Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Мы описываем два метода оценки преходящей сосудистой проницаемости, связанной с микроокружением опухоли метастазов (TMEM) функции дверного проема и интравацией раковых клеток с использованием внутривенной инъекции высокомолекулярного веса (155 кДа) декентна у мышей. Методы включают интравитальная визуализация у живых животных и анализ фиксированной ткани с использованием иммунофлюоресценции.
Наиболее распространенной причиной смертности, связанной с раком, является метастаз, процесс, который требует распространения раковых клеток от первичной опухоли до вторичных участков. Недавно мы установили, что распространение раковых клеток в первичном раке молочной железы и в метастатических участках в легких происходит только в дверях называется Опухолевая микроокружающая среда метастазов (TMEM). Номер дверного проема TMEM является прогностичным для отдаленного рецидива метастатических заболеваний у больных раком молочной железы. TMEM дверные проемы состоят из раковой клетки, которая чрезмерно выражает актин регуляторного белка Mena в прямом контакте с периваскулярным, проангиогенным макрофагом, который выражает высокий уровень TIE2 и VEGF, где обе эти клетки плотно связаны с кровью сосуд эндотелиальной клетки. Раковые клетки могут интравироваться через дверные проемы TMEM из-за преходящей сосудистой проницаемости, организованной совместной деятельностью ассоциированного макрофага TMEM и тМЭм-ассоциированной раковой клетки Mena. В этой рукописи мы описываем два метода оценки преходящей проницаемости ТМЭм: интравитальная визуализация и иммунофлуоресценция фиксированной ткани. Хотя оба метода имеют свои преимущества и недостатки, объединение этих двух методов может обеспечить наиболее полный анализ проницаемости сосудов, опосредованных ТМЭМ, а также микроэкологических предпосылок для функции ТМЭм. Поскольку метастатический процесс при раке молочной железы, и, возможно, другие виды рака, включает в себя распространение раковых клеток через tMEM дверные проемы, важно использовать хорошо зарекомендовавшие себя методы для анализа TMEM дверной проем деятельности. Два описанных здесь метода обеспечивают комплексный подход к анализу активности дверных проемов TMEM, как у наивных, так и в фармакологически обработанных животных, что имеет первостепенное значение для доклинических испытаний агентов, предотвращающих раковые клетки распространения через TMEM.
Недавние достижения в нашем понимании метастазов рака обнаружили, что эпителиальный переход к мезенхимальному переходу (ЭМТ) и индукции мигрирующих/инвазивных субпопуляций раковых клеток сами по себе не являются достаточными для распространения гематогенов 1. Действительно, ранее считалось, что метастазирующие раковые клетки интравируются через всю всю вызванное раком эндотелия, так как неваскулярность опухоли часто характеризуется низким охватом перицитов, и как таковой, очень проницаема и нестабильный2,3,4. Хотя очень наводящий дефектных функций в опухоли, сосудистые изменения во время канцерогенеза не дают доказательств как таковых, что опухолевые клетки могут проникать кровеносные сосуды легко и неконтролируемым образом. Исследования интражизненной визуализации (IVI), в которых опухолевые клетки флуоресцентно помечены и сосуды помечены через внутривенную инъекцию флуоресцентных зондов (таких как декренилий или квантовые точки), показывают, что, в то время как опухолевые сосуды равномерно проницаемый до низкого молекулярного веса декстранс (например, 70 кД), высокомолекулярный вес декстранс (155 кД) и опухолевые клетки могут пересекать эндотелий только на специализированных участках интравазации, которые преимущественно расположены в сосудистой точке5, 6 , 7. Иммуногистохимический (IHC) анализы с использованием моделей животных и человеческого человека, полученных материал омичи показали, что эти сайты являются "дверные проемы", которые специализируются на регулировании проницаемости сосудов, локально и преходяще, обеспечивая краткое окно возможность для мигрирующих/инвазивных раковых клеток для входа в кровообращение. Эти дверные проемы называются "Tumor Microenvironment of Metastasis" или "TMEM", и, вполне ожидаемо, их плотность коррелирует с повышенным риском развития метастатического заболевания у больных раком молочной железы8,9, 10.
Каждый дверной проем TMEM состоит из трех различных типов клеток: периваскулярный макрофаг, опухолевые клетки, чрезмерно выражающие актин-регуляторный белок млекопитающих включен (Mena), и эндотелиальной клетки, все в прямом физическом контакте друг с другом1, 5,9,10,11,12,13. Ключевым событием для функции TMEM как внутривазивного дверного проема является локализованное высвобождение сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) на основной сосуд периваскулярным макрофагом14. VEGF может нарушить гомотипические соединения между эндотелиальными клетками15,16,17,18,19, явление, которое приводит к переходной утечки сосудов, также известный как "взрыв" проницаемость, как описано в исследованиях IVI 5. TMEM макрофаги были показаны, чтобы выразить рецептор тирозинкиназы TIE2, который необходим для VEGF-опосредованной функции TMEM и самонаведения этих макрофагов в периваскулярной нише5,20,21 , 22. В дополнение к регулированию распространения раковых клеток и метастазов, TIE2и макрофаги, как было показано, центральные регуляторы опухолевого ангиогенеза21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Таким образом, макрофаги TIE2и представляют собой критический компонент микроокружения опухоли и основной регулятор метастатического каскада.
Для лучшей концептуализации TMEM-опосредованной сосудистой проницаемости (т.е. "взрыв"), очень важно отличить его от других способов проницаемости сосудов, которые не связаны с роспуском эндотелиальных клеточных соединений. В нетронутом эндотелии (тот, чьи тесные и адепты не нарушены), есть три основных типа проницаемости сосудов: а) пиноцитоз, который может или не может быть связан с трансцитозом проглоченного материала; b) транспортировка материала через эндотелиальную фенестру; и с) транспортировка материала по параклеточному пути, который регулируется эндотелиальными узкими соединениями15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Хотя дерегулированы во многих опухолей, вышеупомянутые способы проницаемости сосудов были описаны в основном в контексте нормальной физиологии тканей и гомеостаза, крайности которых являются ткани с ограниченной проницаемостью ( например, гематоэнцефалический барьер, гематоэнцефалический барьер), или обильная проницаемость (например, фенестрированные капилляры почечного гломерулярного аппарата)34,35,36,37.
Используя мультифотонную интравитальная визуализацию и мультиплексированную иммунофлуоресценционную микроскопию, мы можем различать проницаемость сосудов tMEM ("взрыв") и другие способы проницаемости сосудов при опухолях молочной железы. Для этого мы выполняем одну внутривенную инъекцию высокомолекулярного веса, флуоресцентно маркированного зонда у мышей. Спонтанное взрывное время событий может быть захвачено с помощью интравитентной визуализации у живых мышей; или, в качестве альтернативы, экстравазивание зонда может быть количественно путем совместного исследования локализации с сосудами крови (например, CD31 или Эндомуцин)и TMEM дверные проемы с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Представленные здесь протоколы описывают оба этих метода, которые могут использоваться либо самостоятельно, либо в сочетании друг с другом.
Все эксперименты с использованием живых животных должны проводиться в соответствии с руководящими принципами и правилами в отношении использования животных и ухода за животными. Процедуры, описанные в данном исследовании, были проведены в соответствии с национальными правилами здравоохранения, касающимися ухода и использования экспериментальных животных, а также с одобрения Медицинского колледжа и использования животных Колледжа Альберта Эйнштейна (IACUC).
1. Оценка "взрывной проницаемости" с использованием изображений живых животных
2. Оценка внесосудистого экстран с использованием анализа фиксированной ткани
Экспериментальные процедуры, описанные в настоящей статье протокола, кратко обобщены и проиллюстрированы на рисунке 1A-C.
Для измерения проницаемости сосудов TMEM ("всплесковой активности") и снижения экспериментального шума от других способов про...
Здесь мы намечаем два протокола, которые могут быть применены для визуализации и количественной оценки определенного типа сосудистой проницаемости, которая присутствует в дверных проемах TMEM и связана с нарушением сосудистой плотности и связей. Этот тип проницаемости сосудов являетс?...
Авторы не раскрывают никакого конфликта интересов.
Мы хотели бы поблагодарить Аналитический центр визуализации (AIF) в Медицинском колледже Альберта Эйнштейна за поддержку изображений. Эта работа была поддержана грантами NCI (P30CA0133330, CA150344, CA 100324 и CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Центр биофотоники Gruss-Lipper и его комплексная программа визуализации, а также Рут Грантштейн из Montefiore для исследования микроокружения опухоли (CA200561).
ГСК совместно писала рукопись, выполняла визуализацию для фигур 1С и 3В, разработала протокол анализа фиксированной ткани, проанализировала и интерпретировала все данные; JMP совместно написал рукопись, и выполнил операцию и интравитальной визуализации для рисунка 1B,2C и 3A; LB и AC выполнили операцию и интравитальной визуализации для Рисунок 2B; RJ выполнил операцию и интравитальной визуализации для Рисунок 2A; ОАО является соавтором рукописи, проанализировало и интерпретировало все данные; MHO совместно написал рукопись и проанализировал и интерпретировал все данные; и DE выполнили операцию и интравитальной визуализации для рисунка 2D, соавтором рукописи, разработал и разработал анализ фиксированной ткани и внутрижизненной протоколы визуализации, а также проанализировали и интерпретировали все данные.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
Anti-rat IgG (Alexa 647) | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Citrate | Eng Scientific Inc | 9770 | |
Cover Glass Slips | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
Cyanoacrylate Adhesive | Henkel Adhesive | 1647358 | |
DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine | Sigma Aldrich | T1287 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
Endomucin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
Enrofloxacin | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
Fish Skin Gelatin | Fisher Scientific | G7765 | |
Insulin Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
Isofluorane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
Matrigel | Corning | CB40234 | Artificial extracellular matrix |
Needle (30 G) | Becton Dickinson | 305128 | |
Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | PBS | |
Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
Pulse Oximeter | Kent Scientific | MouseOx | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
Quantum Dots | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
Rubber | McMaster Carr | 1310N14 | |
TMR (primary antibody) | Invitrogen | A6397 | |
Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
Xylene | Fisher Scientific | 184835 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены