体其他部位分离),然后将肿瘤放入浅成像中,可以避免这些障碍。窗口,以保持水化。这对于稳定成像至关重要,因为在此环境中的肿瘤和周围组织非常合规。
   14. 将一小块尺寸为 2 cm x 2 cm 的硬质橡胶固定在皮瓣的皮面上,以固定(使用氰丙烯酸酯胶水)来稳定皮瓣。肿瘤应位于橡胶稳定的区域的中心。
   15. 保持暴露的组织用PBS滴水合。
   16. 在定制成像窗框的外边缘涂抹一小片氰化丙烯酸酯。
   17. 在盖玻璃中心涂抹一小滴 PBS (±10±20 μL)。
   18. 用实验室擦拭干燥周围的皮瓣组织。务必确保窗框上的氰化不与玻璃上的 PBS 接触,因为这可能导致氰化丙烯酸酯聚合并过早设置。
   19. 将小成像窗口固定在组织活门上,肿瘤位于透明孔径的中心。
   20. 从舞台上拆下加热盒。
   21. 将麻醉小鼠和尾静脉导管转移到显微镜阶段。格外小心,确保尾静脉导管不会脱落。
   22. 将鼠标放在舞台上的易发位置。
   23. 将鼻锥的鼻锥放在鼻腔上,以确保麻醉的维持。
   24. 将窗口插入自定义 x-y 级板上的孔中。
   25. 将加热盒放回舞台上以保持生理温度。
   26. 通过将脉冲血氧仪探头通过夹子传感器连接到后爪,监控动物的生命体征。
   27. 慢慢减少约卢兰到0.5%-1%,以保持足够的血液流动,避免过度麻醉小鼠。
6. 生命内成像
   注:本部分描述的成像是在定制双激光多光子显微镜上进行的,先前已经描述了5,39,45。简而言之,飞秒激光用于产生以 880 nm 为中心的 90 飞秒脉冲激光。荧光光在从激励光分离后,通过二色光(色度,Z720DCXXR)与激发光分离后,通过四个同时采集的探测器中的三个(蓝色 = 447/60、绿色 = 520/65 和红色 580/60;中央波长/带宽)进行检测。显微镜支架包含 25 倍、1.05 NA(数字孔径)长工作距离(2 mm)物镜。需要注意的是,虽然我们使用了定制的显微镜,但下述协议也可以在任何市售的多光子显微镜上完成。
   1. 在 25x、1.05 NA 显微镜物镜和车窗盖玻璃之间放置一滴蒸馏水,使其与光学接触。
   2. 使用显微镜目镜将焦点对准窗口表面附近有荧光肿瘤细胞的区域。
   3. 查找流动的血管和标记的巨噬细胞。关键是要有流动的血管来评估血管的动力学。
   4. 将显微镜切换到多光子模式。
   5. 设置 z 系列的上限和下限,该范围约为 50 μm。
      1. 通过使用焦点调节器将目标移动到最浅的位置,并单击 Z 位置顶部按钮将此位置标记为软件中的零,从而设置 z 系列的上限。
      2. 设置将目标移动到最深处(通常从顶部移动到 50-70 μm 的较小肿瘤)的 z 系列的下限,然后单击 Z 位置底部按钮。
      3. 将 z 步长大小设置为 5 μm。
   6. 单击"时移"面板按钮,将采集之间的时间间隔设置为至少 10 秒,以提供足够的时间来补充目标透镜上方的水。这是用挤压移液器在长时间内在目标上手动完成的。
   7. 取出尾静脉导管中带PBS的注射器,用另一个含有155 kDa dextran-TMR(四甲基罗丹胺)的注射器更换。
   8. 通过尾静脉导管注射100 μL的155 kDa dextran-TMR。
   9. 注射后,用PBS注射器更换TMR注射器。
   10. 通过单击 Z-Stack 和时移按钮,然后单击记录按钮来获取 z 堆栈延时成像。
   11. 每30-45分钟注射50μL的PBS,以保持动物的充分水化。避免同时注射超过 200 μL,因为这可能导致液体过载。
7. 安乐 死
   1. 将异曲成增加到5%,并将动物保持在5%的异曲原以下,鼻锥就位,直到呼吸停止后30s。
   2. 将鼠标从舞台上卸下。
   3. 进行宫颈脱位。
8. 图像处理
   1. 将所有图像加载到 ImageJ 中,并将其格式化为 5 维超堆栈(x、y、z、t 和颜色通道)。
   2. 使用既定^方法38,执行光谱重叠分离(即:GFP和CFP)和消除超堆栈的x-y漂移。
   3. 使用亮度和对比度调整来增加血通道的白电平,使背景信号变得可见。
   4. 对于每个 z 切片,仔细检查每个影片是否有瞬态血管泄漏的迹象("爆裂")。以快速帧速率 (40 fps) 运行影片可能有助于进行这种识别。
   5. 一旦识别了突发,将此通道的亮度返回到正常水平,并将超堆栈裁剪到此区域和 z 切片。

2. 使用固定组织分析评估血管外部

1. 肿瘤和样品制备
   注:本议定书^的第二部分假定乳腺肿瘤是从乳腺癌的正交移植小鼠模型(即MMTV-PyMT)中采集的。此模型可能与协议第 1 部分中描述的模型相同,尽管此时不需要荧光标记的肿瘤。
   1. 实验管道终止(即药物治疗等)终止后,在牺牲小鼠之前,进行100μL的10mg/mL 155 kDa-四甲基红胺的尾输注。
   2. 牺牲小鼠和收获乳房肿瘤。
   3. 将肿瘤固定在10%的形式48-72小时,并继续石蜡嵌入。
   4. 使用微图,从正式固定石蜡嵌入(FFPE)组织中切割两个5μm厚的连续幻灯片。一张幻灯片用于染色 dextran,另一张用于执行 TMEM 三重 IHC,供参考。
      注:TMEM三免疫组化学方案已^{在其他地方10}描述。
2. IF 染色和扫描两个顺序部分中的第一个
   1. 将幻灯片提交到标准去石蜡化协议。这包括在二甲苯中进行两次后续浸渍(每次10分钟),随后在连续稀释的酒精溶液中脱水(100%、95%、70%和50%EtOH,在H₂O中,每次浸泡2分钟)。
   2. 通过加热(接近沸点)浸没在青石中的部分(pH 6.0 调整)20分钟,执行抗原检索。
   3. 让样品冷却至室温15-20分钟,然后在PBS中洗3次,每次洗2分钟。
   4. 在阻塞缓冲液中堵塞60-90分钟(10%FBS;1%BSA;0.0025%鱼皮明胶;0.05%PBST,即0.05%补间-20的PBS)。
   5. 用原发大鼠和兔子抗体的混合物孵育样品,分别针对内皮素和TMR,然后用PBST3x,每次2分钟洗涤。
   6. 用二级驴抗体的混合物孵育样品,以对付大鼠IgG(与Alexa-647结合)和兔子IgG(与Alexa-488结合),然后分别用PBST3x 2分钟洗涤。
   7. 执行常规 DAPI 染色(即浸入 DAPI 溶液 5-6 分钟),使用不含甘油的"硬"安装介质安装幻灯片,并存放在黑暗的地方,直到扫描。
   8. 为获得最佳效果,可在数字整个幻灯片扫描仪上扫描幻灯片。
3. 图像分析
   1. 使用适合数字病理学的任何软件,每箱捕获 10 个高功率场 (HPF)。
   2. 将内皮乌斯金(红色)和 TMR(绿色)通道分别保存为 TIFF。
   3. 使用 ImageJ,上传 TIFF 文件并将其转换为 8 位图像。
   4. 将 8 位图像阈值到负控制级别,并生成两个双面化图像,显示内皮素和 TMR"掩码"。
   5. 从二进制工具中,选择 Endomucin 蒙版上的填充孔。
   6. 生成并保存以下五个感兴趣的区域:1) 阈值的 dextran 图像为"Dextran ROI"(ROI1),2) 阈值内西金图像为"血管 ROI"(ROI2),3) 倒置内显辛图像为"外血管 ROI"(ROI3),4)相交的"血管外 ROI"和"额外 ROI"图像 (ROI1 = ROI3) 作为"血管外投资回报率"(ROI4),5) 整个图像为"肿瘤 ROI"(ROI5)。
   7. 将 ROI4 区域除以 ROI5 区域,再乘以 100 以生成血管外分光覆盖整个肿瘤的百分比面积。
   8. 每箱重复10-20个HPFs(取决于组织可用性)的过程,并为每个病例生成平均血管外分量(%面积)。

结果

本文中描述的实验过程在图1A-C中进行了简要的总结和说明。

为了测量TMEM介导的血管渗透性("爆裂活性")和减少其他血管渗透模式(如导言所述的跨细胞和准细胞)的实验噪音,我们进行了静脉注射(即v.)注入高分子量探针,如155 kDa Dextran,与四甲基罗丹胺结合。低分子量的Dextrans没有区分三种血管渗透模式。我们以往的经验显示,155 kDa TMR-Dextran 的全?...

讨论

在这里,我们概述了两个协议,可用于可视化和量化一种特定类型的血管渗透性,这是存在于TMEM门口,并与血管紧和粘附结的中断相关。这种类型的血管渗透性是瞬态的,由三方TMEM细胞复合体控制,如上^文5所述。识别和量化 TMEM 相关血管渗透性的能力对于评估亲转移性癌细胞微环境以及检查传统细胞毒性疗法对肿瘤的影响的临床前研究至关重要微环境以及靶向和非靶向疗法的抗转移潜?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488)	Life Technologies Corporation	A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647)	Life Technologies Corporation	A-21247
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Citrate	Eng Scientific Inc	9770
Cover Glass Slips	Electron Microscopy Sciences	72296-08
Cyanoacrylate Adhesive	Henkel Adhesive	1647358
DAPI	Perkin Elmer	FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine	Sigma Aldrich	T1287
DMEM/F12	Gibco	11320-033
Endomucin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	sc-65495
Enrofloxacin	Bayer	84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F2442
Fish Skin Gelatin	Fisher Scientific	G7765
Insulin Syringe	Becton Dickinson	309659
Isofluorane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Matrigel	Corning	CB40234	Artificial extracellular matrix
Needle (30 G)	Becton Dickinson	305128
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies Corporation	PBS
Polyethylene Tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1
Pulse Oximeter	Kent Scientific	MouseOx
Puralube Vet Ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Quantum Dots	Life Technologies Corporation	Q21561MP
Rubber	McMaster Carr	1310N14
TMR (primary antibody)	Invitrogen	A6397
Tween-20	MP Biologicals	TWEEN201
Xylene	Fisher Scientific	184835