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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben zwei Methoden zur Beurteilung der transienten vaskulären Permeabilität im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung der Metastasenfunktion (TMEM) und der Krebszellintravasation unter intravenöser Injektion von hochmolekularem Dextran (155 kDa) bei Mäusen. Die Methoden umfassen intravitale Bildgebung bei lebenden Tieren und feste Gewebeanalyse mittels Immunfluoreszenz.

Zusammenfassung

Die häufigste Ursache für krebsbedingte Mortalität ist Metastasierung, ein Prozess, der die Verbreitung von Krebszellen vom Primärtumor an sekundäre Stellen erfordert. Kürzlich haben wir festgestellt, dass die Verbreitung von Krebszellen bei primärem Brustkrebs und an metastasierenden Stellen in der Lunge nur an Türöffnungen auftritt, die als Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM) bezeichnet werden. TMEM Türnummer ist prognostisch für das ferne Wiederauftreten von metastasierenden Erkrankungen bei Brustkrebspatientinnen. TMEM-Türen bestehen aus einer Krebszelle, die das Aktin-Regulierungsprotein Mena in direktem Kontakt mit einem perivaskulären, proangiogenen Makrophagen überausdrückt, das einen hohen ANTEIL an TIE2 und VEGF ausdrückt, wo beide Zellen eng an ein Blut gebunden sind. Gefäß-Endothelzelle. Krebszellen können durch TMEM-Türen durch vorübergehende Gefäßdurchlässigkeit intravasiert werden, die durch die gemeinsame Aktivität des TMEM-assoziierten Makrophagens und der TMEM-assoziierten Mena-exekuitienten Krebszelle orchestriert wird. In diesem Manuskript beschreiben wir zwei Methoden zur Beurteilung der TMEM-vermittelten transienten vaskulären Permeabilität: intravitale Bildgebung und fixe Gewebeimmunfluoreszenz. Obwohl beide Methoden ihre Vor- und Nachteile haben, kann die Kombination der beiden Methoden die umfassendsten Analysen der TMEM-vermittelten Gefäßdurchlässigkeit sowie mikroökologische Voraussetzungen für die TMEM-Funktion liefern. Da der metastasierende Prozess bei Brustkrebs und möglicherweise anderen Krebsarten die Verbreitung von Krebszellen über TMEM-Türen beinhaltet, ist es wichtig, gut etablierte Methoden für die Analyse der TMEM-Türbahnaktivität einzusetzen. Die beiden hier beschriebenen Methoden bieten einen umfassenden Ansatz für die Analyse der TMEM-Türbahnaktivität, entweder bei naiven oder pharmakologisch behandelten Tieren, was für präklinische Versuche mit Wirkstoffen, die Krebszellen verhindern, von größter Bedeutung ist. Verbreitung über TMEM.

Einleitung

Jüngste Fortschritte in unserem Verständnis von Krebsmetastasen haben aufgedeckt, dass epitheliale in mesenchymale Übergänge (EMT) und die Induktion einer migranten-invasiven Krebszellsubpopulation für sich genommen nicht ausreichen, um hämatogene Verbreitung zu ermöglichen. 1. Tatsächlich wurde früher angenommen, dass metastasierende Krebszellen durch die Gesamtheit des krebsassoziierten Endothel intravasieren, da die Tumorneovaskulatur oft durch eine geringe Pericytabdeckung gekennzeichnet ist und als solche instabil2,3,4. Obwohl sehr suggestiv für defekte Funktionen innerhalb des Tumors, vaskuläre Modifikationen während der Karzinogenese liefern keinen Beweis per se, dass Tumorzellen Blutgefäße leicht und unkontrolliert durchdringen können. Erkenntnisse aus intravitalen Bildgebungsstudien (IVI), in denen Tumorzellen fluoreszierend markiert werden und die Vaskulatur über die intravenöse Injektion von Fluoreszenzsonden (wie Dextran oder Quantenpunkten) gekennzeichnet ist, zeigen, dass Tumorgefäße gleichmäßig sind, während durchlässige bis niedermolekulare Dextrans (z.B. 70 kD), hochmolekulare Dextrans (155 kD) und Tumorzellen können das Endothel nur an spezialisierten Stellen der Intravasation überqueren, die sich bevorzugt am GefäßzweigPunkt5 befinden, 6 , 7. Immunhistochemische (IHC) Analysen mit Tiermodellen und menschlichem Patientenmaterial haben gezeigt, dass diese Standorte "Türen" sind, die sich auf die lokale und vorübergehende Regulierung der Gefäßdurchlässigkeit spezialisieren und ein kurzes Fenster Möglichkeit für wandernde/invasive Krebszellen, in den Kreislauf einzudringen. Diese Türen werden "Tumor Microenvironment of Metastasis" oder "TMEM" genannt, und, sehr wahrscheinlich, ihre Dichte korreliert mit einem erhöhten Risiko, eine metastasierende Erkrankung bei Brustkrebspatientinnen zu entwickeln8,9, 10.

Jede TMEM-Tür besteht aus drei verschiedenen Zelltypen: einem perivaskulären Makrophagen, einer Tumorzelle, die das aktivierte actin-regulatorische ProteinSäugetier (Mena) überausexzätiert, und einer Endothelzelle, die alle in direktem körperlichen Kontakt miteinander stehen1, 5,9,10,11,12,13. Das Schlüsselereignis für die Funktion von TMEM als Intravasationstürweg ist die lokalisierte Freisetzung des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors (VEGF) auf das zugrunde liegende Gefäß durch das perivaskuläre Makrophagen14. VEGF kann homotypische Verbindungen zwischen Endothelzellen15,16,17,18,19, ein Phänomen, das zu vorübergehenden vaskulären Leckagen führt, als "Bursting"-Durchlässigkeit bekannt, wie in IVI-Studien 5beschrieben. ES hat sich gezeigt, dass TMEM-Makrophagen den Tyrosinkinase-Rezeptor TIE2 ausdrücken, der für die VEGF-vermittelte TMEM-Funktion und das Homing dieser Makrophagen in die perivaskuläre Nische5,20,21 , 22. Neben der Regulierung der Verbreitung und Metastasierung von Krebszellen haben sich TIE2+ Makrophagen als zentrale Regulatoren der Tumorangiogenese21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Als solche stellen TIE2+ Makrophagen einen kritischen Bestandteil der Tumormikroumgebung und den Hauptregulator der metastasierenden Kaskade dar.

Um die TMEM-vermittelte Gefäßdurchlässigkeit (d. h. "Bursting") besser zu konzeptionieren, ist es sehr wichtig, sie von anderen Formen der Vaskulärendurchlässigkeit zu unterscheiden, die nicht mit der Auflösung von endothelialen Zell-Zell-Verbindungen verbunden sind. In einem intakten Endothel (eines, dessen enge und haftende Kreuzungen nicht gestört sind), gibt es drei Haupttypen der vaskulären Durchlässigkeit: a) Pinozytose, die an die Transzytose des aufgenommenen Materials gekoppelt werden kann oder auch nicht; b) Transport von Material durch endotheliale Fenestrae; und c) Transport von Material durch den parazellulären Weg, der durch endotheliale enge Kreuzungen geregelt wird15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Obwohl bei vielen Tumoren dereguliert, wurden die oben genannten Formen der vaskulären Durchlässigkeit meist im Kontext der normalen Gewebephysiologie und Homöostase beschrieben, deren Extreme Gewebe mit entweder begrenzter Durchlässigkeit sind ( z.B. Blut-Hirn-Schranke, Blut-Testis-Schranke) oder reichlich Durchlässigkeit (z.B. fenestrated Kapillaren der Nierenglomerularapparat)34,35,36,37.

Mit Multiphoton intravital Imaging und Multiplexed Immunfluoreszenzmikroskopie sind wir in der Lage, zwischen TMEM-vermittelter vaskulärer Permeabilität ("Bursting") und anderen Formen der vaskulären Permeabilität bei Brusttumoren zu unterscheiden. Um dies zu erreichen, führen wir eine einzige intravenöse Injektion einer hochmolekularen, fluoreszierend markierten Sonde bei Mäusen durch. Spontane Platzereignisse können dann mit intravitaler Bildgebung bei lebenden Mäusen erfasst werden; oder alternativ kann die Extravasation der Sonde durch Co-Lokalisierungsstudien mit Blutvaskulatur (z.B. CD31+ oder Endomucin+) und TMEM-Türen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben beide Techniken, die entweder unabhängig oder in Verbindung miteinander verwendet werden können.

Protokoll

Alle Versuche mit lebenden Tieren müssen in Übereinstimmung mit den Tierschutz- und Pflegerichtlinien und -vorschriften durchgeführt werden. Die in dieser Studie beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften der National Institutes of Health über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und mit Genehmigung der Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use durchgeführt. Ausschuss (IACUC).

1. Bewertung der "Bursting Permeability" mittels Live-Tierbildgebung

  1. Transplantation syngenischer Brusttumoren in Mauswirte mit fluoreszierenden Makrophagen
    1. Generieren Sie Stücke von Tumorgewebe, das für die Transplantation geeignet ist.
      1. Generieren Sie fluoreszierend markierte Tumoren in Maus-Mammary-Krebs-Modellen, indem Sie das spontane, autochthone, gentechnisch veränderte Maus-Mammary-Krebsmodell MMTV-PyMT-Mäuse mit transgenen Mäusen kreuzen, die fluoreszierende Reporter ausdrücken38, 39 [z. B. verbessertes grünes Fluoreszenzprotein (EGFP), verbessertes Cyanfluoreszenzprotein (ECFP) oder Dendra2].
      2. Lassen Sie die MMTV-PyMT-Mäuse mit fluoreszierend markierten Tumoren auf eine Größe von nicht größer als 2 cm (ca. 10-12 Wochen alt) wachsen.
      3. Euthanisieren Sie den Tumor tragenden MMTV-PyMT-Mäusen, indem Sie sie in eine Kammer mit 5% Isofluran bis 30 Sekunden nach dem Ende aller Atmungsuntersuchungen legen.
      4. Führen Sie eine zervikale Dislokation durch.
      5. Entfernen Sie das Haar aus dem Bauch der eingeschläferten Maus mit einer topischen Enthaarungscreme.
      6. Eine Petrischale mit DMEM/F12 Zellkulturmedium auf Eis legen.
      7. Legen Sie die Maus und Petrischale auf Eis in die Dunstabzugshaube.
      8. Den Bauch der Maus mit 70% Ethylalkohol zu sanieren.
      9. Mit sterilen Handschuhen und chirurgischen Werkzeugen (sterilisierte Schere, Zange und Klinge) entfernen Sie die Tumore und legen Sie sie in die Petrischale.
      10. Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke (ca. 2 mm x 2 mm x 2 mm groß) und verwerfen Sie alle nekrotischen Teile, während sie sich in der Petrischale befinden.
    2. Transplantieren Sie die Tumorstücke in Empfängerwirte.
      1. Heben Sie Mäuse mit gentechnisch veränderten fluoreszierend gekennzeichneten Makrophagen an, z. B. MacGreen40 oder MacBlue 41 Mäuse (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. Lassen Sie die FVB-Mäuse mit fluoreszierend markierten Makrophagen auf ein Alter von 4-6 Wochen wachsen).
      3. Anästhetisieren Sie die FVB-Mäuse mit fluoreszierend markierten Makrophagen in einer Kammer mit 5% Isofluran mit Sauerstoff als Trägergas.
      4. Reduzieren Sie die Anästhesie auf 3 % Isofluran und tragen Sie eine ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf, um eine Trocknung zu verhindern.
      5. Entfernen Sie das Haar von über der 4. Brustdrüse der Maus.
      6. Reinigen Sie die Haut mit Betadin. Es ist wichtig, sterile Bedingungen während des Restdes des Verfahrens zu halten. Dazu gehört auch die Verwendung sterilisierter Instrumente und Reagenzien.
      7. Machen Sie einen kleinen Schnitt von 2-3 mm, der der 4. Brustwarze knapp unterlegen ist.
      8. Sezieren, bis das Brustfettpad freigelegt wird.
      9. Nehmen Sie ein Tumorstück aus der Petrischale und beschichten Sie es in künstlicher extrazellulärer Matrix.
      10. Transplantieren Sie Tumore unter dem4. Brustfettpad.
      11. Schließen Sie den Schnitt mit Cyanoacrylat-Klebstoff.
      12. Überwachen Sie das Tier kontinuierlich, bis es sich vollständig von der Anästhesie erholt und in der Lage ist, die Brustbeschisse aufrechtzuerhalten. Auch, nicht das Tier an die Gesellschaft der anderen Tiere bis zur vollständigen Genesung zurück.
      13. Um Infektionen zu minimieren, fügen Sie 1 ml 100 mg/ml Enrofloxacin-Antibiotikum in die Trinkwasserflasche des Tieres (8 fl oz) ein.
      14. Tumoren bis zur Fühlbaren wachsen lassen (ca. 5 mm; 4 Wochen).
      15. Je nach Experiment die Mäuse in Behandlungsgruppen zuordnen und gegebenenfalls die entsprechenden Behandlungen durchführen.
  2. Setup für intravitale Bildgebung
    1. Schalten Sie den Zweiphotonenlaser und die Detektoren des Mikroskops ein.
    2. Schalten Sie die Heizbox ein und heizen Sie die x-y-Stufe des Mikroskops vor.
    3. Platzieren Sie den maßgeschneiderten Bühneneinsatz42 in die x-y-Stufe.
  3. Vorbereitung des Bildgebungsfensters
    1. Autoclavieren Sie vor der Einrichtung für die Bildgebung den maßgeschneiderten kreisförmigen Bildfensterrahmen42.
    2. Verwenden Sie eine Pipette oder eine Insulinspritze, um eine dünne Schicht Cyanoacrylat-Klebstoff am Fensterrahmen zu platzieren und ein 8 mm rundes Deckglas anzubringen.
      HINWEIS: 1) Es ist wichtig, Rückstände an der klaren Öffnung des Deckglases zu vermeiden. 2) Es ist wichtig, das Deckglas mindestens 1 h vor dem Einsatz für die Bildgebung am Fensterrahmen zu befestigen.
    3. Reinigen Sie sorgfältig überschüssiges Cyanoacrylat auf der klaren Öffnung des Deckglases mit einem Labortuch mit einer kleinen Menge Aceton benetzt.
  4. Herstellung von Schwanzvenenkatheter zur Verabreichung von Flüssigkeiten und Fluoreszenzfarbstoffen während der Bildgebung
    1. Schneiden Sie ein 30 cm großes Stück Polyethylenschläuche, um einen Schwanzvenenkatheter zu konstruieren.
    2. Lösen Sie die Nadelportion einer 30 G Nadel aus ihrer Luer-Verjüngung, indem Sie die Nadel sanft hin- und herbiegen, bis sie bricht.
      HINWEIS: Die Nadel sollte in der Nähe der Luer Verjüngung und nicht der Nadelspitze gehalten werden. Dies kann mit einer Zange oder Zange durchgeführt werden, um die Nadel zu greifen, um Nadelstichverletzungen zu verhindern.
    3. Setzen Sie das stumpfe Ende der Nadel in ein Ende des Polyethylenrohres ein.
    4. Setzen Sie das scharfe Ende einer weiteren 30 G Nadel an das gegenüberliegende Ende des Schlauches ein und halten Sie die Luer-Verjüngung.
    5. Füllen Sie eine 1-c-Spritze mit Phosphat gepufferter Saline, befestigen Sie sie an der Luer-Verjüngung des montierten Katheters und spülen Sie den Schwanzvenenkatheter, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im System befinden.
    6. Für die vaskuläre Etikettierung eine 1-c-Ccs-Spritze mit 100 l von 10 mg/kg 155 kDa Dextran-Tetramethylrhodin (TMR) oder Quantenpunkten füllen.
  5. Vorbereitung der Maus für die Bildgebung
    1. Anästhetisieren Sie die Maus in einem Käfig unter (1 Fuß unter) eine Wärmelampe mit 4%-5% Isofluran gemischt mit 100% Sauerstoff auf einen Durchfluss von 1,5-2 L pro min eingestellt.
    2. Schalten Sie die Wärmelampe über den chirurgischen Arbeitsbereich ein. Dieser Schritt ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Körpertemperatur der Maus während der Operation.
    3. Legen Sie die Maus unter die Wärmelampe und senken Sie die Anästhesie für die Dauer der Operation auf 2%-3%.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Wärmelampe in einem sicheren Abstand (1 Fuß) von der Maus zu halten, um eine Überhitzung zu vermeiden.
    4. Legen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus, um das Trocknen der Augen und die Erblindung zu verhindern.
    5. Testen Sie, ob die Maus durch den Zehen-Pinch-Test beästhetisiert ist. Wenn Tier sich zurückzieht, erhöhen Sie die Dosierung von Isofluran um 1% und testen Sie erneut in 1-2 min.
    6. Setzen Sie den Schwanzvenenkatheter in den distalsten Punkt am Schwanz ein.
    7. Befestigen Sie den Schwanzvenenkatheter am Schwanz mit einem kleinen Stück Laborband, das sich um den Schwanz wickelt und an der Nadel klebt, um sicherzustellen, dass er nicht verdrängt wird.
    8. Injizieren Sie 50 l pro h PBS durch den Schwanzvenenkatheter, um eine ausreichende Hydratation zu gewährleisten. Es ist wichtig zu vermeiden, zu viel Flüssigkeit (nicht mehr als 200 L pro h) oder Blasen in den Katheter zu injizieren, da dies für die Maus tödlich sein kann.
    9. Entfernen Sie das Haar auf dem Bauch über die 4. und 5. Brustdrüsen mit Enthaarungscreme.
    10. Reinigen Sie die Haut mit Betadin und lassen Sie die Haut trocknen.
    11. Machen Sie einen Längsmittelschnitt, der sofort den Genitalien überlegen beginnt, und tragen Sie den Schnitt bis zum Niveau des überlegenen Aspekts der 4. Brustdrüse.
    12. Tragen Sie den Schnitt quer zum überlegenen Aspekt der 4. Brustdrüse. Es ist wichtig, die Blutversorgung an dieser Stelle nicht zu gefährden.
    13. Sezieren Sie das Brustfettpad vom Peritoneum und erzeugen Sie eine Gewebeklappe mit sterilen Zangen und Scheren.
      HINWEIS: Die Hautklappen-Bildgebung ist anfällig für signifikante Bewegungsartefakte und Gewebeaustrocknung. Diese werden, wie zuvorbeschrieben 43,44, vermieden, indem ein starres Stück Gummi hinter der Hautseite der Klappe angebracht wird (um das Weichgewebe zu versteifen und es vom Rest des Körpers zu isolieren) und den Tumor dann in eine flache Bildgebung legen. Fenster, um die Hydratation zu erhalten. Dies ist entscheidend für eine stabile Bildgebung, da der Tumor und das umgebende Gewebe in dieser Umgebung sehr konform sind.
    14. Stabilisieren Sie die Hautklappe, indem Sie (mit Cyanoacrylatkleber) ein kleines Stück Hartkautschuk von 2 cm x 2 cm auf der Hautseite der Klappe anbringen. Der Tumor sollte sich in der Mitte des Bereichs befinden, der durch den Gummi stabilisiert wird.
    15. Belichtetes Gewebe mit PBS-Tropfen hydratisiert halten.
    16. Tragen Sie einen kleinen Film aus Cyanoacrylat auf den äußeren Rand des maßgeschneiderten bildgebenden Fensterrahmens auf.
    17. Tragen Sie ein kleines Tröpfchen PBS (ca. 10–20 l) auf die Mitte des Deckglases auf.
    18. Trocknen Sie das umgebende Klappengewebe mit einem Labortuch. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Cyanoacrylat am Fensterrahmen nicht mit dem PBS auf dem Glas in Berührung kommt, da dies dazu führen kann, dass das Cyanoacrylat polymerisiert und vorzeitig eingestellt wird.
    19. Befestigen Sie das kleine bildgebende Fenster an der Gewebeklappe mit dem Tumor in der Mitte der klaren Blende.
    20. Entfernen Sie die Heizbox von der Bühne.
    21. Übertragen Sie die anästhesierte Maus und den Schwanzvenenkatheter auf die Mikroskopstufe. Seien Sie äußerst vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Schwanzvenenkatheter nicht herausfällt.
    22. Platzieren Sie die Maus auf der Bühne in der anfälligen Position.
    23. Legen Sie den Nasenkegel von Isofluran über die Schnarbe, um die Aufrechterhaltung der Anästhesie zu gewährleisten.
    24. Setzen Sie das Fenster in die Bohrung auf der benutzerdefinierten x-y-Bühnenplatte ein.
    25. Stellen Sie die Heizbox wieder auf die Bühne, um eine physiologische Temperatur zu halten.
    26. Überwachen Sie die Vitalzeichen des Tieres, indem Sie eine Pulsoximetersonde über einen Clipsensor an der hinteren Pfote befestigen.
    27. Langsam emittieren Isofluran auf 0,5%-1%, um einen ausreichenden Blutfluss zu erhalten und eine Überästhesisierung der Maus zu vermeiden.
  6. Intravitale Bildgebung
    HINWEIS: Die Bildgebung, die wir in diesem Abschnitt beschreiben, wurde auf einem kundenspezifischen Zweilaser-Multiphotonenmikroskop durchgeführt, das zuvor5,39,45beschrieben wurde. Kurz gesagt, ein Femtosekundenlaser wird verwendet, um 90 femtosekundengepulsiertes Laserlicht zu erzeugen, das bei 880 nm zentriert ist. Fluoreszenzlicht wird mit drei der vier gleichzeitig akquirierenden Detektoren (Blau = 447/60, Grün = 520/65 und Rot 580/60; zentrale Wellenlänge/Bandbreite) nach Trennung vom Anregungslicht durch einen dichroitischen (Chroma, Z720DCXXR) erfasst. Der Mikroskopständer enthält eine 25x, 1,05 NA (numerische Blende) lange Arbeitsweite (2 mm) Objektivlinse. Es ist wichtig zu beachten, dass, während wir ein maßgeschneidertes Mikroskop verwendet haben, das unten beschriebene Protokoll auch auf jedem kommerziell erhältlichen Multiphotonenmikroskop durchgeführt werden kann.
    1. Legen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser zwischen das 25x, 1,05 NA Mikroskop objektiv und das Fenster Abdeckung Glas, um optischen Kontakt zu machen.
    2. Verwenden Sie das Mikroskop-Okular, um sich auf Bereiche mit fluoreszierenden Tumorzellen in der Nähe der Fensteroberfläche zu konzentrieren.
    3. Finden Sie fließende Blutgefäße und beschriftete Makrophagen. Es ist entscheidend, fließende Blutgefäße zu haben, um die Dynamik der Vaskulatur zu beurteilen.
    4. Schalten Sie das Mikroskop in den Multiphotonenmodus.
    5. Stellen Sie die oberen und unteren Grenzwerte einer Z-Serie ein, die ca. 50 m misst.
      1. Legen Sie die obere Grenze der Z-Serie fest, indem Sie den Fokusregler verwenden, um das Objektiv an die gewünschte Startposition zu bewegen, und diese Position als Null innerhalb der Software markieren, indem Sie auf die Taste Z-Position Oben klicken.
      2. Legen Sie die untere Grenze der Z-Serie fest, indem Sie das Objektiv auf die tiefste Schicht verschieben (in der Regel 50-70 m von oben für kleinere Tumoren) und auf die Taste Z-Position Unten klicken.
      3. Stellen Sie die Z-Schritt-Größe auf 5 m fest.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitraffer-Bedienfeld und legen Sie das Zeitintervall zwischen den Erfassungen auf mindestens 10 s fest, um ausreichend Zeit für das Auffüllen des Wassers über der Objektivlinse bereitzustellen. Dies geschieht manuell mit einer Squeeze Pipette auf dem Objektiv während des langen Zeitraffers.
    7. Entfernen Sie die Spritze mit PBS im Schwanzvenenkatheter und ersetzen Sie sie durch eine andere Spritze, die die 155 kDa dextran-TMR (Tetramethylrhodin) enthält.
    8. Injizieren Sie 100 l von 155 kDa dextran-TMR über den Schwanzvenenkatheter.
    9. Ersetzen Sie nach der Injektion die TMR-Spritze durch die PBS-Spritze.
    10. Erwerben Sie eine Z-Stack-Zeitraffer-Bildgebung, indem Sie auf die Schaltflächen Z-Stack und Time-Lapse klicken und dann auf die Aufnahmeschaltfläche klicken.
    11. Injizieren Sie alle 30-45 min 50 l PBS, um eine ausreichende Hydratation des Tieres aufrechtzuerhalten. Vermeiden Sie es, mehr als 200 L zur Zeit zu injizieren, da dies zu einer Flüssigkeitsüberlastung führen kann.
  7. euthanasie
    1. Erhöhen Sie das Isofluran auf 5% und halten Sie das Tier unter 5% Isofluran mit Nasenkegel an Ort und Stelle bis 30 s nach Beendigung der Atmung.
    2. Entfernen Sie die Maus von der Bühne.
    3. Führen Sie zervikale Dislokation durch.
  8. Bildverarbeitung
    1. Laden Sie alle Bilder in ImageJ und formatieren Sie sie in einen 5-dimensionalen Hyperstack (x, y, z, t und Farbkanal).
    2. Trennen Sie die spektrale Überlappung (d.h. GFP und GFP) und eliminieren Sie die x-y Drift von den Hyperstacks mit etablierten Methoden38.
    3. Verwenden Sie die Helligkeits- und Kontrasteinstellung, um den weißen Pegel des Blutkanals zu erhöhen, sodass das Hintergrundsignal sichtbar wird.
    4. Für jede z-Scheibe, sorgfältig inspizieren jeden Film auf Anzeichen von vorübergehenden Vaskulären Leckage (ein "Burst"). Das Ausführen der Filme mit schnellen Bildraten (40 fps) kann diese Identifizierung unterstützen.
    5. Sobald ein Burst identifiziert wurde, kehren Sie die Helligkeit für diesen Kanal auf ein normales Niveau zurück und schneiden Sie den Hyperstack auf diese Region und z-Slice.

2. Auswertung von extravaskulärem Dextran mittels fester Gewebeanalyse

  1. Tumor- und Probenvorbereitung
    HINWEIS: Der zweite Teil dieses Protokolls geht davon aus, dass Brusttumoren aus einem orthotopischen Transplantationsmausmodell des Brustkarzinoms (d. h. des MMTV-PyMT) geerntet wurden. Dieses Modell könnte das gleiche sein wie das im 1. Teil des Protokolls beschriebene, obwohl fluoreszierend markierte Tumoren an dieser Stelle nicht notwendig sind.
    1. Nach Beendigung der experimentellen Pipeline (d. h. arzneimittele Behandlungen usw.) führen Sie eine Schwanz-Eitin-Injektion von 100 l von 10 mg/ml 155 kDa Dextran-Tetramethylrhodamin, 1 h vor dem Opfern der Mäuse durch.
    2. Opfern Sie die Mäuse und ernten Sie die Brusttumoren.
    3. Fix Tumoren in 10% Formalin für 48-72 h und gehen Sie zur Paraffin-Einbettung.
    4. Schneiden Sie mit einem Mikrotome zwei 5 m dicke sequentielle Dias aus dem formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Gewebe. Eine Folie wird zum Färben des Dextrans verwendet, während die andere für die Durchführung von TMEM Triple-IHC verwendet wird, als Referenz.
      HINWEIS: Das TMEM-Protokoll für Dreifach-Immunhistochemie wurde an anderer Stelle beschrieben 10.
  2. IF-Färbung und Scannen für den ersten der beiden sequenziellen Abschnitte
    1. Senden Sie Folien an ein Standardmäßiges Deparaffinisierungsprotokoll. Dazu gehören zwei nachfolgende Eintauchen in Xylol (jeweils 10 min), gefolgt von Dehydrierung in seriell verdünnten Alkohollösungen (100%, 95%, 70% und 50% EtOH in H2O für 2 min pro Tauchzeit).
    2. Antigenrückgewinnung durch Erhitzen (nahe Siedepunkt) der Abschnitte, die 20 min lang in Citrat (pH 6,0-bereinigt) getaucht sind.
    3. Lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur für 15-20 min abkühlen und dann in PBS 3x für 2 min pro Wäsche waschen.
    4. Block für 60-90 min im Sperrpuffer (10% FBS; 1% BSA; 0.0025% Fischhautgelatine; 0,05% PBST, d.h. PBS mit 0,05% Tween-20).
    5. Inkubieren Sie Proben mit einer Mischung aus primären Ratten- und Kaninchenantikörpern, die auf Endomucin bzw. TMR abzielen, und waschen Sie sie dann in PBST 3x, jeweils 2 min.
    6. Inkubieren Sie Proben mit einer Mischung aus sekundären Eselantikörpern gegen Ratten-IgG (konjugiert zu Alexa-647) und Kaninchen-IgG (konjugiert zu Alexa-488), und waschen Sie dann in PBST je 3x 2 min.
    7. Führen Sie eine routinemäßige DAPI-Färbung durch (d. h. Eintauchen in Die DAPI-Lösung für 5-6 min), montieren Sie die Dias mit einem glyzerinfreien "harten" Montagemedium und lagern Sie sie bis zum Scannen an einem dunklen Ort.
    8. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, scannen Sie die Dias auf einem digitalen Gesamtdiascanner.
  3. Bildanalyse
    1. Erfassen Sie 10 High Power Fields (HPFs) pro Gehäuse mit jeder Software, die für digitale Pathologie geeignet ist.
    2. Speichern Sie die Kanäle Endomucin (Rot) und TMR (Grün) separat als TIFF.
    3. Laden Sie die TIFF-Dateien mit ImageJ hoch und konvertieren Sie sie in 8-Bit-Bilder.
    4. Schwellen Sie die 8-Bit-Bilder auf die Ebene der Negativkontrolle, und erzeugen Sie zwei binarisierte Bilder, die die Endomucin und TMR "Masken" zeigen.
    5. Wählen Sie in den Binärwerkzeugen Füllungslöcher auf der Endomucin-Maske aus.
    6. Generieren und speichern Sie die folgenden fünf Interessensgebiete: 1) Das anschwellende Dextran-Bild als "Dextran ROI" (ROI1), 2) das schwellende Endomucin-Bild als "Vascular ROI" (ROI2), 3) das invertierte Endomucin-Bild als "Extravaskulärer ROI" (ROI3), 4) das sich durchschnittene " Extravaskulärer ROI" und "Dextran ROI" Image (ROI1- ROI3) als "Extravascular Dextran ROI" (ROI4) und 5) das gesamte Bild als "Tumor ROI" (ROI5).
    7. Dividieren Sie den ROI4-Bereich durch den ROI5-Bereich und multiplizieren Sie mit 100, um die prozentuale Fläche zu generieren, die der extravaskuläre Dextran im gesamten Tumor abdeckt.
    8. Wiederholen Sie den Vorgang für 10-20 HPFs pro Fall (abhängig von der Gewebeverfügbarkeit) und erzeugen Sie für jeden Fall einen durchschnittlichen extravaskulären Dextran (% Fläche).

Ergebnisse

Die in diesem Protokollartikel beschriebenen experimentellen Verfahren sind kurz zusammengefasst und in Abbildung 1A-Cdargestellt.

Um die TMEM-vermittelte Gefäßdurchlässigkeit ("Bursting Activity") zu messen und experimentelles Rauschen durch andere Formen der Vaskulären durchlässige Permeabilität (d. h. transzellulär und parazellulär, wie in der Einleitung erläutert) zu reduzieren, führten wir intravenöse (i.v.) Injektion von hochmolek...

Diskussion

Hier skizzieren wir zwei Protokolle, die angewendet werden können, um eine bestimmte Art von Gefäßdurchlässigkeit zu visualisieren und zu quantifizieren, die an TMEM-Türen vorhanden ist und mit der Störung von Gefäßdicht- und Haftknoten verbunden ist. Diese Art der vaskulären Permeabilität wird durch den dreigliedrigen TMEM-Zellkomplex transient und kontrolliert, wie oben erläutert5. Die Fähigkeit, die MIT TMEM assoziierte Gefäßdurchlässigkeit zu identifizieren und zu quantifizieren...

Offenlegungen

Die Autoren geben keine Interessenkonflikte preis.

Danksagungen

Wir danken der Analytical Imaging Facility (AIF) des Albert Einstein College of Medicine für die unterstützung der Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 und CA216248), der SIG 1S10OD019961-01, des Gruss-Lipper Biophotonics Center und seines Integrated Imaging Program und der Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant of Surgeons von Montefiore unterstützt. für die Studie der Tumormikroumgebung (CA200561).

GSK schrieb das Manuskript mit, führte Bildgebung für Abbildung 1C und 3B durch, entwickelte ein Protokoll zur Analyse fester Gewebe und analysierte und interpretierte alle Daten; JMP schrieb das Manuskript mit und führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 1B,2C und 3A durch; LB & AC führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2B durch; RJ führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2A durch; JSC schrieb das Manuskript mit und analysierte und interpretierte alle Daten; MHO schrieb das Manuskript mit und analysierte und interpretierte alle Daten; und DE führte die Operation und intravitale Bildgebung für Abbildung 2D durch, schrieb das Manuskript mit, entwickelte feste Gewebeanalyse und intravitale Bildgebungsprotokolle und analysierte und interpretierte alle Daten.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CitrateEng Scientific Inc9770
Cover Glass SlipsElectron Microscopy Sciences72296-08
Cyanoacrylate AdhesiveHenkel Adhesive1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dextran-Tetramethyl-RhodamineSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucin (primary antibody)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloxacinBayer84753076 v-06/2015
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442
Fish Skin GelatinFisher ScientificG7765
Insulin SyringeBecton Dickinson309659
IsofluoraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Artificial extracellular matrix
Needle (30 G)Becton Dickinson305128
Phosphate Buffered SalineLife Technologies CorporationPBS
Polyethylene TubingScientific Commodities IncBB31695-PE/1
Pulse OximeterKent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (primary antibody)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

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