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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo due metodi per valutare la permeabilità vascolare transitoria associata al microambiente tumorale della funzione di metastasi (TMEM) e all'intravasazione delle cellule tumorali utilizzando l'iniezione endovenosa di peso molecolare elevato (155 kDa) dextran nei topi. I metodi includono l'imaging intravitale in animali vivi e l'analisi dei tessuti fissi utilizzando l'immunofluorescenza.

Abstract

La causa più comune della mortalità correlata al cancro è la metastasi, un processo che richiede la diffusione delle cellule tumorali dal tumore primario ai siti secondari. Recentemente, abbiamo stabilito che la diffusione delle cellule tumorali nel cancro mammario primario e nei siti metastatici nel polmone si verifica solo nelle porte chiamate Microambiente tumorale di Metastasi (TMEM). Il numero di porta TMEM è prognostico per una recidiva a distanza di malattia metastatica nei pazienti affetti da cancro al seno. Le porte del TMEM sono composte da una cellula tumorale che esprime eccessivamente la proteina regolatore di actina Mena a diretto contatto con un macrofago perivascolare e proangiogenico che esprime alti livelli di TIE2 e VEGF, dove entrambe le cellule sono strettamente legate a un sangue cellula endoteliale della nave. Le cellule tumorali possono invadere attraverso le porte TMEM a causa della permeabilità vascolare transitoria orchestrata dall'attività congiunta del macrofagio associato al TMEM e della cellula tumorale che esprime Mena associata al TMEM. In questo manoscritto vengono descritti due metodi per la valutazione della permeabilità vascolare transitoria mediata tramite TMEM: l'imaging intravitale e l'immunofluorescenza dei tessuti fissi. Anche se entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e svantaggi, la combinazione dei due può fornire le analisi più complete della permeabilità vascolare mediata da TMEM e dei prerequisiti microambientali per la funzione TMEM. Poiché il processo metastatico nel cancro al seno, e possibilmente altri tipi di cancro, coinvolge la diffusione delle cellule tumorali attraverso porte TMEM, è essenziale impiegare metodi ben consolidati per l'analisi dell'attività delle porte TMEM. I due metodi qui descritti forniscono un approccio globale all'analisi dell'attività della porta TMEM, sia in animali ingenui che farmacologicamente trattati, il che è di fondamentale importanza per le sperimentazioni precliniche di agenti che prevengono le cellule tumorali diffusione tramite TMEM.

Introduzione

I recenti progressi nella nostra comprensione della metastasi tumorale hanno scoperto che la transizione epiteliale-mesenchy (EMT) e l'induzione di una sottopopolazione di cellule tumorali migratorie/invasive non sono, di per sé, sufficienti per la diffusione ematogena 1. Infatti, in precedenza si pensava che metastasizzare le cellule tumorali intravasi attraverso l'intero endotelio associato al cancro, poiché la neovasculatura tumorale è spesso caratterizzata da una bassa copertura pericita, e come tale, è altamente permeabile e instabile2,3,4. Anche se altamente suggestivo di funzioni difettose all'interno del tumore, le modifiche vascolari durante la carcinogenesi non forniscono la prova di per sé che le cellule tumorali possono penetrare i vasi sanguigni facilmente e in modo incontrollato. Gli studi sull'imaging intravitale (IVI), in cui le cellule tumorali sono etichettate fluorescenti e la vascoliera è etichettata tramite l'iniezione endovenosa di sonde fluorescenti (come dextran o punti quantici), mostrano che, mentre i vasi tumorali sono uniformemente permeabile a basso peso molecolare dextrans (ad es. 70 kD), dextrans ad alto peso molecolare (155 kD) e le cellule tumorali possono attraversare l'endotelio solo in siti specializzati di intravasazione che sono preferibilmente situati al punto di diramazione vascolare5, 6 È possibile: , 7.Le analisi immunoistochimiche (IHC) utilizzando modelli animali e materiale di origine del paziente umano hanno dimostrato che questi siti sono "porte" specializzate nella regolazione della permeabilità vascolare, localmente e transitoriamente, fornendo una breve finestra di l'opportunità per le cellule tumorali migratorie/invasive di entrare nella circolazione. Queste porte sono chiamate "Microambiente tumorale di Metastasi" o "TMEM" e, molto a quanto pare, la loro densità è correlata a un aumento del rischio di sviluppare malattie metastatiche nei pazienti con cancro al seno8,9, 10.

Ogni porta TMEM è costituita da tre tipi distinti di cellule: un macrofago perivascolare, una cellula tumorale che sovraesprime il mammifero proteico actin-regulatory abilitato (Mena) e una cellula endoteliale, il tutto in contatto fisico diretto tra loro1, 5,9,10,11,12,13. L'evento chiave per la funzione del TMEM come porta d'intravasamento è il rilascio localizzato del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sulla nave sottostante dal macrofaage perivascolare14. VEGF può interrompere le giunzioni omotipiche tra le cellule endoteliali15,16,17,18,19, un fenomeno che si traduce in perdite vascolari transitorie, anche noto come "bursting" permeabilità come descritto negli studi IVI 5. I macrofagi TMEM hanno dimostrato di esprimere il recettore della chinasi tirosina TIE2, che è necessario per la funzione TMEM mediata dal VEGF e l'homing di questi macrofagi alla nicchia perivascolare5,20,21 , 22.Oltre a regolare la diffusione e la metastasi delle cellule tumorali, è stato dimostrato che i macrofagi TIE2sono stati regolatori centrali dell'angiogenesi tumorale21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Come tale, i macrofagi TIE2 rappresentano un costituente critico del microambiente tumorale e il principale regolatore della cascata metastatica.

Per concettualizzare meglio la permeabilità vascolare mediata da TMEM (cioè "bursting"), è molto importante distinguerla da altre modalità di permeabilità vascolare che non sono associate alla dissoluzione delle giunzioni endoteliali cellula-cellula. In un endotelio intatto (uno le cui giunzioni strette e aderenti non sono interrotte), ci sono tre tipi principali di permeabilità vascolare: (a) pinocytosi, che può, o non può, essere accoppiato alla transcitosi del materiale ingerito; b) trasporto di materiale attraverso fenestrae endoteliali; e (c) trasporto di materiale attraverso il percorso paracellulare, che è regolato da giunzioni strette endote15,16,17,18,19,32 , 33 Mi lasa , 34.Sebbene deregolamentati in molti tumori, i suddetti modi di permeabilità vascolare sono stati descritti principalmente nel contesto della normale fisiologia tissutale e dell'omeostasi, i cui estremi sono tessuti con permeabilità limitata ( ad esempio, barriera emato-encefalica, barriera emato-prova), o abbondante permeabilità (ad esempio, capillari fenestrated dell'apparato glomerare renale)34,35,36,37.

Utilizzando l'imaging intravitale multifotone e la microscopia a immunofluorescenza multiplexata, siamo in grado di distinguere tra permeabilità vascolare mediata da TMEM ("bursting") e altre modalità di permeabilità vascolare nei tumori al seno. Per raggiungere questo obiettivo, eseguiamo una singola iniezione endovenosa di una sonda ad alto peso molecolare, con etichetta fluorescente nei topi. Gli eventi di scoppio spontaneo possono quindi essere catturati utilizzando l'imaging intravitale nei topi vivi; o, in alternativa, l'stravaganza della sonda può essere quantificata mediante studi di co-localizzazione convascolarizzazione del sangue (ad es. porte CD31 o Endomucin ) e TMEM utilizzando la microscopia a immunofluorescenza. I protocolli qui presentati descrivono entrambe queste tecniche, che potrebbero essere utilizzate in modo indipendente o in combinazione tra loro.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che utilizzano animali vivi devono essere condotti in conformità con le linee guida e le normative sull'uso degli animali e per la cura. Le procedure descritte in questo studio sono state eseguite in conformità con le normative nazionali di salute riguardanti la cura e l'uso di animali sperimentali e con l'approvazione dell'Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use (IACUC).

1. Valutazione della "permeabilità" utilizzando l'imaging animale vivo

  1. Trapianto di tumori sinogenici al seno in host di topi con macrofagi fluorescenti
    1. Generare pezzi di tessuto tumorale adatti per il trapianto.
      1. Generare tumori fluorescenti in modelli di cancro mammario dei topi incrociando i spontanei, autoctonosi, modello di cancro della mamma geneticamente ingegnerizzata MMTV-PyMT topi con topi transgenici che esprimono reporter fluorescenti38, 39 [ad esempio, proteina fluorescente verde potenziata (EGFP), proteina fluorescente ciana learizza migliorata (ECFP) o Dendra2].
      2. Lasciare che i topi MMTV-PyMT con tumori fluorescenti etichettati crescano fino a una dimensione non superiore a 2 cm (circa 10-12 settimane di età).
      3. Eutanasia il tumore recante topi MMTV-PyMT mettendoli in una camera con 5% isoflurane fino a 30 secondi dopo tutte le respirazioni si fermano.
      4. Eseguire una lussazione cervicale.
      5. Rimuovere i capelli dall'addome del topo eutanasia utilizzando una crema depilatoria topica.
      6. Posizionare un piatto Petri con un mezzo di coltura cellulare DMEM/F12 sul ghiaccio.
      7. Posizionare il mouse e il piatto Petri sul ghiaccio nella cappa dei fumi.
      8. Sanificare l'addome del topo con il 70% di alcool etilico.
      9. Utilizzando guanti sterili e strumenti chirurgici (forbici sterilizzate, pinze e lama) rimuovere i tumori e metterli nel piatto Petri.
      10. Tagliare il tumore a pezzettini (2 mm x 2 mm x 2 mm), scartando tutte le porzioni necrotiche, mentre sono nel piatto Petri.
    2. Trapianto i pezzi di tumore in host ricandanti.
      1. Sollevare i topi con macrofagi geneticamente progettati con etichettafluere, ad esempio i topi MacGreen40 o MacBlue 41 (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. Lasciare che i topi FVB con macrofagi etichettati fluorescentmente crescano fino a un'età di 4-6 settimane).
      3. Anestesizzai i topi FVB con macrofagi fluorescenti etichettati in una camera utilizzando il 5% di isoflurane con ossigeno come gas trasportatore.
      4. Riduci l'anestesia al 3% di isoflurane e applica unguento oftalmico agli occhi del topo per evitare l'essiccazione.
      5. Rimuovere i capelli da sopra la ghiandola mammaria 4th del mouse.
      6. Pulire la pelle con betadine. È importante mantenere condizioni sterili per tutto il resto della procedura. Ciò include l'utilizzo di strumenti sterilizzati e reagenti.
      7. Fare una piccola incisione 2-3 mm appena inferiore al 4th capezzolo.
      8. Disseta fino a quando il cuscinetto di grasso mammario è esposto.
      9. Prendi un pezzo di tumore dalla parabola Petri e cappotto in matrice extracellulare artificiale.
      10. Tumori trapiantati sotto il cuscinetto di grasso mammario 4 th.
      11. Chiudere l'incisione con adesivo cianoacrilato.
      12. Monitorare continuamente l'animale fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia ed è in grado di mantenere la recumbency sternale. Inoltre, non riportare l'animale alla compagnia di altri animali fino al pieno recupero.
      13. Per ridurre al minimo le infezioni, aggiungere 1 mL di 100 mg/mL di enrofloxacin antibiotico alla bottiglia di acqua potabile dell'animale (8 fl oz).
      14. Permettere ai tumori di crescere fino palpabile (5 mm; 4 settimane).
      15. A seconda dell'esperimento, allocare i topi in gruppi di trattamento ed eseguire i trattamenti corrispondenti, se applicabile.
  2. Configurazione per l'imaging intravitale
    1. Accendi il laser e i rilevatori a due fotoni del microscopio.
    2. Accendere la scatola di riscaldamento e preriscaldare lo stadio x-y del microscopio.
    3. Posizionare l'inserto dello stage su misura42 nello stage x-y.
  3. Preparazione della finestra di imaging
    1. Prima di eseguire la configurazione per la creazione di immagini, autoclave la cornice42della finestra di imaging circolare su misura.
    2. Utilizzare una pipetta o una siringa di insulina per posizionare un sottile strato di adesivo cianoacrilato al telaio della finestra e all'affisso in posizione un vetro di copertura circolare di 8 mm.
      NOTA: 1) È importante evitare di ottenere residui sull'apertura chiara del vetro di copertura. 2) È importante aderire il vetro di copertura al telaio della finestra almeno 1 h prima dell'uso per l'imaging.
    3. Pulire con attenzione l'eccesso di cianoacrilato sulla chiara apertura del vetro di copertura utilizzando una salvietta da laboratorio bagnata con una piccola quantità di acetone.
  4. Preparazione del catetere della vena della coda per la somministrazione di fluidi e coloranti fluorescenti durante l'imaging
    1. Tagliare un pezzo di tubo di polietilene di 30 cm per costruire un catetere della vena della coda.
    2. Staccare la porzione dell'ago di un ago da 30 G dal suo cono Luer piegando delicatamente l'ago avanti e indietro fino a rompersi.
      NOTA: L'ago deve essere tenuto vicino al cono Luer e non alla punta dell'ago. Questo può essere eseguito con pinze o pinze per afferrare l'ago al fine di prevenire la lesione del bastone dell'ago.
    3. Inserire l'estremità smussata dell'ago in un'estremità del tubo in polietilene.
    4. Inserire l'estremità affilata di un altro ago da 30 G, mantenendo il suo cono Luer attaccato, all'estremità opposta del tubo.
    5. Riempire una siringa da 1 cc con una salina tamponata di fosfato, collegarla al cono Luer del catetere assemblato e lavare il catetere della vena posteriore assicurandosi che non ci siano bolle d'aria nel sistema.
    6. Per l'etichettatura vascolare, riempire una siringa da 1 cc con 100 litri da 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) o punti quantici.
  5. Preparazione del mouse per l'imaging
    1. Anestesizzail topo in una gabbia sotto (1 piede sotto) una lampada termica utilizzando il 4%-5% di isoflurane mescolato con il 100% di ossigeno impostato su un flusso di 1,5-2 L al min.
    2. Accendere la lampada termica sull'area di lavoro chirurgica. Questo passaggio è fondamentale per mantenere la temperatura corporea fisiologica del topo durante l'intervento chirurgico.
    3. Posizionare il mouse sotto la lampada termica e abbassare l'anestesia al 2%-3% per tutta la durata dell'intervento.
      NOTA: Assicurarsi di tenere la lampada termica a distanza di sicurezza (1 piede) lontano dal mouse per evitare il surriscaldamento.
    4. Posizionare unguento oftalmico sugli occhi del mouse per evitare l'essiccazione degli occhi e la cecità.
    5. Verificare che il mouse sia anetizzato eseguendo il test del ditadei alla toe. Se l'animale si ritira, aumentare il dosaggio di isoflurane dell'1% e riprovare in 1-2 min.
    6. Inserire il catetere della vena posteriore nel punto più disfatto possibile sulla coda.
    7. Apporre il catetere della vena posteriore alla coda con un piccolo pezzo di nastro da laboratorio che avvolge intorno alla coda e si attacca all'ago per assicurare che non venga sloggiato.
    8. Iniettare 50 L per h di PBS attraverso il catetere della vena posteriore per fornire un'adeguata idratazione. È fondamentale evitare di iniettare troppo fluido (non più di 200 l per h) o di eventuali bolle nel catetere in quanto questo può essere fatale per il mouse.
    9. Rimuovere i capelli sull'addome sopra le ghiandole mammarie 4th e 5th con crema depilatoria.
    10. Pulire la pelle con betadine e lasciare asciugare la pelle.
    11. Fare un'incisione longitudinale della linea mediana partendo immediatamente superiore ai genitali e portare l'incisione fino al livello dell'aspetto superiore della ghiandola mammaria 4th.
    12. Portare l'incisione trasversale all'aspetto superiore della ghiandola mammaria 4th. È fondamentale evitare di compromettere l'afflusso di sangue a questo punto.
    13. Dissezionare il tampone di grasso mammario dal peritoneo creando un lembo di tessuto utilizzando pinze sterili e forbici.
      NOTA: l'imaging del lembo della pelle è suscettibile a significativi artefatti di movimento e disidratazione dei tessuti. Questi sono evitati, come descritto in precedenza43,44, da apposto un pezzo rigido di gomma dietro al lato della pelle del lembo (per irrigidire il tessuto molle e isolarlo dal resto del corpo) e quindi mettendo il tumore in un imaging superficiale per preservare l'idratazione. Questo è fondamentale per l'imaging stabile come il tumore e tessuto circostante in questo ambiente sono molto conformi.
    14. Stabilizzare il lembo della pelle apponendo (con colla cianoacrilata) un piccolo pezzo di gomma rigida che misura 2 cm x 2 cm sul lato della pelle del lembo. Il tumore dovrebbe essere al centro dell'area in fase di stabilizzazione dalla gomma.
    15. Mantenere i tessuti esposti idratati con gocce di PBS.
    16. Applicare una piccola pellicola di cianoacrilato sul bordo esterno del telaio della finestra di imaging su misura.
    17. Applicare una piccola goccia di PBS (10-20 dollari) al centro del vetro di copertura.
    18. Asciugare il tessuto lembo circostante con una salvietta di laboratorio. È fondamentale assicurarsi che il cianoacrilato sul telaio della finestra non entri in contatto con il PBS sul vetro, in quanto ciò può causare il cianoapplicando al polimerizzare e impostare prematuramente.
    19. Apporre la piccola finestra di imaging al lembo del tessuto con il tumore al centro dell'apertura chiara.
    20. Rimuovere la scatola di riscaldamento dallo stage.
    21. Trasferire il catetere della vena del topo e della coda a cui è anpitizzato allo stadio del microscopio. Prestare estrema cautela per garantire che il catetere della vena della coda non cada.
    22. Posizionare il mouse sullo stage nella posizione prona.
    23. Posizionare il cono naso di isoflurane sopra il muso per garantire il mantenimento dell'anestesia.
    24. Inserire la finestra nel foro sulla piastra personalizzata x-y.
    25. Riposizionare la scatola di riscaldamento sullo stage per mantenere una temperatura fisiologica.
    26. Monitora i segni vitali dell'animale collegando una sonda ossimetrica a impulsi tramite sensore di clip alla zampa posteriore.
    27. Lentamente diminuire isoflurane a 0.5%-1% per mantenere un adeguato flusso sanguigno ed evitare oltre l'anestesizzazione del mouse.
  6. Immagini intravitali
    NOTA: L'imaging che descriviamo in questa sezione è stato eseguito su un microscopio multifotoino a due laser personalizzato, precedentemente descritto5,39,45. In breve, un laser a femtosecondi viene utilizzato per generare 90 luce laser pulsata a femtosecondo centrata a 880 nm. La luce della fluorescenza viene rilevata con tre dei quattro rilevatori che acquisiscono simultaneamente (Blu - 447/60, Verde 520/65 e Rosso 580/60; lunghezza d'onda/larghezza di banda centrale) dopo la separazione dalla luce di eccitazione da parte di un dichroico (Chroma, 720DCXXR). Il supporto per il microscopio contiene una lente obiettivo da 25x, 1,05 NA (apertura numerica) a lunga distanza di lavoro (2 mm). È importante notare che, mentre abbiamo usato un microscopio personalizzato, il protocollo descritto di seguito può essere realizzato anche su qualsiasi microscopio multifoton disponibile in commercio.
    1. Posizionare una goccia di acqua distillata tra l'obiettivo del microscopio 25x, 1,05 NA e il vetro di copertura della finestra per effettuare un contatto ottico.
    2. Utilizzare l'oculare al microscopio per mettere a fuoco le aree con cellule tumorali fluorescenti vicino alla superficie della finestra.
    3. Trova vasi sanguigni che scorrono ed etichettati macrofagi. È fondamentale avere vasi sanguigni che scorrono per valutare la dinamica della vascolatura.
    4. Cambia il microscopio in modalità multifotone.
    5. Impostare i limiti superiore e inferiore di una serie z, che misura circa 50 m.
      1. Impostare il limite superiore della serie z utilizzando il regolatore di messa a fuoco per spostare l'obiettivo nella posizione di partenza desiderata, nella posizione più superficiale, e contrassegnando questa posizione come zero all'interno del software facendo clic sul pulsante In alto della posizione.
      2. Impostare il limite inferiore della serie z spostando l'obiettivo verso lo strato più profondo (in genere 50-70 m dall'alto per i tumori più piccoli) e facendo clic sul pulsante In basso della posizione di posizione.
      3. Impostare la dimensione del passo z su 5 m.
    6. Fare clic sul pulsante del pannello Time-Lapse e impostare l'intervallo di tempo tra le acquisizioni ad almeno 10 s per fornire un tempo adeguato per ricostituire l'acqua sopra l'obiettivo. Questo viene fatto manualmente con una pipetta di compressione sull'obiettivo durante il lungo lasso di tempo.
    7. Rimuovere la siringa con PBS nel catetere della vena posteriore e sostituirla con un'altra siringa contenente il 155 kDa dextran-TMR (rhodamina tetrametile).
    8. Iniettare 100 luna di 155 kDa dextran-TMR attraverso la vena posteriore.
    9. Dopo l'iniezione, sostituire la siringa TMR con la siringa PBS.
    10. Acquisire un'immagine time-lapse z-stack facendo clic sui pulsanti z-Stack e Time-Lapse, quindi facendo clic sul pulsante di registrazione.
    11. Iniettare 50 l di PBS ogni 30-45 min per mantenere un'adeguata idratazione dell'animale. Evitare di iniettare più di 200 l al momento in quanto ciò può causare sovraccarico di liquidi.
  7. eutanasia
    1. Aumentare l'isoflurane al 5% e mantenere l'animale al di sotto del 5% dell'isoflurane con il cono naso in posizione fino a 30 s dopo che le respirazioni cessano.
    2. Rimuovere il mouse dallo stage.
    3. Eseguire lussazione cervicale.
  8. Elaborazione delle immagini
    1. Caricare tutte le immagini in ImageJ e formattarle in un hyperstack bidimensionale (x, y, z, t e canale di colore).
    2. Eseguire la separazione della sovrapposizione spettrale (ad esempio: GFP e CFP) e l'eliminazione della deriva x-y dagli iperstack utilizzando i metodi stabiliti38.
    3. Utilizzare la regolazione della luminosità e del contrasto per aumentare il livello bianco del canale sanguigno in modo che il segnale di sfondo diventi visibile.
    4. Per ogni fetta z, ispezionare attentamente ogni film per i segni di perdita vascolare transitoria (una "burst"). L'esecuzione dei filmati a frame rate veloce (40 fps) può aiutare questa identificazione.
    5. Una volta identificato un burst, riportare la luminosità di questo canale a un livello normale e ritagliare l'iperpilato in questa regione e z-slice.

2. Valutazione del dextran extravascolare mediante l'analisi dei tessuti fissi

  1. Preparazione del tumore e del campione
    NOTA: La seconda parte di questo protocollo presuppone che i tumori al seno siano stati raccolti da un modello di topo di trapianto ortotopico di carcinoma mammario (cioè il MMTV-PyMT). Questo modello potrebbe essere lo stesso descritto nella parte 1st del protocollo, anche se i tumori fluorescenti non sono necessari a questo punto.
    1. Dopo la cessazione della conduttura sperimentale (cioè trattamenti farmacologici, ecc.), eseguire un'iniezione di coda-vain di 100 - L di 10 mg/mL 155 kDa dextran-tetramethyl rhodamine, 1 h prima di sacrificare i topi.
    2. Sacrificare i topi e raccogliere i tumori al seno.
    3. Fissare i tumori in formalina 10% per 48-72 h e procedere all'incorporamento della paraffina.
    4. Utilizzando un microtome, tagliare due vetrini sequenziali spessi 5 m dai tessuti incorporati in paraffina (FFPE) fissi in formalina. Una diapositiva viene utilizzata per colorare il dextran, mentre l'altra verrà utilizzata per eseguire Il triplo IHC TMEM, come riferimento.
      NOTA: Il protocollo TMEM triplo immunohistochimico è stato descritto altrove 10.
  2. IF colorazione e scansione per la prima delle due sezioni sequenziali
    1. Inviare le diapositive a un protocollo di de-paraffinazione standard. Questo include due immersioni successive nello xilene (10 min ciascuno), seguite dalla disidratazione nelle soluzioni alcoliche diluite in serie (100%, 95%, 70% e 50% EtOH in H2O per 2 min ogni immersione).
    2. Eseguire il recupero dell'antigene riscaldando (vicino al punto di ebollizione) le sezioni sommerse nel citrato (pH 6.0-regolato) per 20 min.
    3. Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 15-20 min e poi lavare in PBS 3x per 2 min ogni lavaggio.
    4. Blocco per 60-90 min nel buffer di blocco (10% FBS; 1% BSA; 0.0025% gelatina di pelle di pesce; 0.05% PBST, vale a dire PBS con 0.05% Tween-20).
    5. Incubare campioni con una miscela di anticorpi primari di ratto e coniglio che colpiscono endomucina e TMR, rispettivamente, e poi lavare in PBST 3x, 2 min ciascuno.
    6. Incubare campioni con una miscela di anticorpi secondari dell'asino contro ratto IgG (coniugato ad Alexa-647) e coniglio IgG (coniugato ad Alexa-488), quindi lavare in PBST 3x 2 min ciascuno.
    7. Eseguire una colorazione DAPI di routine (cioè immersione nella soluzione DAPI per 5-6 min), montare i vetrini utilizzando un supporto di montaggio "duro" senza glicerolo e conservare in un luogo buio fino alla scansione.
    8. Per ottenere risultati ottimali, eseguire la scansione delle diapositive su uno scanner digitale per diapositive intero.
  3. Analisi dell'immagine
    1. Cattura 10 campi ad alta potenza (HPF) per caso, utilizzando qualsiasi software adatto per la patologia digitale.
    2. Salvare i canali Endomucin (rosso) e TMR (verde) separatamente come TIFF.
    3. Utilizzando ImageJ, caricare i file TIFF e convertirli in immagini a 8 bit.
    4. Soglia le immagini a 8 bit al livello del controllo negativo e genera due immagini binarizzate, mostrando le "maschere" Endomucin e TMR.
    5. Dagli strumenti binari, selezionare Fori di riempimento sulla maschera Endomucina.
    6. Generare e salvare le seguenti cinque aree di interesse: 1) L'immagine dextran con soglia come "Dextran ROI" (ROI1), 2) l'immagine endomucina con soglia come "ROI vascolare" (ROI2), 3) l'immagine endomcina invertita come "ROI extravascolare" (ROI3), 4) l'intersezione " ROI extravascolare" e "ROI Dextran" (ROI1 e ROI3) come "ROI Dextran extravascolare" (ROI4) e 5) l'intera immagine come "ROI tumorale" (ROI5).
    7. Dividere l'area ROI4 per l'area ROI5 e moltiplicare per 100 per generare l'area percentuale che il dextran extravascolare copre nell'intero tumore.
    8. Ripetere il processo per 10-20 HPF per caso (a seconda della disponibilità dei tessuti) e generare un Dextran extravascolare medio (% area) per ogni caso.

Risultati

Le procedure sperimentali descritte in questo articolo di protocollo sono brevemente riassunte e illustrate nella Figura 1A-C.

Per misurare la permeabilità vascolare mediata da TMEM ("attività di scoppio") e ridurre il rumore sperimentale da altri modi di permeabilità vascolare (cioè transcellulare e paracellulare, come spiegato nell'introduzione), abbiamo eseguito permeno (i.v.) iniezione di sonde ad alto peso molecolare, come 155 kDa Dextran...

Discussione

Qui, dedichiamo due protocolli che possono essere applicati per visualizzare e quantificare un tipo specifico di permeabilità vascolare che è presente alle porte TMEM ed è associato all'interruzione della stretta vascolare e aderisce giunzioni. Questo tipo di permeabilità vascolare è transitoria e controllata dal complesso cellulare TMEM tripartito, come spiegato sopra5. La capacità di identificare e quantificare la permeabilità vascolare associata al TMEM è fondamentale per la valutazione...

Divulgazioni

Gli autori non rivelano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Ringraziamo l'Analytical Imaging Facility (AIF) dell'Albert Einstein College of Medicine per il supporto dell'imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 e CA216248), il SIG 1S10OD019961-01, il Gruss-Lipper Biophotonics Center e il suo programma Integrated Imaging, e Ruth L. Kirschstein T32 per lo studio del microambiente tumorale (CA200561).

GSK ha co-scritto il manoscritto, ha eseguito l'imaging per le figure 1C e 3B, ha sviluppato un protocollo di analisi dei tessuti fissi e ha analizzato e interpretato tutti i dati; JMP ha co-scritto il manoscritto, ed eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 1B,2C e 3A; LB & AC ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la figura 2B; RJ ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 2A; JSC co-scrisse il manoscritto e analizzò e interpretò tutti i dati; MHO ha co-scritto il manoscritto e analizzato e interpretato tutti i dati; e DE ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 2D, ha co-scritto il manoscritto, sviluppato l'analisi dei tessuti fissi e protocolli di imaging intravitale e analizzato e interpretato tutti i dati.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CitrateEng Scientific Inc9770
Cover Glass SlipsElectron Microscopy Sciences72296-08
Cyanoacrylate AdhesiveHenkel Adhesive1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dextran-Tetramethyl-RhodamineSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucin (primary antibody)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloxacinBayer84753076 v-06/2015
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442
Fish Skin GelatinFisher ScientificG7765
Insulin SyringeBecton Dickinson309659
IsofluoraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Artificial extracellular matrix
Needle (30 G)Becton Dickinson305128
Phosphate Buffered SalineLife Technologies CorporationPBS
Polyethylene TubingScientific Commodities IncBB31695-PE/1
Pulse OximeterKent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (primary antibody)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

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