Использование атомной микроскопии силы для измерения механических свойств и тургорского давления растительных клеток и тканей растений

Резюме

Здесь мы представляем атомную силовую микроскопию (AFM), функционируют как нано- и микро-индентационный инструмент на клетках и тканях. Прибор позволяет одновременно приобрести 3D-топографию образца и его механические свойства, включая модуль клеточной стенки Янга, а также тургорное давление.

Аннотация

Мы представляем здесь использование атомной микроскопии силы для интовенции ткани растений и восстановить его механические свойства. Используя два различных микроскопа в режиме отступа, мы показываем, как измерить упругий модуль и использовать его для оценки механических свойств клеточной стенки. Кроме того, мы также объясняем, как оценить давление тургора. Основные преимущества атомной микроскопии силы в том, что она является неинвазивной, относительно быстрой (5–20 минут) и что практически любой тип живой ткани растений, который поверхностно плоский, может быть проанализирован без необходимости лечения. Разрешение может быть очень хорошим, в зависимости от размера наконечника и от количества измерений на единицу площади. Одним из ограничений этого метода является то, что он дает только прямой доступ к поверхностным слоям клеток.

Введение

Атомная микроскопия силы (AFM) принадлежит к семейстств микроскопии зонда (SPM), где наконечник с радиусом обычно немного nanometers сканирует поверхность образца. Обнаружение поверхности достигается не оптическими или электронными методами, а силами взаимодействия между кончиком и поверхностью образца. Таким образом, этот метод не ограничивается топографической характеристикой поверхности образца (3D-разрешение, которое может сойти на несколько нанометров), но также позволяет измерять любые типы взаимодействуютных сил, таких как электростатические, ван дер Ваалс или контактные силы. Кроме того, наконечник может быть использован для применения сил на поверхности биологического образца и измерения результирующей деформации, так называемой "отступной", для определения его механических свойств (например, модуля Янга, вискоэлясические свойства).

Механические свойства стенок растительных клеток необходимы для учета при попытке понять механизмы, лежащие в основе процессов развития^1,2,3. Действительно, эти свойства жестко контролируются во время развития, в частности, так как размягчение клеточной стенки требуется, чтобы позволить клеткам расти. AFM может быть использован для измерения этих свойств и изучения того, как они меняются между органами, тканями или стадиями развития.

В этой статье мы описываем, как мы используем AFM для измерения как механических свойств стенки клеток, так и давления тургора. Эти два приложения демонстрируются на двух различных микроскопах AFM и подробно описаны здесь после.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1.Измерение механических свойств стены клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Представлен пример развивающегося гиноэкиума арабидопсиса.

1. Подготовка биологических образцов
   1. Соберите закрытый цветочный бутон на стадии от 9 до 10 (около 0,5 мм в длину) в соответствии с опубликованными этапами определения для Arabidopsis⁴. Под бинокль, используя тонкие пинцеты, тщательно откройте бутон, чтобы проверить стадию развития и собрать gynoecium, расположенный в центре цветка.
   2. Положите gynoecium на двойную боковую ленту, расположенную в центре крышки небольшой чашки Петри (диаметр 5 см).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы биосовместимый клей может также использоваться для более эффективной иммобилизации образца по отступу.
   3. Быстро добавляйте воду до тех пор, пока образец не будет полностью покрыт. Это позволяет избежать обезвоживания и уменьшает прилипание наконечника к образцу. Кроме того, погрузить образец в жидкой среде, таких как Arabidopsis вершины культуры среды⁵.
2. Калибровка AFM
   1. Установите кантилевер пружины постоянной k достаточно высоко, чтобы деформация поверхности образца до желаемого отступа, но не слишком высока, чтобы избежать потери чувствительности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как грубое эмпирическое правило, если модуля Молодого образца известна, то порядок величины весенней константы может быть выбран в качестве kqE , где q является желаемым отступом.
   2. Используйте R 400 нм сферической кончик с 15 мкм кончик-кантилевер расстояние.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Радиус наконечника напрямую связан с боковой разрешением. Как правило, для отступов на биологические материалы, выбрать округлые советы (R больше, чем 10-20 нм) или коллоидных зондов. Малые коллоидные зонды могут быть сложно использовать из-за небольшого расстояния между кончиком и кантилевер, который может коснуться поверхности образца.
   3. Включите программное обеспечение и поместите голову горизонтально не менее 2-3 ч перед экспериментом: это позволит головке тепловой и избежать термически индуцированных кантилевер-лазерных относительных движений. Если микроскоп оснащен модулем CellHesion (расширение имеющегося диапазона пьезо до 100 мкм вместо 15 мкм), сначала включите контроллер, а затем выберите режим CellHesion при запуске программного обеспечения.
   4. Установите кантилевер на стеклянный блок и смонтируйте блок на голове. Поместите капельку нескольких микролитров ультрачистой воды на кончике, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, когда кончик окунается в воду.
   5. Поместите твердый образец (очищенный стеклянный слайд или сапфир) и добавьте 30-50 л ультрачистой воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь процедура калибровки – это иногда называемая контактная калибровка. Во-первых, кривая силы производится на жесткой и плоской поверхности, а затем регистрируется спектр колебаний термически возбужденного кантилевера для расчета весенней константы. Существуют и другие протоколы калибровки, которые будут кратко описаны в обсуждаемом пункте.
   6. Поместите голову на сцену (будьте осторожны, чтобы поднять двигатели достаточно высоко). Используйте оптическое изображение, чтобы примерно поместить лазер на кантилевер.
      1. Переместите лазер вдоль основной оси кантилевера, отслеживая сигнал суммы на фотодиоде.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании стандартных кантилеверов должна быть получена сумма, превышающее 0,5 В.
      2. Переместите лазер в другом направлении и максимизируйте сигнал суммы, чтобы расположить лазер в середине кантилевера. Это позволит свести к минимуму перекрестный разговор между боковой и вертикальной отклонения.
   7. Измерение чувствительности отклонения
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фотодиод считывает лазерное смещение и обеспечивает сигнал в вольтах. Для того, чтобы быть в состоянии измерить отклонение в метрической единице, чувствительность отклонения должна быть измерена.
      1. Установите прибор в контактную спектроскопию силы. Установите относительную точку установки до 2 V, длина до 0,5 мкм, и расширьте скорость до 2 мкм/с (коэффициентвыборки до 10000 Гц) и выберите замкнутый цикл.
      2. Откройте диспетчер калибровки и выберите контактную часть кривой силы (которая должна быть линейной), чтобы сделать линейную форму: обратная сторона наклона дает чувствительность отклонения. Фотодиодное чтение теперь откалибровано в метрической единице.
   8. Определение весенней постоянной. В менеджере калибровкивыберите Констант Spring для запуска приобретения теплового спектра. Чтобы усреднеть сигнал в течение более длительного времени, выберите символ . Спектр мощности термически возбужденного кантилевера может показать несколько пиков; нарисовать выбор вокруг одного размещены на самой низкой частоте, чтобы соответствовать ему.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если тепловая мелодия выполняется в жидкости, то пик резонанса будет шире, а его частота снижена по сравнению с номинальной.
3. Установка и приобретение эксперимента силовой спектроскопии
   1. Поместите образец на этапе AFM и поместите голову над образцом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова была убрана достаточно, чтобы избежать жесткого контакта между кончиком и поверхностью образца.
   2. Пусть кантилевер термически в течение нескольких минут.
   3. В режиме «Я» подход с силой Setpoint 50 nN.
   4. Установите длину 4 мкм и область сканирования до 80 х 80 мкм² с числом пикселей 40 х 40. В панели настройки расширенных изображений установите режим на постоянную скорость. Установите скорость расширения и убраны до 200 мкм/с, а пробные ставки до 25 кГц.
   5. Начните сканирование и используйте это быстрое сканирование с низкой силой для проверки хода образца. Убедитесь, что отсканированная область свободна от мусора или отклоняемых ячеек, и найдите интересуемый регион как можно более плоский для выполнения измерений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы оценить реальный наклон образца, выравнивание линии должно быть установлено на OFF или к постоянному. Чрезмерный угол наклона между оси отступа и поверхностью будет иметьвлияние на измеренный модуля 5.
   6. После того, как область интереса была расположена, выберите область 40 х 40 до 60 х 60 мкм² вокруг него и увеличить число пикселей, чтобы достичь 2 пикселей / мкм. Увеличьте точку установки до 500 нм, чтобы получить 100-200 нм отступов. При необходимости отрегулируйте это значение в начале эксперимента. Уменьшите длину до 2 мкм. Уменьшите и увеличьте скорость до 100 мкм/с и увеличьте скорость выборки до 50 кГц.
   7. Начните сканирование и сохраните выход (обычно составленный файлом Изображения и файлом данных).
   8. В конце дня измерения, удалить наконечник держателя и промыть его осторожно с ультрачистой водой и 70% EtOH.
   9. Высушите и удалите кантилевер. Для дальнейших экспериментов с тем же наконечником, рассмотреть очистку его с мокрым очистки протокола и, если возможно, последующей плазмы O₂ лечения. Не дайте воде высохнуть на кантилевере и/или наконечнике, чтобы избежать кристаллизации соли.
4. Анализ данных (для версии программного обеспечения обработки данных 6.x)
   1. Открытое программное обеспечение обработки данных и загрузите файл данных.
   2. Нажмите на Используйте эту карту для кнопки обработки пакетов, чтобы использовать одни и те же параметры анализа на всех кривых карты.
   3. В заранее определенном процессе нагрузкивыберите подходят Hertz.
   4. Используйте первую вкладку для проверки или изменения параметров калибровки.
   5. Во второй вкладке удалите смещение (или смещение плюс наклон) из базовой линии, чтобы установить его среднее значение до 0.
   6. В третьей вкладке оцените положение точки контакта (POC), рассматривая ее как первую точку, пересекающую силу 0 при сходе с значения установленной точки по кривой расширения.
   7. Вкладка Вертикальная позиция наконечника вычисляет движение наконечника путем вычитания отклонения кантилевера от измеренной высоты. На этом этапе используйте Негладную высоту (сырые данные) для следующей подгонки, проверяя соответствующий флажок.
   8. В вкладке Elasticity подходят, выберите соответствующую модель подходят. Если на кривых втягивания (соответствующем менее чем 10% от силы набора или максимальной средней силе в выбранной глубине отступа нет или слабой адгностии) не отображается или слабая сцепления, то следует установить тип модели на Герц/Снеддон и протянуть кривую. В случае более сильной адгезии, модель DMT, которая выступает за модель Derjaguin-Muller-Toporov, должна быть предпочтительной и подходит для выполнения на кривых втягивания (обратитесь к руководству для получения подробной информации о доступных контактных моделях и связанных с ними формулах).
      1. Установите геометрические параметры наконечника на основе номинальной формы кончика. Здесь, Совет форма сферы и Совет Радиус составляет 400 нм.
      2. Установите коэффициент Пуассона до 0,5, как это обычно делается для биологического материала (соответствующего несжимаемым материалам).
   9. Подходит до конкретных отступов. По умолчанию пригонка выполняется по всей кривой. Если подгонка должна быть выполнена до определенного отступа, сначала проверьте флажок Shift Curve; это изменит происхождение кривой на основе новых определенных базовых значений и значений POC.
      1. Добавьте вторую процедуру соответствия упругости, нажав на значок на главном окне.
      2. Установите еще раз все параметры подгонки и укажите в X мин желаемый отступ. Добавьте столько шагов по мере необходимости (2-3 шага должно быть достаточно) для уточнения определения позиции POC, а затем и расчетной глубины отступа. Процесс может быть сохранен в этой точке.
   10. Нажмите на Keep и применить ко всем, чтобы итерировать предыдущие шаги на всех кривых карты.
   11. Сохранить результаты. Изображение и файлы .tsv будут получены.

2. Мера тургорского давления

ПРИМЕЧАНИЕ: Представлен пример оризалинского соцветия меристем арабидопсиса.

1. Подготовка биологического образца
   1. Соберите Arabidopsis соцветия меристем (IM) лечение с микротубулом деполимеризации препарата оризалин из завода in vitro, выращенного на среде, содержащей полярный ингибитор транспорта auxin 1-N-Naththylphthalamic кислоты (NPA) после опубликованного метода ⁶.
   2. Монтаж образца im после одного из двух вариантов
      1. Для долгосрочного мониторинга: смонтировать образец в чашке Петри, содержащейарабидопсис апект культуры среды (ACM) 7,⁸ и 0,1% смеси сохранения растений (PPM), для предотвращения загрязнения. Приостановить наконечник чата над поверхностью ACM и поддерживать базу чата с падением 2% агарозы.
      2. Для измерения с быстрым решением изменения: смонтировать образец в Петри-блюдо проведения небольшой кусок клей мастики, и быстро запечатать разрыв между мастикой и образца базы с био-совместимым клеем. Подождите, пока клей затвердеет (менее 2 мин), затем погрузите образец в жидкий ACM, содержащий 0,1% PPM.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что поверхность образца не покрыта агарозой или клеем при фиксации базы образца. Измерение aFM тургорского давления требует стабильного монтажа образца, а предыдущие методы монтажа обеспечивают приемлемую стабильность. В зависимости от образца могут использоваться другие методы монтажа, такие как двусторонняя лента, полилизин и т.д.
2. Калибровка AFM
   1. Включите программное обеспечение для приобретения AFM и выберите режим измерения PeakForce (большая амплитуда).
   2. Выполните калибровку по тому же принципу, описанному в шагах 2.1 к 2.6.
   3. В окне параметров проверки установите размер сканирования до 0. В окне Ramp установите размер Ramp между 200 нм и 500 нм, порог Trig между 2 V и 5 V и количество образцов до 2048 или выше.
   4. Выровняйте кончик кантилевера с образцом калибровки и нажмите Подход.
   5. При контакте, перейдите к окну Ramp и нажмите кнопку Непрерывный пандус. На линейном режиме кривой определите наклон, нажав на кнопку Чувствительность обновления. Повторите измерение чувствительности отклонения несколько раз и вручную обновите калибровку со средним измерением, открыв детектор вкладки из меню Калибрация.
   6. Удалите головку AFM и удалите образец калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается полностью отозвать голову AFM, выбрав вкладку Этап инициализации для предотвращения случайного жесткого контакта при изменении образца.
3. Установка и приобретение эксперимента силовой спектроскопии
   1. Если образец еще не погружен, погрузите его с жидким ACM, содержащим PPM.
   2. В программном обеспечении для приобретения укажите параметры измерения следующим образом:
      1. В окне параметра Check установите константу Spring к кантилеверской пружинной константе или определенной константе пружины, как в шаге 2.8. В этом примере он установлен на уровне 42 Н/м.
      2. В этом примере установите радиус наклона до 400 нм.
      3. Установите соотношение образца Пуассона к 0,5, так как вода вносит в основном тургор давление.
      4. Установите sample/Line до 128 для обеспечения быстрого приобретения.
      5. Установите скорость сканирования до 0,2 Гц.
      6. Установите размер сканирования до 1 мкм.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Установка скорости сканирования и размер сканирования небольшой может эффективно предотвратить AFM сканирования сконсированных повреждения образца. Рекомендуется уменьшить эти два параметра при любом изменении образца.
      7. В окне Ramp установите размер Ramp до 5 мкм.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше установить размер рампы больше, чем предполагалось глубину отступа для лучшего базового приобретения.
      8. Установите порог Trig до максимума.
      9. Установить количество образцов до 4608.
      10. Дополнительно, во вкладке Microscope и Engagement, уменьшите следующие параметры, чтобы предотвратить сильное повреждение образцов, вызванных контактом. Установите пиковую точку force Engage до 0.3 V (по умолчанию 0.5 V). Установить Engage int. увеличение до 0,5 (по умолчанию 0,75). Установите SPM включить шаг до 4 мкм (по умолчанию 15 мкм).
   3. Поместите и выровняйте образец под головкой AFM, и подход до тех пор, пока кантилевер не будет погружен, но не соприкасается с поверхностью образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приближении, слегка удар по поверхности жидкости ACM до жидкого моста образуется между кантилевером и жидкой поверхности. Это обычно предотвращает жесткий контакт.
   4. С осторожностью, вручную подходить к образцу. Когда зонд находится относительно близко к поверхности образца, нажмите Подход.
   5. При контакте постепенно увеличивайте размер сканирования и/или скорость сканирования до желаемого баланса, не повреждая образец и/или кантилевер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер сканирования ограничен кривизной поверхности и шероховатостью образца. В случае обицалин-обработанный IM, 50 x 50 мкм² область сканирования может быть достигнута с скоростью сканирования 0,3 Гц.
   6. При сканировании определите, является ли область измерения желаемой. При необходимости переместите. Когда удовлетворены, нажмите кнопку точка и стрелять, чтобы инициировать точку и стрелять окно.
   7. Перед записью сканирования выберите соответствующий канал изображения, который может облегчить четкое определение контуров клеток. Часто подходит пиковая силовая ошибка, DMT Modulus, LogDMT Modulus или Dissipation. Укажите сохранение каталога и имени файла. Затем нажмите Ramp на следующем сканировании, чтобы начать запись.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Строка точки и три числа будут автоматически добавлены после вашего назначенного имени файла (например.000). Это число автоматически увеличивается на 1 при каждом сохраненном повторении сканирования.
   8. По завершении сканирования интерфейс программного обеспечения будет автоматически перенаправлен на окно Ramp. Нажмите на отсканированное изображение, чтобы указать позиции на отступ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед записью отступов, лучше выбрать несколько ориентиров для выполнения тестовых отступов, нажав толькоRamp, в случае, если параметр чередования не требуется (для размера Ramp, положение Piezoи т.д.). Глубина отступа должна быть больше толщины клеточной стенки (в идеале определяется отдельно электронной микроскопией передачи).
   9. Выберите по крайней мере три места отступов на ячейку вблизи барицентра и повторите отступы три раза на сайте. Это даст по крайней мере девять кривых силы на ячейку для дальнейшего анализа. При удовлетворенности отступами место размещения, нажмите Ramp и захвата. Кривые отваги силы автоматически сохраняются в назначенном каталоге.
   10. Когда пандусы будут завершены, переместите в другое положение для измерения плитки, или убирайте сканировать голову и изменять образец.
   11. После завершения, очистить кантилевер, как в шагах 1.3.8 и 1.3.9.
4. Анализ данных
   1. В программном обеспечении для анализа откройте файл q.mca. Это показывает положение каждой кривой силы на отсканированном изображении. При желании предварительно выберите кривые силы для анализа.
   2. Откройте одну кривую силы для анализа, как правило, в формате x0000y.00z, где x является указанным именем файла в каталоге сохранения, в то время как y и z автоматически регистрируются числа, обозначающие последовательность отступов и номер сканирования.
   3. Нажмите кнопку коррекции базовой линии и перетащите синие линии тире на кривой силы до тех пор, пока Extend Source Baseline Start и Extend Source Baseline Stop не будут на уровне 0% и 80% соответственно. Нажмите Выполнить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, extend Source Baseline Stop может быть установлен на разных значениях, если он все еще находится в пределах базовой линии, а не за пределами точки контакта.
   4. Нажмите кнопку Boxcar фильтр и нажмите Выполнить, чтобы сгладить кривую силы.
   5. Нажмите кнопку Indentation.
      1. В окне ввода установите активную кривую для расширения.
      2. Установите метод Fit для линейной модели и включите силы адгезии, чтобы Да.
      3. Установите Max Force Fit Boundary до 99% и Min Force Fit Boundary до 75%.
      4. Установите fit Model to Stiffness (линейный).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка будет вычислять очевидной жесткости k для тургора вычета давления. В этом примере границы подгонки отражают припадок жесткости около 1,5 мкм глубины отступов.
   6. Кривые силы могут быть проанализированы в пакете. Нажмите кнопку Run History, укажите каталог отчетов и добавьте все другие кривые силы, которые требуют такого же обращения. Когда удовлетворены, нажмите Run. По умолчанию пригонка будет храниться в виде файла q.txt.
   7. Когда пакет k установлен, нажмите История 5 отступов, чтобы вернуться в окно отступа.
      1. Измените максимальную границу fit Force до 10% и Min Force Fit Boundary до 0%.
      2. Установите Fit Model для Hertzian (Сферический).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит вычислить модуля клеточной стенки Янга E для вычета давления тургора. В этом примере границы подгонки отражают герцианский подходят (с помощью сферического зонда) глубины около 0,4 мкм отступа.
   8. Повторите шаг 2.4.6 для партии, пригодной для E.
   9. Откройте файл q.00z (z является автоматически зарегистрированным номером сканирования) для отображения различных каналов сканирования. В окне канала Высота щелкните кнопку раздела. Это позволит измерять кривизну поверхности образца, которая необходима для вычета давления тургора.
      1. Нарисуйте линию по длинной оси одной ячейки, переместите границы линии тире к краям ячейки и запишите значение Радиуса r1. Повторите это для короткой оси, чтобы получить радиус r₂. Рассчитайте поверхность ячейки, среднее кривизну _М и гауссианской кривизны G с помощью измерения двух радиусов следующим образом:
         И 
   10. Вывод тургор давления P с помощью тонкой оболочки модели опубликовано⁹ следующим образом:
        
       С
       
       где толщина клеточной стенки определяется, например, электронной микроскопией.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Вычет тургорского давления является подходящим процессом, где требуются итерации. Четыре итерации, как правило, способны воспроизвести стабильный продукт, однако можно сделать больше итераций (например, 100 раз).
   11. Рассчитайте среднее e, k и P на ячейку. Также зарегистрируйте внутриклеточную изменчивость (например, стандартное отклонение) для документации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1A и рисунке 1B показан скриншот, иллюстрирующие результат шагов от 1.3.4 до 1.3.6 протокола, используемого для определения региона, интересующего, где можно приобрести карту QI. Следует отметить, что интересующий регион был выбран д...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Появление форм в растениях в основном определяется скоординированной скоростью и направлением роста во времени и пространстве. Растительные клетки заключены в жесткую клеточную стенку из полисахаридной матрицы, которая склеивает их вместе. В результате, расширение клетки контролиру...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth medium
1,000x vimatin stock solution			used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA)	Sigma-Aldrich/Merck	132-66-1	add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring.
Agar-agar	Sigma-Aldrich/Merck	9002-18-0	add to Arabidopsis medium, 1% w/v.
Agarose	Merck Millipore	9012-36-6	used to make solid ACM, 0.8% w/v.
Arabidopsis medium	Duchefa Biochimie	DU0742.0025	For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L.
Calcium nitrate tetrahydrate	Sigma-Aldrich/Merck	13477-34-4	add to Arabidopsis medium, 2 mM.
MURASHIGE & SKOOG MEDIUM	Duchefa Biochimie	M0221.0025	Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2 g/ L.
N6-benzyladenine (BAP)	Sigma-Aldrich/Merck	1214-39-7	used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Oryzalin	Sigma-Aldrich/Merck	19044-88-3	for oryzalin treatement, 10 μg/mL.
Plant preservation mixture (PPM)	Plant Cell Technology		used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring.
Potassium hydroxide	Duchefa Biochimie	1310-58-3	used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8.
Sucrose	Duchefa Biochimie	57-50-1	used to make ACM, 1% w/v.
Tools for AFM
BioScope Catalyst BioAFM	Bruker		The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol.
Nanowizard III + CellHesion	JPK (Bruker)		The AFM used for measuring mechanical properties.
Patafix	UHU	D1620
Reference elasitic structure	NanoIdea	2Z00026
Reprorubber-Thin Pour	Flexbar	16135	biocompatible glue.
Spherical AFM tips	Nanoandmore	SD-SPHERE-NCH-S-10	Tips used for measuring mechanical properties.