原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定

要約

ここでは、細胞や組織に対してナノ・マイクロインデントツールとして動作する原子力顕微鏡(AFM)を紹介する。器械はサンプルの3D表面の地形および細胞壁ヤングの係数およびターゴール圧力を含む機械特性の同時獲得を可能にする。

要約

ここでは、原子組織をインデントし、その機械的特性を回復するための原子間力顕微鏡の使用を提示します。インデントモードで2つの異なる顕微鏡を使用して、弾性率を測定し、それを使用して細胞壁の機械的特性を評価する方法を示します。また、ターゴル圧力の評価方法についても説明する。原子間力顕微鏡検査の主な利点は、非侵襲的で比較的迅速な(5〜20分)であり、表面的に平坦な生きている植物組織の事実上あらゆるタイプが治療を必要とせずに分析できることである。解像度は、先端のサイズと単位面積あたりの測定値の数に応じて、非常に良好なことができます。この方法の 1 つの制限は、表面的なセル層への直接アクセスのみを与える場合です。

概要

原子力顕微鏡(AFM)は、スキャンプローブ顕微鏡(SPM)ファミリーに属し、通常数ナノメートルの半径を持つ先端がサンプルの表面をスキャンします。表面の検出は、光学式または電子ベースの方法ではなく、先端とサンプル表面との相互作用力によって達成される。したがって、この技術は、サンプル表面の地形特性解析(数ナノメートルまで下がることができる3D解像度)に限定されるだけでなく、静電、ファンデルワールス、接触力などのあらゆるタイプの相互作用力の測定も可能です。さらに、先端は、生体試料の表面に力を加え、得られた変形、いわゆる「インデント」を測定し、その機械的特性(例えば、ヤングの係数、粘弾性特性)を決定するために使用することができる。

植物細胞壁の機械的特性は、発達過程1、2、3の基礎となるメカニズムを理解しようとする際に考慮することが不可欠である。実際、これらの特性は、細胞が成長することを可能にするために細胞壁軟化が必要とされるので、特に、発達中に厳密に制御される。AFMは、これらの特性を測定し、臓器、組織または発達段階の間で変化する方法を研究するために使用することができます。

本論文では,AFMを用いて細胞壁の機械的特性とターゴール圧の両方を測定する方法について述べた.これらの2つの適用は2つの異なったAFM顕微鏡で実証され、後でここで詳しく説明される。

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プロトコル

1.細胞壁の機械的特性の測定

注:アラビドプシスの現像婦人科の例が提示される。

1. 生体試料の調製
   1. アラビドプシス4の公表段階決定に従って、ステージ9〜10(長さ約0.5mm)で閉じた花芽を収集します。双眼鏡の下で、細かいピンセットを使用して、慎重に開発の段階を確認し、花の中心に位置する婦人科を収集するために芽を開きます。
   2. 小さなペトリ皿(直径5cm)のカバーの中央に置かれた両面テープにジノエシウムを置きます。
      注:代替として、生体適合性接着剤は、インデント時の試料のより効率的な固定化にも使用できます。
   3. サンプルが完全に覆われているまで、迅速に水を追加します。これは脱水を避け、サンプルへの先端の付着を減らす。あるいは、アラビドプシス頂点培養培地5などの液体培地に試料を沈下する。
2. AFMキャリブレーション
   1. カンチレバーばね定数kを設定すると、サンプル表面の変形を目的のインデントまで可能にしますが、感度の損失を避けるために高すぎないようにします。
      注:大まかな経験則として、ヤングのサンプルの係数がわかっている場合、ばね定数の大きさの順序をk≥E * δとして選択できます。
   2. R = 400 nm の球形端の先端を 15 μm の先端片持ち距離で使用します。
      注:先端半径は、横解像度に直接関連しています。一般に、生体材料のインデントのために、丸みを帯びた先端(R 10-20 nmより大きい)またはコロイドプローブを選択する。小さなコロイドプローブは、先端と片持ちの間の距離が小さく、サンプル表面に触れることができるため、使用が難しい場合があります。
   3. ソフトウェアをオンにし、実験の前に少なくとも2-3 h水平に頭部を置く:これは頭部が熱化することを可能にし、熱誘発片持ちレーザーレーザー相対動を避ける。顕微鏡にCellHesionモジュールが装備されている場合(利用可能なZピエゾ範囲を15μmではなく100μmに拡張する)、まずコントローラをオンにしてから、ソフトウェアの起動時にCellHesionモードを選択します。
   4. ガラスブロックに片持ち式を取り付け、ヘッドにブロックを取り付けます。先端に水に浸すときに気泡の形成を避けるために先端に超純水の数マイクロリットルの液滴を置きます。
   5. ハードサンプル(洗浄ガラススライドまたはサファイア)を配置し、超純水の30-50 μLを追加します。
      注:ここで説明するキャリブレーション手順は、時々呼ばれる接触キャリブレーションです。まず、硬くて平坦な表面に力曲線が作られ、次に熱励起片持ちの振動スペクトルが記録され、ばね定数が計算されます。その他の校正プロトコルが存在し、説明する段落で簡単に説明します。
   6. 頭をステージの上に置きます(Zモーターを十分に高く持ち上げるように注意してください)。光学画像を使用して、大まかに片持ち式にレーザーを配置します。
      1. フォトダイオード上の合計信号を監視する片持ちの主軸に沿ってレーザーを移動します。
         注:標準片持ち式を使用する場合は、0.5 V を超える合計を取得する必要があります。
      2. 他の方向に沿ってレーザーを移動し、片持ちの真ん中にレーザーを配置するために合計信号を最大化します。これにより、横方向と垂直方向の間のクロストークを最小限に抑える。
   7. たわみ感度の測定
      注:フォトダイオードはレーザー変位を読み取り、ボルトで信号を提供します。メトリック単位で偏向を測定するには、偏向感度を測定する必要があります。
      1. [接触] → 強制分光法で計測器を設定します。相対設定点を 2 V、Zの長さを0.5 μm に設定し、速度を 2 μm/s (サンプル レートを 10000 Hz) に拡張し、Z閉じたループを選択します。
      2. キャリブレーション マネージャを開き、フォース カーブの接触部分(線形にする必要があります)を選択して線形フィットを行います: 勾配の反転は偏向感度を与えます。フォトダイオードの読み取り値がメトリック単位で校正されるようになりました。
   8. 春定数の決定.キャリブレーションマネージャで、[スプリング定数]を選択して熱スペクトル集録を実行します。信号を長時間平均するには、∞記号を選択します。熱的に励起された片持ちの電力スペクトルは、いくつかのピークを示すことができます。最も低い周波数に配置された選択範囲を描画します。
      注:液体で熱チューンを行う場合、共振ピークは広くなり、公称に比べて周波数が低下します。
3. 強制分光実験のセットアップと取得
   1. サンプルを AFM ステージに配置し、頭部をサンプルの上に置きます。
      注:先端とサンプル表面の間の接触を避けるために、頭部が十分に引き込まれたことを確認してください。
   2. 片持ちは数分間熱化します。
   3. QIモードでは、50 nN のSetpointフォースでアプローチします。
   4. Z の長さを 4 μm に設定し、スキャン領域を 80 x 80 μm²に設定し、ピクセル数を 40 x 40 に設定します。[詳細イメージ投射設定]パネルで、モードを一定の速度に設定します。拡張速度を 200 μm/s に設定し、サンプルレートを 25 kHz に設定します。
   5. スキャンを開始し、サンプルが動くかどうかを確認するために、この急速な低力スキャンを使用します。スキャンした領域に破片や偏向セルが含まれていることを確認し、測定を実行するために可能な限り平坦な対象領域を見つけます。
      注:実際のサンプルチルトを理解するには、ラインレベリングをOFFまたは定数に設定する必要があります。インデント軸とサーフェスの間の過度の傾き角度は、測定されたヤングのモジュラス5に影響を与えます。
   6. 対象領域が見つかったら、周囲の 40 x 40 ~ 60 x 60 μm²の領域を選択し、ピクセル数を増やして 2 ピクセル/μm に達します。必要に応じて、実験の開始時にこの値を調整します。Z の長さを 2 μm に減らし、拡張およびリトラクト速度を 100 μm/s に減らし、サンプルレートを 50 kHz に増やします。
   7. スキャンを開始し、出力を保存します (通常は Image とデータ ファイルで構成されます)。
   8. 測定日の終わりに、先端ホルダーを取り外し、超純水と70%EtOHで軽く洗い流します。
   9. 乾燥し、片持ち式を取り除きます。同じ先端を使用してさらなる実験を行う場合は、ウェットクリーニングプロトコルで洗浄し、可能であればフォローアッププラズマO2処理を検討してください。塩の結晶化を避けるために、片持ちや先端ホルダーの水を乾燥させないようにしてください。
4. データ分析(6.xデータ処理ソフトウェアバージョンの場合)
   1. データ処理ソフトウェアを開き、データファイルをロードします。
   2. マップのすべてのカーブで同じ解析パラメータを使用するには、[バッチ処理] ボタンにこのマップを使用します。
   3. 事前定義された読み込みプロセスで、[ヘルツフィット] を選択します。
   4. 最初のタブを使用して、キャリブレーションパラメータを確認または変更します。
   5. 2 番目のタブで、ベースラインからオフセット(またはオフセットとチルト)を削除して、平均値を 0 に設定します。
   6. 3 番目のタブでは、延長曲線に沿ってセットポイント値から下がったときに 0 フォースを横切る最初のポイントとして考慮して、接触点(POC)位置を推定します。
   7. タブ垂直先端位置は、高さ測定から片持ち偏向を減算して先端の動きを計算します。この手順では、対応するチェックボックスをオンにして、次のフィット感に対して[平滑化されていない高さ(生データ])を使用します。
   8. [伸縮性フィット]タブで、適切なフィットモデルを選択します。リトラクト カーブに接着が見えない場合(セットポイントの力の 10% 未満、または選択したインデント深さでの最大平均力に対応する)、モデル タイプを Hertz/Sneddon に設定し、延長曲線を使用する必要があります。より強い接着性の場合は、デルジャギン・ミュラー・トポロフモデルの略であるDMTモデルが好まれ、リトラクトカーブに適合する必要があります(利用可能な接触モデルおよび関連式の詳細についてはマニュアルを参照)。
      1. 公称先端形状に基づいて先端幾何学的パラメータを設定します。ここでは、先端シェイプは球で、先端半径は 400 nm です。
      2. ポアソン比は、従来の生物材料(非圧縮性材料に相当)に対して行われるように0.5に設定します。
   9. 特定のインデントに合わせてします。デフォルトでは、フィットはカーブ全体で実行されます。フィットが特定のインデントまで行う必要がある場合は、まず[Shiftカーブ]チェックボックスをオンにします。これにより、新たに決定されたベースライン値と POC 値に基づいて曲線の原点がシフトします。
      1. メイン ウィンドウのアイコンをクリックして、2 つ目の弾性フィットルーチンを追加します。
      2. すべての fit パラメータをもう一度設定し、必要なインデントをX 分で指定します。POC 位置の決定と計算されたインデント深度を絞り込むために、必要な数のステップ (2 ~ 3 ステップで十分です) を追加します。この時点でプロセスを保存できます。
   10. [保持] をクリックし、マップのすべてのカーブで前の手順を反復化するために[すべて]に適用します。
   11. 結果を保存します。イメージと .tsv ファイルが取得されます。

2. ターゴール圧力の測定

注:アラビドプシスのオリザリン処理花序体の一例を紹介する。

1. 生体試料の調製
   1. ポリオキシシン輸送阻害剤1-N-ナフチルフタラミン酸(NPA)を含む培地で増殖した培地中のインビトロプラントレットから微小管脱重合薬オリザリンで処理したアラビドプシス増花性メリステム(IM)を以下の公開方法で採取⁶.
   2. 2 つのオプションのいずれかに続く IM サンプルのマウント
      1. 長期モニタリングのために:アラビドプシス頂点培養培地(ACM)7、8および0.1%植物保存混合物(PPM)を含むペトリ皿にサンプルを取り付け、汚染を防ぎます。ACM 表面の上の IM チップを中断し、2% アガロースのドロップで IM のベースをサポートします。
      2. 迅速な溶液変化による測定:小さな接着剤マスチックを保持するペトリ皿にサンプルを取り付け、生体適合性の接着剤でマスチックとサンプルベースの間のギャップを素早く密封します。接着剤が固化するのを待ち(2分未満)、0.1%PPMを含む液体ACMにサンプルを沈水させます。
         注:サンプルベースを固定する際は、サンプル表面がアガローズや接着剤でコーティングされていないことを確認してください。ターガー圧力のAFM測定はサンプルを安定して取付ける必要があり、前の取付け方法は許容可能な安定性を提供する。サンプルによっては、両面テープ、ポリリジンなど、他の取り付け方法が使用される場合があります。
2. AFMキャリブレーション
   1. AFM集録ソフトウェアをオンにし、PeakForce QNM(大振幅)測定モードを選択します。
   2. 手順 2.1 ~ 2.6 で説明したのと同じ原則に従って校正を実行します。
   3. [パラメータの確認]ウィンドウで、[スキャンサイズ] を 0 に設定します。[ランプ]ウィンドウで、ランプ サイズを 200 nm ~ 500 nm の間に設定し、2 V から 5 V の間のトリグしきい値を、サンプル数を 2048 以上に設定します。
   4. 片持ち先端をキャリブレーションサンプルに合わせ、[アプローチ]をクリックします。
   5. 連絡を取り、ランプウィンドウに移動し、ボタンの連続ランプをクリックします。カーブの線形レジームで、[感度の更新] ボタンをクリックして勾配を決定します。偏向感度測定を数回繰り返し、メニューキャリブレーションからタブ検出器を開いて測定平均でキャリブレーションを手動で更新します。
   6. AFMヘッドを引き込み、キャリブレーションサンプルを取り外します。
      注:サンプルの変更時に偶発的なハードコンタクトを防ぐために、タブステージ→初期化を選択して、AFMヘッドを完全に引き込むことをお勧めします。
3. 強制分光実験のセットアップと取得
   1. サンプルがまだ水没していない場合は、PPMを含む液体ACMで水没させます。
   2. 取得ソフトウェアでは、次のように測定パラメータを指定します。
      1. [パラメータを確認]ウィンドウで、ステップ 2.8 のように、[ばね定数]を片持ち式の製造ばね定数または決定されたばね定数に設定します。この例では、42 N/m に設定されています。
      2. この例では、先端半径を 400 nm に設定します。
      3. 水は主にターガー圧力に寄与するため、サンプルポアソンの比率を0.5に設定します。
      4. サンプル/ラインを 128 に設定すると、迅速な取得が保証されます。
      5. スキャンレートを 0.2 Hz に設定します。
      6. スキャン サイズを 1 μm に設定します。
         注:スキャンレートとスキャンサイズを小さく設定すると、AFMスキャンがトリガーされたサンプルの損傷を効果的に防ぐことができます。サンプルの変更時にこれら 2 つのパラメータを減らすことをお勧めします。
      7. [ランプ]ウィンドウで、ランプ サイズを 5 μm に設定します。
         注:ベースラインの取得を改善するために、意図したインデント深さよりも大きなランプ サイズを設定することをお確認することをお知らずです。
      8. [トリグしきい値を最大値] に設定します。
      9. サンプル数を4608 に設定します。
      10. 必要に応じて、顕微鏡 → エンゲージメントパラメータタブで、強い接触誘発サンプル損傷を防ぐために、以下のパラメータを減らします。ピーク フォース エンゲージ セットポイントを 0.3 V (デフォルトの 0.5 V) に設定します。エンゲージメントインゲインを0.5(デフォルトは0.75)に設定します。SPM エンゲージ ステップを 4 μm (既定の 15 μm) に設定します。
   3. AFMヘッドの下にサンプルを配置して位置合わせし、片持ちが水没するまでアプローチしますが、サンプル表面に接触しません。
      注:接近中、片持ちと液体表面の間に液体ブリッジが形成されるまで、液体ACMの表面を軽く吹く。これは通常、ハードコンタクトを防ぎます。
   4. 注意して、サンプルに向かって手動でアプローチします。プローブがサンプルサーフェスに比較的近い場合は、[アプローチ]をクリックします。
   5. 接触時に、サンプルおよび/または片持ち式を損なうことなく、所望のバランスになるまでスキャンサイズおよび/またはスキャンレートを徐々に増加させる。
      注:スキャンサイズは、サンプルの表面曲率と粗さによって制限されます。オリザリン処理IMの場合、50 x 50 μm²スキャン領域は0.3Hzのスキャンレートで達成することができる。
   6. スキャン中に、測定領域が必要であるかどうかを判断します。必要に応じて再配置します。満足したら、ボタンポイントとシュートをクリックしてポイントとシュートウィンドウを開始します。
   7. スキャンを記録する前に、セルの輪郭の明確な識別を容易にする適切な画像チャネルを選択します。多くの場合、ピーク力誤差、DMT係数、LogDMTモジュラスまたは散逸が適しています。保存ディレクトリとファイル名を指定します。次に、次のスキャンでランプをクリックして録画を開始します。
      注:指定したファイル名 (.000 など) の後に、ドットと 3 つの数字の文字列が自動的に追加されます。この数は、保存されたスキャンの繰り返しごとに自動的に 1 ずつ増加します。
   8. スキャンが完了すると、ソフトウェア インターフェイスが自動的にランプウィンドウにリダイレクトされます。スキャンしたイメージをクリックして、インデントする位置を指定します。
      注:インデントを記録する前に、パラメータの変更が必要な場合(ランプサイズ、Piezo位置など)に備えて、ランプのみをクリックしてテストインデントを実行するいくつかのランドマークを選択することをお勧いします。インデント深さは、細胞壁の厚さよりも大きくする必要があります(理想的には透過電子顕微鏡によって別々に決定されます)。
   9. バリセンターの近くにあるセルごとに少なくとも 3 つのインデント サイトを選択し、サイトごとに 3 回インデントを繰り返します。これにより、さらなる分析のために、セルあたり少なくとも9つの力曲線が得られます。インデント サイトの配置に問題がなければ、[ランプ] をクリックしてキャプチャします。強制インデント カーブは、指定されたディレクトリに自動的に保存されます。
   10. スロープが完了したら、タイル測定のために別の位置に再配置するか、スキャンヘッドをリトラクトしてサンプルを変更します。
   11. 完了したら、ステップ1.3.8と1.3.9のように片持ちをきれいにします。
4. データ分析
   1. 解析ソフトウェアで 、*.mca ファイルを開きます。スキャンしたイメージ上の各フォース カーブの位置を示します。必要に応じて、解析用にフォース カーブを事前に選択します。
   2. 分析する 1 つのフォース カーブを開き、通常はx0000y.00zの形式で、x は save ディレクトリで指定されたファイル名ですが、y と z はインデント シーケンスとスキャン番号を示す数値を自動的に登録します。
   3. ベースライン補正ボタンをクリックし、フォースカーブ上の青い破線をドラッグして、ソースベースラインの開始を延長し、ソースベースライン停止を延長する場合は、それぞれ0%と80%になります。[実行]をクリックします。
      注:または、ソースベースライン停止の延長は、接触点を超えてベースライン内にあり、そうでない限り、異なる値で設定できます。
   4. [ボックスカーフィルタ] ボタンをクリックし、[実行] をクリックしてフォース カーブを滑らかにします。
   5. インデントボタンをクリックします。
      1. [入力]ウィンドウで、[アクティブ カーブを延長]を設定します。
      2. フィット方法を線形モデルに設定し、接着力を「はい」に設定します。
      3. 最大フォース フィット境界を 99% に、最小フォース フィット境界を 75% に設定します。
      4. [適合モデル]を剛性(線形)に設定します。
         注:この設定では、ターガー圧力差しの見かけの剛性kが計算されます。この例では、フィット境界は、約 1.5 μm のインデント深さの剛性フィットを反映しています。
   6. フォースカーブはバッチで解析できます。[履歴の実行] ボタンをクリックし、レポート ディレクトリを指定し、同じ処理を必要とする他のすべてのフォース カーブを追加します。満足したら、[実行]をクリックします。デフォルトでは、フィットは *.txt ファイルとして保存されます。
   7. kがバッチフィットされている場合は、[履歴] → 5 インデントをクリックしてインデント ウィンドウに戻ります。
      1. 最大フォース フィット境界を 10% に、最小フォース フィット境界を 0% に変更します。
      2. フィットモデルをヘルツィアン(球形)に設定します。
         注:これはターガー圧力控除のための細胞壁ヤングのモジュラスEを計算します。この例では、フィット境界は、約 0.4 μm のインデント深さのヘルツィアン フィット(球面プローブを使用)を反映しています。
   8. Eのバッチフィットの手順 2.4.6 を繰り返します。
   9. *.00z ファイル (z は自動的に登録されたスキャン番号) を開き、異なるスキャン チャネルを表示します。[高さ]チャネル ウィンドウで、[断面]ボタンをクリックします。これにより、ターガー圧力控除に必要なサンプルの表面曲率の測定が可能になります。
      1. 1 つのセルの長い軸を横切って線を描画し、破線の境界をセルの端に移動し、半径値 r₁を記録します。半径r₂を取得するには、短い軸でこの手順を繰り返します。次の 2 つの半径測定を使用して、セルのサーフェス平均曲率κ_Mおよびガウス曲率κ_Gを計算します。
         そして 
   10. ⁹日公表された薄型シェルモデルを用いてターガー圧力Pを推測する:
        
       と
       
       ここでtは、例えば電子顕微鏡によって決定される細胞壁の厚さである。
       注:ターガー圧力の控除は、反復が必要とされるフィッティングプロセスです。一般に、4 つのイテレーションは安定した製品を再現できますが、より多くの反復を実行できます (たとえば、100 回)。
   11. セルあたりの平均E、k、および Pを計算します。また、文書化のために細胞内変動(例えば、標準偏差)を登録します。

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結果

図1Aと図1Bは、QIマップを取得する目的の領域を見つけるために使用されるプロトコルのステップ1.3.4~1.3.6の結果を示すスクリーンショットを示しています。目的の領域が傾斜面にないために選択された(すなわち、可能な限り平坦である)ことは言及する価値があります。実際には、Routier et al.⁵によって気づ...

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ディスカッション

植物の形状の出現は、主に時間と空間の間の成長の協調速度と方向によって決定されます。植物細胞は、それらを一緒に接着するポリサカリディックマトリックスで作られた硬質細胞壁に包まれています。その結果、細胞増殖は、細胞壁を引っ張るターゴール圧と、この圧力に抵抗する細胞壁の剛性との平衡によって制御される。発達の根底にあるメカニズムを理解するためには、特定の器?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.