利用原子力显微镜测量植物细胞和植物组织的机械特性和Turgor压力

摘要

在这里,我们介绍原子力显微镜(AFM),作为细胞和组织纳米和微缩进工具。该仪器允许同时采集样品的三维表面地形及其机械特性,包括细胞壁杨的模量以及 turgor 压力。

摘要

我们在这里介绍使用原子力显微镜来缩进植物组织并恢复其机械性能。在缩进模式下使用两种不同的显微镜,展示了如何测量弹性模量,并用它来评估细胞壁的机械性能。此外,我们还解释了如何评估 turgor 压力。原子力显微镜的主要优点是它是非侵入性的,相对快速(5~20分钟),几乎任何类型的活植物组织表面平坦,无需治疗即可进行分析。分辨率可能非常好,具体取决于尖端大小和单位面积的测量次数。此方法的一个限制是,它只提供直接访问表面细胞层。

引言

原子力显微镜 (AFM) 属于扫描探针显微镜 (SPM) 系列,其中半径通常为几纳米的尖端扫描样品表面。表面的检测不是通过光学或电子方法实现的,而是通过尖端和样品表面之间的相互作用力实现的。因此,该技术不仅限于样品表面的地形特征化(3D分辨率可下降到几纳米),而且还允许测量任何类型的相互作用力,如静电、范德瓦尔或接触力。此外,尖端可用于在生物样品表面施加力并测量由此产生的变形,即所谓的"缩进",以确定其机械特性(例如,Young 的模量、粘弹性特性)。

植物细胞壁的机械特性是在试图理解发育过程1、2、3的基础机制时必须考虑的。事实上,这些特性在发育过程中受到严格控制,特别是因为细胞壁软化是允许细胞生长所必需的。AFM 可用于测量这些属性,并研究它们在器官、组织或发育阶段之间的变化方式。

在本文中,我们描述了我们如何使用AFM测量细胞壁的机械特性和土姆压力。这两种应用在两种不同的 AFM 显微镜上进行了演示,之后将在此详细介绍。

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研究方案

1.细胞壁机械性能的测量

注:给出了阿拉伯经体发育的陀螺的例子。

1. 生物样品的制备
   1. 根据公布的阶段测定,在阶段9至10(约0.5毫米长)收集封闭的花^蕾。在双筒望远镜下,使用细钳子,小心地打开芽,检查发育阶段,并收集位于花中心的陀螺仪。
   2. 将陀螺放在双侧胶带上,放在小培养皿盖的中心(直径为 5 厘米)。
      注:作为替代方案,生物相容性胶水还可用于在缩进时更有效地固定样品。
   3. 快速加水,直到样品完全覆盖。这样可以避免脱水,并减少尖端对样品的粘附。或者,将样品浸入液体介质中,如阿拉伯拟南芥顶培养基5。
2. AFM 校准
   1. 将悬臂弹簧常量k设置得足够高,使样品表面的变形达到所需的压痕,但不要过高以避免灵敏度损失。
      注:粗略的经验法则是,如果已知 Young 的样本模量,则可以选择弹簧常数的量级作为k=E = =,其中#是所需的缩进。
   2. 使用R = 400 nm 球形端尖,具有 15 μm 尖端悬臂距离。
      注:尖端半径与横向分辨率直接相关。通常,对于生物材料的缩进,选择圆尖(R大于 10-20 nm)或胶体探头。小型胶体探头可能难以使用,因为尖端和悬臂之间的距离很小,可以接触样品表面。
   3. 在实验前至少 2-3 小时打开软件并水平放置头部:这将允许头部进行热化,并避免热感应悬臂激光相对运动。如果显微镜配备了CellHesion模块(将可用的Z压电范围扩展到100μm,而不是15μm),请先打开控制器,然后在启动软件时选择细胞振取模式。
   4. 将悬臂安装在玻璃块上,并将块安装在头上。将几微升超纯水滴放在尖端,以避免在尖端浸入水中时形成气泡。
   5. 放置硬样品(清洁玻璃幻灯片或蓝宝石),并加入 30-50 μL 的超纯水。
      注:此处描述的校准过程是有时称为触点校准。首先,在坚硬平坦的表面上形成力曲线,然后记录热激发悬臂的振荡光谱,以计算弹簧常数。存在其他校准协议,将在讨论段落中简要说明。
   6. 将头部放在舞台上(小心将 Z 电机提升到足够高的位置)。使用光学图像大致将激光放在悬臂上。
      1. 沿着悬臂的主轴移动激光,监测光电二极管上的总和信号。
         注:当使用标准吊带时,应获得大于 0.5 V 的总和。
      2. 沿另一个方向移动激光并最大化总和信号,以便将激光定位在悬臂的中间。这将最大限度地减少横向和垂直偏转之间的串扰。
   7. 偏转灵敏度的测量
      注:光电二极管读取激光位移并提供以伏特为单位的信号。为了能够测量公制单位的偏转,必须测量偏转灵敏度。
      1. 在接触和力光谱中设置仪器。将相对设定点设置为 2 V,将 Z 长度设置为 0.5 μm,并将速度扩展至 2 μm/s(采样率至 10000 Hz),然后选择Z 闭环。
      2. 打开校准管理器并选择力曲线的接触部分(应为线性)以进行线性拟合:斜率的反向给出偏转灵敏度。光电二极管读数现在以公制单位校准。
   8. 确定弹簧常数。在校准管理器中,选择弹簧常数以运行热频谱采集。要使信号在较长时间内平均,请选择 + 符号。热激发悬臂的功率谱可能显示几个峰值;围绕位于最低频率的一个选择来适合它。
      注:如果在液体中执行热调谐,谐振峰值将比标称峰值更宽,频率降低。
3. 力光谱实验设置和采集
   1. 将样品放在 AFM 级,并将头部放在样品上。
      注:确保头部已缩回足以避免尖端和样品表面之间的硬接触。
   2. 让悬臂热化几分钟。
   3. 在QI模式下,使用设定点力为 50 nN 的方法。
   4. 将 Z 长度设置为 4 μm,将扫描区域设置为 80 x 80 μm 2,像素数为 40 x 40。在"高级成像设置"面板中,将模式设置为恒定速度。将扩展和缩回速度设置为 200 μm/s,将采样速率设置为 25 kHz。
   5. 开始扫描并使用此快速低力扫描来检查样本是否移动。验证扫描区域是否无碎屑或偏转的电池,并找到尽可能平坦的区域以执行测量。
      注:为了欣赏真正的样品倾斜,线平平应设置为OFF或常量。压痕轴和曲面之间的过度倾斜角度将对测量的 Young 模量⁵产生影响。
   6. 找到感兴趣区域后,选择周围 40 x 40 到 60 x 60 μm²的区域,并增加像素数以达到 2 像素/μm。 如有必要,在实验开始时调整此值。将 Z 长度减小到 2 μm。将扩展和缩回速度减小到 100 μm/s,并将采样速率提高到 50 kHz。
   7. 开始扫描并保存输出(通常由图像和数据文件组成)。
   8. 在测量日结束时,拆下尖端支架,用超纯水和 70% EtOH 轻轻冲洗。
   9. 干燥并拆下悬臂。对于使用同一尖端进行进一步实验,请考虑使用湿清洁方案进行清洁,如果可能,考虑进行后续等离子 O₂处理。不要让水在悬臂和/或尖端支架上干燥,以避免盐结晶。
4. 数据分析(适用于 6.x 数据处理软件版本)
   1. 打开数据处理软件并加载数据文件。
   2. 单击"使用此地图进行批处理"按钮,以便在地图的所有曲线上使用相同的分析参数。
   3. 在加载预定义过程中,选择赫兹拟合。
   4. 使用第一个选项卡验证或更改校准参数。
   5. 在第二个选项卡中,从基线中删除偏移量(或偏移加倾斜),将其平均值设置为 0。
   6. 在第三个选项卡中,通过将接触点 (POC) 位置视为从沿延伸曲线的设定点值向下时跨越 0 力的第一个点来估计接触点 (POC) 位置。
   7. 选项卡"垂直尖端"位置通过从"高度测量"中减去悬臂偏转来计算齿尖移动。在此步骤中,通过选中相应的复选框,对以下拟合使用"未平滑高度"(原始数据)。
   8. 在弹性拟合选项卡中,选择适当的拟合模型。如果缩回曲线上看不到或弱附着力(对应于设定点力的 10% 或所选缩进深度上的最大平均力),则模型类型应设置为赫兹/Sneddon,并应使用延伸曲线。在粘附性更强的情况下,DMT 模型(代表 Derjaguin-Muller-Toporov 模型)应优先使用,并且应在缩回曲线上进行拟合(有关可用接触模型和相关公式的详细信息,请参阅手册)。
      1. 根据标称尖端形状设置尖端几何参数。在这里,尖形是球体,尖端半径是400nm。
      2. 将泊成比设置为 0.5,就像通常对生物材料(对应于不可压缩材料)所做的那样。
   9. 适合特定的缩进。默认情况下,拟合在整个曲线上执行。如果拟合必须达到特定的缩进,请首先选中"移位曲线"复选框;如果拟合必须达到特定缩进,请先选中"移位曲线"复选框。这将根据新确定的基线和 POC 值移动曲线的原点。
      1. 通过单击主窗口中的图标,添加第二个弹性拟合例程。
      2. 再次设置所有拟合参数,并在X 分钟指定所需的缩进。根据需要添加尽可能多的步骤(2 到 3 个步骤应足够),以便优化 POC 位置的确定,并随后计算缩进深度。此时可以保存该过程。
   10. 单击"保留并应用于所有"以迭代地图所有曲线上的上述步骤。
   11. 保存结果。将获取图像和 .tsv 文件。

2. 图尔戈尔压力的测量

注:给出了阿拉伯花的奥里扎林处理花序素的例子。

1. 生物样品的制备
   1. 收集阿拉伯蛋白酶花序肌(IM)处理与微管脱聚药物奥里扎林从体外植物生长在含有极性辅助素运输抑制剂1-N-Naphthphphphthphthaala酸(NPA)的介质上按照已公布的方法⁶.
   2. 在两个选项之一之后安装 IM 示例
      1. 长期监测:将样品安装在含有阿拉伯拟南芥顶培养基(ACM)7、8和0.1%的植物保鲜混合物(PPM)中,以防止污染。将 IM 尖端悬挂在 ACM 表面上方,用 2% 的角珠支持 IM 底座。
      2. 对于快速的溶液变化进行测量:将样品安装在培养皿中,手持一小块胶粘剂,用生物兼容的胶水快速密封粘胶和样品基之间的间隙。等待胶水凝固(小于 2 分钟),然后将样品浸入含有 0.1% PPM 的液体 ACM 中。
         注:固定样品底座时,确保样品表面没有涂覆胶合胶或胶水。AFM 测量的 turgor 压力要求样品稳定安装,而以前的安装方法可提供可接受的稳定性。根据样品的不同,可以使用其他安装方法,如双面胶带、聚莱酶等。
2. AFM 校准
   1. 打开 AFM 采集软件并选择峰值力 QNM(大振幅)测量模式。
   2. 按照步骤 2.1 到 2.6 中描述的相同原则执行校准。
   3. 在"检查参数"窗口中,将"扫描"大小设置为 0。在"斜坡"窗口中,将斜带尺寸设置为 200 nm 和 500 nm 之间,将Trig 阈值设置为 2 V 和 5 V,将样本数设置为 2048 或更高。
   4. 将悬臂尖端与校准样品对齐,然后单击"接近"。
   5. 联系后,转到"斜坡"窗口,然后单击"连续斜坡"按钮。在曲线的线性系统上,单击"更新灵敏度"按钮确定斜率。多次重复偏转灵敏度测量,并通过从"校准"菜单打开 Tab检测器,手动更新具有测量平均值的校准。
   6. 缩回 AFM 头并拆下校准样品。
      注:建议通过选择"标签阶段+ 初始化"来完全缩回 AFM 头,以防止在样品更改时意外发生硬接触。
3. 力光谱实验设置和采集
   1. 如果样品尚未浸没,则将其浸入含有 PPM 的液体 ACM 中。
   2. 在采集软件中,指定测量参数,如下所示:
      1. 在Check 参数窗口中,将弹簧常数设置为悬臂的制造弹簧常数或步骤 2.8 中确定的弹簧常数。在此示例中,它设置为 42 N/m。
      2. 在此示例中,将尖端半径设置为 400 nm。
      3. 将样本泊松的比率设置为 0.5,因为水主要对 turgor 压力负责。
      4. 将样品/生产线设置为 128,以确保快速采集。
      5. 将扫描速率设置为 0.2 Hz。
      6. 将扫描大小设置为 1 μm。
         注:设置扫描速率和扫描尺寸较小可有效防止 AFM 扫描触发的样本损坏。建议在任何样本更改时减少这两个参数。
      7. 在"斜坡"窗口中,将斜坡大小设置为 5 μm。
         注:它更好地设置大于预期缩进深度的斜坡尺寸,从而更好地获得基线。
      8. 将三角阈值设置为最大值。
      9. 将样本数设置为 4608。
      10. 或者,在显微镜 + 啮合参数选项卡中,减少以下参数,以防止强烈的接触引起的样品损坏。将峰值力啮合设定点设置为 0.3 V(默认为 0.5 V)。将"啮合"增益设置为 0.5(默认为 0.75)。将SPM 接合步骤设置为 4 μm(默认为 15 μm)。
   3. 将样品置于 AFM 头下并对齐,然后接近悬臂,直到悬臂被淹没,但未与样品表面接触。
      注:接近时,轻轻吹打液体ACM表面,直到悬臂和液体表面之间形成液体桥。这通常可以防止硬接触。
   4. 小心,手动接近示例。当探头相对靠近样品表面时,单击"接近"。
   5. 接触时,逐渐增加扫描尺寸和/或扫描速率,直到达到所需的平衡,而不会损坏样品和/或悬臂。
      注:扫描尺寸受样品的表面曲率和粗糙度的限制。在奥里扎林处理的IM的情况下,50 x 50 μm²扫描区域可以达到扫描速率为0.3赫兹。
   6. 扫描时,确定测量区域是否如需要。如果需要,可重新定位。满足后,单击"点"和"拍摄"按钮以启动点和拍摄窗口。
   7. 在记录扫描之前,请选择适当的图像通道,以方便清晰识别细胞轮廓。通常,峰值力误差、DMT 模量、LogDMT 模量或耗散是合适的。指定保存目录和文件名。然后单击下一次扫描的"斜坡"以启动录制。
      注:指定文件名(如 .000)后将自动添加一个点和三个数字的字符串。每次保存的扫描重复时,此数字会自动增加 1。
   8. 扫描完成后,软件界面将自动重定向到Ramp窗口。单击扫描的图像以指定要缩进的位置。
      注:在记录缩进之前,最好选择几个地标来执行测试缩进,只需单击"Ramp",以防需要参数交替(对于斜坡大小、压电位置等)。缩进深度需要大于细胞壁厚(最好通过透射电子显微镜单独确定)。
   9. 选择每个细胞靠近其重心至少三个缩进位,并每个位点重复三次。这将产生每个单元至少 9 个力曲线,以便进一步分析。当对缩进网站放置满意时,单击"斜坡"并捕获。强制缩进曲线将自动保存到指定的目录中。
   10. 坡道完成后,重新定位到其他位置进行切片测量,或缩回扫描头并更改样本。
   11. 完成后,如步骤 1.3.8 和 1.3.9 中一样清洁悬臂。
4. 数据分析
   1. 在分析软件中,打开 *.mca 文件。这将显示扫描图像上每个力曲线的位置。如果需要,请预先选择力曲线进行分析。
   2. 打开一个要分析的力曲线,通常采用x0000y.00z的格式,其中 x 是保存目录中的指定文件名,而 y 和 z 是自动注册的数字,表示缩进序列和扫描编号。
   3. 单击"基线校正"按钮并拖动力曲线上的蓝色短划线,直到"延伸源基线开始"和"延伸源基线停止"分别为 0% 和 80%。单击"执行"。
      注:或者,扩展源基线停止可以设置为不同的值,只要它仍然在基线内,而不是超出接触点。
   4. 单击Boxcar 过滤器按钮,然后单击"执行"以平滑力曲线。
   5. 单击"缩进"按钮。
      1. 在"输入"窗口中,将活动曲线设置为"延伸"。
      2. 将拟合方法设置为线性化模型,并将粘附力设置为"是"。
      3. 将最大力拟合边界设置为 99%,将最小力拟合边界设置为 75%。
      4. 将拟合模型设置为刚度(线性)。
         注:此设置将计算用于 turgor压力推导的表观刚度 k。在此示例中,拟合边界反映约 1.5 μm 缩进深度的刚度拟合。
   6. 力曲线可以分批分析。单击"运行历史记录"按钮,指定报表目录,并添加需要相同处理的所有其他力曲线。满足后,单击"运行"。默认情况下,拟合将存储为 *.txt 文件。
   7. 当k批量安装时,单击"历史记录" 5 缩进以返回到缩进窗口。
      1. 将最大力拟合边界更改为 10%,将最小力拟合边界更改为 0%。
      2. 将拟合模型设置为赫兹安(球形)。
         注: 这将计算细胞壁杨的模量E的 turgor 压力推导。在此示例中,拟合边界反映大约 0.4 μm 缩进深度的赫兹安拟合(使用球形探头)。
   8. 对批次适合E重复步骤 2.4.6。
   9. 打开 *.00z 文件(z 是自动注册的扫描号码)以显示不同的扫描通道。在"高度"通道窗口中,单击"部分"按钮。这将允许测量样品的表面曲率,这是预测压力扣除所必需的。
      1. 跨一个单元格的长轴绘制一条线,将虚线边界移动到像元边缘,并记录半径值r₁。对短轴重复此操作以检索半径r₂。使用两个半径测量值计算细胞表面均率=_M和高斯曲率+_G,如下所示:
         和 
   10. 使用发布⁹的薄壳模型推断 turgor 压力P,如下所示:
        
       与
       
       其中t是由电子显微镜等决定的细胞壁厚度。
       注:推导 turgor 压力是一个合适的过程,需要迭代。四次迭代通常能够重现稳定的产品,但可以执行更多迭代(例如 100 次)。
   11. 计算每个单元格的平均 E、k 和P。此外,注册细胞内变异性(例如标准偏差)以进行记录。

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结果

图 1A和图 1B显示了一个屏幕截图,其中说明了协议步骤 1.3.4 到 1.3.6 的结果,用于查找获取 QI 映射的感兴趣区域。值得一提的是,选择感兴趣的区域是为了不倾斜表面(即尽可能平坦)。事实上,正如Routier等人^所注意到的,如果缩进轴不垂直于表面,那么所测得的杨的模量就被低估了。此效果在图 1

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讨论

植物形态的出现主要取决于时间和空间内生长的协调速率和方向。植物细胞被包裹在由多糖基质制成的刚性细胞壁中,这些基质将它们粘在一起。因此,细胞膨胀由细胞壁上的 turgor 压力拉扯和细胞壁的刚度与抵抗这种压力之间的平衡控制。为了理解发育背后的机制,能够测量细胞壁的机械特性以及特定器官的不同组织或细胞中的turgor压力是很重要的。如本文所示,AFM 是在此背景下的选择方法。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.