Uso de la Microscopía de Fuerza Atómica para Medir las Propiedades Mecánicas y la Presión Turgor de Células Vegetales y Tejidos Vegetales

Resumen

Aquí, presentamos la microscopía de fuerza atómica (AFM), operada como una herramienta de nano- y micro-indentación en células y tejidos. El instrumento permite la adquisición simultánea de la topografía de superficie 3D de la muestra y sus propiedades mecánicas, incluyendo el módulo de Young de la pared celular, así como la presión del turgencia.

Resumen

Aquí presentamos el uso de la microscopía de fuerza atómica para destetar los tejidos vegetales y recuperar sus propiedades mecánicas. Usando dos microscopios diferentes en modo de sangría, mostramos cómo medir un módulo elástico y usarlo para evaluar las propiedades mecánicas de la pared celular. Además, también explicamos cómo evaluar la presión del turgor. Las principales ventajas de la microscopía de fuerza atómica son que no es invasiva, relativamente rápida (5-20 min), y que prácticamente cualquier tipo de tejido vegetal vivo que es superficialmente plano se puede analizar sin necesidad de tratamiento. La resolución puede ser muy buena, dependiendo del tamaño de la punta y del número de medidas por unidad de área. Una limitación de este método es que sólo da acceso directo a la capa de celda superficial.

Introducción

La microscopía de fuerza atómica (AFM) pertenece a la familia de microscopía de sonda de exploración (SPM), donde una punta con un radio de unos pocos nanómetros escanea la superficie de una muestra. La detección de una superficie no se logra a través de métodos ópticos o basados en electrones, sino a través de las fuerzas de interacción entre la punta y la superficie de la muestra. Por lo tanto, esta técnica no se limita a la caracterización topográfica de una superficie de muestra (resolución 3D que puede bajar a unos pocos nanómetros), sino que también permite la medición de cualquier tipo de fuerzas de interacción como electrostática, van der Waals o fuerzas de contacto. Además, la punta se puede utilizar para aplicar fuerzas en la superficie de una muestra biológica y medir la deformación resultante, la llamada "indentación", con el fin de determinar sus propiedades mecánicas (por ejemplo, módulo de Young, propiedades viscoelásticas).

Las propiedades mecánicas de las paredes celulares de la planta son esenciales a tener en cuenta a la hora de tratar de comprender los mecanismos subyacentes a los procesos de desarrollo^1,2,3. De hecho, estas propiedades se controlan estrechamente durante el desarrollo, en particular porque se requiere un ablandamiento de la pared celular para permitir que las células crezcan. AFM se puede utilizar para medir estas propiedades y estudiar la forma en que cambian entre órganos, tejidos o etapas del desarrollo.

En este artículo, describimos cómo usamos AFM para medir las propiedades mecánicas de la pared celular y la presión del turgencia. Estas dos aplicaciones se demuestran en dos microscopios AFM diferentes y se detallan aquí después.

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Protocolo

1.Medida de las propiedades mecánicas de la pared celular

NOTA: Ejemplo del desarrollo de gineceo de Arabidopsis se presenta.

1. Preparación de las muestras biológicas
   1. Recoger un brote de flores cerrado en la etapa 9 a 10 (aproximadamente 0,5 mm de largo) según la determinación de etapas publicadas para Arabidopsis⁴. Bajo un binocular, utilizando pinzas finas, abrir cuidadosamente el cogollo para comprobar la etapa de desarrollo y recoger el gineceo situado en el centro de la flor.
   2. Coloque el gineceo en cinta adhesiva de doble cara colocada en el centro de la cubierta de una pequeña placa Petri (diámetro de 5 cm).
      NOTA: Como alternativa, el pegamento biocompatible también se puede utilizar para una inmovilización más eficiente de la muestra tras la sangría.
   3. Agregue agua rápidamente hasta que la muestra esté completamente cubierta. Esto evita la deshidratación y reduce la adhesión de la punta a la muestra. Alternativamente, sumerja la muestra en medio líquido, como el cultivo de ápice de Arabidopsis medio⁵.
2. Calibración AFM
   1. Ajuste la constante de resorte en voladizo k lo suficientemente alta como para permitir la deformación de la superficie de la muestra hasta la sangría deseada, pero no demasiado alta para evitar la pérdida de sensibilidad.
      NOTA: Como regla general aproximada, si se conoce el módulo de Young de la muestra, el orden de magnitud de la constante de resorte se puede elegir como káE * ,donde es la sangría deseada.
   2. Utilice una punta de extremo esférico de R a 400 nm con una distancia de 15 m de punta-voladizo.
      NOTA: El radio de la punta está directamente relacionado con la resolución lateral. Generalmente, para la sangría de materiales biológicos, elija puntas redondeadas (R superiores a 10-20 nm) o sondas coloidales. Las sondas coloidales pequeñas pueden ser difíciles de usar debido a la pequeña distancia entre el extremo de la punta y el voladizo que puede tocar la superficie de la muestra.
   3. Encienda el software y coloque la cabeza horizontalmente al menos 2-3 h antes del experimento: esto permitirá que la cabeza se termiqueye y evitará movimientos relativos en voladizo-láser inducidos térmicamente. Si el microscopio está equipado con un módulo CellHesion (ampliando el rango piezoeléctrico Z disponible a 100 m en lugar de 15 m), encienda primero su controlador y luego seleccione el modo CellHesion al iniciar el software.
   4. Monte el voladizo en el bloque de vidrio y monte el bloque en la cabeza. Coloque una gota de unos pocos microlitros de agua ultrapura en la punta para evitar la formación de burbujas de aire cuando la punta se sumerge en agua.
   5. Coloque una muestra dura (tobogán de vidrio limpio o zafiro) y agregue 30-50 l de agua ultrapura.
      NOTA: El procedimiento de calibración descrito aquí es la calibración de contacto a veces llamada. En primer lugar, se hace una curva de fuerza en una superficie rígida y plana y luego se registra el espectro de oscilación del voladizo excitado térmicamente con el fin de calcular la constante de resorte. Existen otros protocolos de calibración que se describirán brevemente en el párrafo de discusión.
   6. Coloque la cabeza en el escenario (tenga cuidado de levantar los motores Z lo suficientemente alto). Utilice la imagen óptica para colocar aproximadamente el láser en el voladizo.
      1. Mueva el láser a lo largo del eje principal del voladizo monitoreando la señal de suma en el fotodiodo.
         NOTA: Cuando se utilizan voladizos estándar, se debe obtener una suma superior a 0,5 V.
      2. Mueva el láser a lo largo de la otra dirección y maximice la señal de suma para colocar el láser en el centro del voladizo. Esto minimizará la conversación cruzada entre la desviación lateral y vertical.
   7. Medición de la sensibilidad a la desviación
      NOTA: El fotodiodo lee el desplazamiento láser y proporciona una señal en voltios. Para poder medir la desviación en la unidad métrica, se debe medir la sensibilidad a la desviación.
      1. Fije el instrumento en Contacto > Forzar espectroscopia. Establezca un punto de consigna relativo en 2 V, la longitud Z en 0,5 m y la velocidad de extensión a 2 m/s (velocidad de muestreo a 10000 Hz) y seleccione Z Bucle cerrado.
      2. Abra el gestor de calibración y seleccione la parte de contacto de la curva de fuerza (que debe ser lineal) para realizar un ajuste lineal: la inversa de la pendiente da la sensibilidad de desviación. La lectura del fotodiodo ahora está calibrada en unidad métrica.
   8. Determinación de la constante de resorte. En Gestor de calibración, seleccione Constante de resorte para ejecutar una adquisición de espectro térmico. Para promediar la señal durante más tiempo, seleccione el símbolo . El espectro de potencia del voladizo excitado térmicamente puede mostrar varios picos; dibujar una selección alrededor de la colocada a la frecuencia más baja para ajustarla.
      NOTA: Si la melodía térmica se realiza en líquido, el pico de resonancia será más amplio y su frecuencia baja en comparación con la nominal.
3. Forzar configuración y adquisición de experimentos de espectroscopia
   1. Coloque la muestra en la etapa AFM y coloque la cabeza sobre la muestra.
      NOTA: Asegúrese de que la cabeza se ha retraído lo suficiente como para evitar un contacto duro entre la punta y la superficie de la muestra.
   2. Deje que el voladizo se termiqueta durante unos minutos.
   3. En el modo QI, acérquese con una fuerza de consigna de 50 nN.
   4. Establezca una longitud Z de 4 m y un área de escaneado en 80 x 80 m² con un número de píxeles de 40 x 40. En el panel Configuración avanzada de imágenes, establezca el modo en velocidad constante. Ajuste la velocidad de extensión y retracción a 200 m/s y las frecuencias de muestreo a 25 kHz.
   5. Comience a escanear y utilice este escaneo rápido de baja fuerza para comprobar si la muestra se mueve. Compruebe que el área escaneada esté libre de escombros o celdas desviadas y localice una región de interés lo más plana posible para realizar las mediciones.
      NOTA: Para apreciar la inclinación real de la muestra, la nivelación de línea debe establecerse en OFF o en Constant. Un ángulo de inclinación excesivo entre el eje de sangría y la superficie tendrá un efecto en el módulo medido de Young⁵.
   6. Una vez que se haya localizado un área de interés, seleccione una región de 40 x 40 a 60 x 60 ám² a su alrededor y aumente el número de píxeles para alcanzar 2 píxeles/ m. Aumente el punto de consigna a 500 nm para obtener 100-200 nm de sangría. Ajuste este valor, si es necesario, al principio del experimento. Disminuya la longitud de la Z a 2 m. Disminuya la velocidad de extensión y retracción a 100 m/s y aumente la frecuencia de muestreo a 50 kHz.
   7. Comience a escanear y guarde la salida (generalmente compuesta por una imagen y un archivo de datos).
   8. Al final del día de medición, retire el soporte de la punta y enjuáguelo suavemente con agua ultrapura y 70% EtOH.
   9. Seque y retire el voladizo. Para más experimentos con la misma punta, considere limpiarlo con un protocolo de limpieza en húmedo y, si es posible, un tratamiento de plasma O₂ de seguimiento. No deje que el agua se seque en el voladizo y/o el soporte de la punta para evitar la cristalización de la sal.
4. Análisis de datos (para la versión de software de procesamiento de datos 6.x)
   1. Abra el software de procesamiento de datos y cargue el archivo de datos.
   2. Haga clic en En el botón Usar este mapa para el procesamiento por lotes para utilizar los mismos parámetros de análisis en todas las curvas del mapa.
   3. En Cargar proceso predefinido, seleccione Ajuste hertzos.
   4. Utilice la primera pestaña para verificar o cambiar los parámetros de calibración.
   5. En la segunda pestaña, elimine un desfase (o un desfase más una inclinación) de la línea base para establecer su valor medio en 0.
   6. En la tercera pestaña, calcule la posición del punto de contacto (POC) considerándola como el primer punto que cruza la fuerza 0 al bajar del valor de consigna a lo largo de la curva de extensión.
   7. La pestaña Posición vertical de la punta calcula el movimiento de la punta restando la desviación del voladizo de Altura medida. En este paso, utilice Altura sin suavizar (datos brutos) para el siguiente ajuste, marcando la casilla correspondiente.
   8. En la pestaña Ajuste de elasticidad, seleccione el modelo de ajuste adecuado. Si no se observa ninguna adherencia o una adhesión débil en curvas de retracción (correspondiente a menos del 10% de la fuerza de consigna o a la fuerza media máxima en la profundidad de sangría seleccionada), el tipo de modelo debe establecerse en Hertz/Sneddon y se debe utilizar la curva de extensión. En caso de adherencia más fuerte, el modelo DMT, que representa el modelo Derjaguin-Muller-Toporov, debe ser preferido y el ajuste debe realizarse en curvas retráctiles (consulte el manual para obtener más información sobre los modelos de contacto disponibles y las fórmulas relacionadas).
      1. Establezca los parámetros geométricos de la punta en función de la forma nominal de la punta. Aquí, la forma de la punta es la esfera y el radio de la punta es 400 nm.
      2. Establezca la relación de Poisson en 0,5, ya que se realiza convencionalmente para material biológico (correspondiente al material incompresible).
   9. Ajustarse a una sangríaespecífica. De forma predeterminada, el ajuste se realiza en toda la curva. Si el ajuste tiene que hacerse hasta una sangría específica, marque primero la casilla de verificación Curva de desplazamiento; esto desplazará el origen de la curva en función de los valores de línea base y POC recién determinados.
      1. Agregue una segunda rutina de ajuste de elasticidad haciendo clic en el icono de la ventana principal.
      2. Establezca de nuevo todos los parámetros de ajuste y especifique en X min la sangría deseada. Agregue tantos pasos como sea necesario (2 a 3 pasos deben ser suficientes) para refinar la determinación de la posición DE POC y, posteriormente, la profundidad de sangría calculada. El proceso se puede guardar en este punto.
   10. Haga clic en Mantener y aplique a todos para iterar los pasos anteriores en todas las curvas del mapa.
   11. Guarde los resultados. Se obtendrá una imagen y un archivo .tsv.

2. Medida de la presión de Turgor

NOTA: Se presenta un ejemplo del meristem de inflorescencia tratado con oryzalina de Arabidopsis.

1. Preparación de muestras biológicas
   1. Recoger el meristem de inflorescencia de Arabidopsis (IM) tratado con el fármaco despolimerizante de microtúbulos orizalina a partir de plantlet in vitro cultivado en medio que contenga el inhibidor de transporte de auxina polar 1-N-ácido naphiplphthalamic (NPA) siguiendo el método publicado ⁶.
   2. Montaje de la muestra de mensajería instantánea después de una de las dos opciones
      1. Para el monitoreo a largo plazo: montar la muestra en un Plato Petri que contiene el medio de cultivo de ápice de Arabidopsis (ACM)^7,8 y 0.1% mezcla de conservación de plantas (PPM), para evitar la contaminación. Suspenda la punta IM por encima de la superficie ACM y apoye la base de IM con una caída de 2% de agarosa.
      2. Para la medición con cambios rápidos en la solución: monte la muestra en un Petri-dish que sostenga un pequeño trozo de masilla adhesiva, y selle rápidamente la brecha entre la masilla y la base de la muestra con pegamento biocompatible. Espere a que el pegamento se solidifique (menos de 2 min) y luego sumerja la muestra en ACM líquido que contenga 0,1% PPM.
         NOTA: Asegúrese de que la superficie de la muestra no esté recubierta con agarosa o pegamento al fijar la base de la muestra. La medición AFM de la presión del turgor requiere que la muestra se monte de forma estable, y los métodos de montaje anteriores proporcionan una estabilidad aceptable. Dependiendo de la muestra, se pueden utilizar otros métodos de montaje, como cinta de doble cara, polilisina, etc.
2. Calibración AFM
   1. Encienda el software de adquisición AFM y elija el modo de medición PeakForce QNM (gran amplitud).
   2. Realice la calibración siguiendo el mismo principio descrito en los pasos 2.1 a 2.6.
   3. En la ventana Comprobar parámetros, establezca Tamaño de escaneado en 0. En la ventana Rampa, establezca el tamaño de rampa entre 200 nm y 500 nm, el umbral de Trig entre 2 V y 5 V y Número de muestras en 2048 o superior.
   4. Alinee la punta del voladizo con la muestra de calibración y haga clic en Enfoque.
   5. Al entrar en contacto, vaya a la ventana Rampa y haga clic en el botón Rampa continua. En el régimen lineal de la curva, determine la pendiente haciendo clic en el botón Actualizar sensibilidad. Repita la medición de sensibilidad de desviación varias veces y actualice manualmente la calibración con el promedio de medición abriendo el detector de pestañas desde el menú Calibración.
   6. Retirar el cabezal AFM y retirar la muestra de calibración.
      NOTA: Se sugiere retraer completamente la cabeza de AFM eligiendo la pestaña Etapa - Inicializar para evitar el contacto duro accidental tras el cambio de muestra.
3. Forzar configuración y adquisición de experimentos de espectroscopia
   1. Si la muestra aún no está sumergida, sumerjala con ACM líquido que contenga PPM.
   2. En el software de adquisición, especifique los parámetros de medición de la siguiente manera:
      1. En la ventana Comprobar parámetro, establezca constante de resorte en la constante de muelle fabricada del voladizo o en la constante de muelle determinada como en el paso 2.8. En este ejemplo, se fija en 42 N/m.
      2. Fije el radio de la punta a 400 nm en este ejemplo.
      3. Establezca la relación de Muestra Poisson en 0,5, ya que el agua contribuye principalmente a la presión del turgencia.
      4. Establezca Muestra/Línea en 128 para garantizar una rápida adquisición.
      5. Establezca la velocidad de escaneo en 0,2 Hz.
      6. Establezca el tamaño de Escaneado en 1 m.
         NOTA: Establecer la velocidad de escaneo y el tamaño de escaneado pequeño puede prevenir eficazmente el daño de la muestra desencadenada por aFM. Se recomienda reducir estos dos parámetros en cualquier cambio de muestra.
      7. En la ventana Rampa, establezca el tamaño de la rampa en 5 m.
         NOTA: Es mejor establecer el tamaño de rampa más grande que la profundidad de sangría prevista para una mejor adquisición de línea base.
      8. Establezca el umbral de trig en el máximo.
      9. Establezca Número de muestras en 4608.
      10. Opcionalmente, en la pestaña Microscopio - Parámetros de interacción, reduzca los siguientes parámetros para evitar daños fuertes en la muestra inducidos por el contacto. Establezca El punto de consigna de activación de fuerza máxima en 0,3 V (predeterminado 0,5 V). Establezca Engage int. gain en 0.5 (predeterminado 0.75). Establezca el paso de activación de SPM en 4 m (predeterminado de 15 m).
   3. Coloque y alinee la muestra debajo de la cabeza de AFM y acérquese hasta que el voladizo esté sumergido pero no en contacto con la superficie de la muestra.
      NOTA: Mientras se acerca, sople ligeramente sobre la superficie del ACM líquido hasta que se forme un puente líquido entre el voladizo y la superficie líquida. Esto generalmente evita el contacto duro.
   4. Con cuidado, acérquese manualmente hacia la muestra. Cuando el sondeo esté relativamente cerca de la superficie de muestra, haga clic en Enfoque.
   5. Al contacto, aumente gradualmente el tamaño del escaneo y/o la velocidad de escaneo hasta un equilibrio deseado sin dañar la muestra y/o el voladizo.
      NOTA: El tamaño de escaneado está limitado por la curvatura de la superficie y la rugosidad de la muestra. En el caso de IM tratadacon oryzalin, se puede lograr un área de escaneo de 50 x 50 m2 con una velocidad de escaneo de 0,3 Hz.
   6. Durante el escaneo, determine si la región de medición es la deseada. Reubique si es necesario. Cuando esté satisfecho, haga clic en el botón Apuntar y disparar para iniciar la ventana de apuntar y disparar.
   7. Antes de grabar el escaneo, elija un canal de imagen adecuado que pueda facilitar una identificación clara de los contornos de celda. A menudo, Error de fuerza pico, Módulo DMT, Módulo LogDMT o Disipación es adecuado. Especifique guardar directorio y nombre de archivo. A continuación, haga clic en Rampa en el siguiente análisis para iniciar la grabación.
      NOTA: Una cadena de un punto y tres números se agregarán automáticamente después de su nombre de archivo designado (como .000). Este número aumenta automáticamente en 1 al realizar cada repetición de escaneo guardada.
   8. Cuando se complete el análisis, la interfaz del software se redirigirá automáticamente a la ventana de rampa. Haga clic en la imagen escaneada para especificar las posiciones que desea aplicar sangría.
      NOTA: Antes de registrar las sangrías, es mejor elegir varios puntos de referencia para realizar sangrías de prueba haciendo clic solamenteen rampa, en caso de que se requiera la alternancia de parámetros (para el tamaño de la rampa, la posiciónpiezoeléctrica, etc.). La profundidad de la sangría debe ser mayor que el espesor de la pared celular (idealmente determinado por separado por microscopía electrónica de transmisión).
   9. Elija al menos tres sitios de sangría por celda cerca de su centro de bary y repita la sangría tres veces por sitio. Esto produciría al menos nueve curvas de fuerza por celda para su posterior análisis. Cuando esté satisfecho con la ubicación del sitio de sangría, haga clic en Rampa y captura. Las curvas de sangría de fuerza se guardan automáticamente en el directorio designado.
   10. Cuando se completen las rampas, reubique en una posición diferente para la medición de baldosas, o retraiga el cabezal de escaneado y cambie la muestra.
   11. Cuando haya terminado, limpie el voladizo como en los pasos 1.3.8 y 1.3.9.
4. Análisis de datos
   1. En el software de análisis, abra el archivo *.mca. Esto muestra la posición de cada curva de fuerza en la imagen escaneada. Si lo desea, preseleccione curvas de fuerza para el análisis.
   2. Abra una curva de fuerza que se analizará, normalmente en el formato x0000y.00z, donde x es el nombre de archivo especificado en el directorio de guardado, mientras que y y z se registran automáticamente números que denotan la secuencia de sangría y el número de exploración.
   3. Haga clic en el botón Corrección de línea base y arrastre las líneas de guión azul en la curva de fuerza hasta que Extender inicio de línea base de origen y Extender detención de línea base de origen estén en 0% y 80%, respectivamente. Haga clic en Ejecutar.
      NOTA: Como alternativa, Extend Source Baseline Stop se puede establecer en valores diferentes, siempre y cuando todavía esté dentro de la línea base y no más allá del punto de contacto.
   4. Haga clic en el botón Filtro de Boxcar y haga clic en Ejecutar para suavizar la curva de fuerza.
   5. Haga clic en el botón Sangría.
      1. En la ventana Entrada, establezca la Curva activa en Extender.
      2. Establezca el Método de ajuste en Modelo linealizado e Incluya fuerza de adhesión en Sí.
      3. Establece Límite de Ajuste de Fuerza Máxima en 99% y Límite de Ajuste de Fuerza Mínima en 75%.
      4. Establezca Ajustar modelo en Rigidez (Lineal).
         NOTA: Esta configuración calculará la rigidez aparente k para la deducción de la presión del turgor. En este ejemplo, los límites de ajuste reflejan un ajuste de rigidez de alrededor de 1,5 m de profundidad de sangría.
   6. Las curvas de fuerza se pueden analizar por lotes. Haga clic en el botón Ejecutar historial, especifique el directorio de informes y agregue todas las demás curvas de fuerza que requieran el mismo tratamiento. Cuando esté satisfecho, haga clic en Ejecutar. De forma predeterminada, el ajuste se almacenará como un archivo *.txt.
   7. Cuando k está ajustado por lotes, haga clic en Historial 5 Sangría para volver a la ventana de sangría.
      1. Cambia Límite de Ajuste de Fuerza Máxima a 10% y Límite de Ajuste de Fuerza Mínima a 0%.
      2. Establezca Ajustar modelo en Hertziano (esférico).
         NOTA: Esto calculará la pared celular Módulo E de Young para la deducción de presión de turgor. En este ejemplo, los límites de ajuste reflejan un ajuste hertziano (mediante sonda esférica) de alrededor de 0,4 m de profundidad de sangría.
   8. Repita el paso 2.4.6 para el ajuste por lotes para E.
   9. Abra el archivo *.00z (z es el número de escaneo registrado automáticamente) para mostrar los diferentes canales de escaneado. En la ventana Canal de altura, haga clic en el botón Sección. Esto permitirá la medición de la curvatura de la superficie de la muestra que se requiere para la deducción de la presión del turgencia.
      1. Dibuje una línea a través del eje largo de una celda, mueva los límites de la línea de guión a los bordes de la celda y registre el valor de Radio r₁. Repita esto para que el eje corto recupere el radio r₂. Calcular la curvatura media de la superficie de la celda:_M y curvatura gaussiana ,_G, utilizando la medición de dos radios de la siguiente manera:
         Y 
   10. Deducir la presión de turgencia P utilizando el modelo de carcasa delgada publicado⁹ de la siguiente manera:
        
       Con
       
       donde t es el espesor de la pared celular determinado por, por ejemplo, microscopía electrónica.
       NOTA: La deducción de la presión del turgencia es un proceso de ajuste, donde se requieren iteraciones. Por lo general, cuatro iteraciones son capaces de reproducir productos estables, sin embargo, se pueden hacer más iteraciones (por ejemplo, 100 veces).
   11. Calcular la media E, k y P por celda. Además, registre la variabilidad intracelular (por ejemplo, desviación estándar) para la documentación.

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Resultados

La Figura 1A y la Figura 1B muestran una captura de pantalla que ilustra el resultado de los pasos 1.3.4 a 1.3.6 del protocolo, utilizado para localizar una región de interés donde adquirir el mapa QI. Vale la pena mencionar que la región de interés ha sido elegida para no estar sobre una superficie inclinada (es decir, lo más plana posible). En realidad, como se notó en Routier et al.⁵, si el eje de...

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Discusión

La aparición de formas en las plantas está determinada principalmente por la tasa coordinada y la dirección del crecimiento durante el tiempo y el espacio. Las células vegetales están encerradas en una pared rígida de células hecha de una matriz polisacárdica, que las pega. Como resultado, la expansión celular se controla mediante el equilibrio entre la presión del turgencia tirando de la pared celular, y la rigidez de la pared celular resistiéndose a esta presión. Con el fin de entender los mecanismos subyac...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.