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摘要

介绍了一种使用电压敏感染料的脑切片可重复、稳定的光学记录方法。本文介绍了电压敏感染料染色和记录光信号使用传统的海马切片制剂。

摘要

宽场单光子电压敏感染料(VSD)成像脑切片制剂是评估神经回路功能连接的有用工具。由于光信号的分量变化,很难将这种方法用作定量测定。本文介绍了特殊的光学和切片处理系统,使该技术稳定可靠。本文详细介绍了VSD染色海马切片的切片处理、染色和记录。该系统长期保持生理条件,具有良好的染色,并防止切片在记录过程中的机械运动。此外,它还能用少量的染料染色切片。光学器件在低放大倍率下实现高数值光圈,从而能够以10 kHz的最大帧速率记录VSD信号,具有100像素x100像素的空间分辨率。由于帧速率和空间分辨率高,该技术允许应用后记录滤波器,提供充足的信噪比,以评估神经回路的变化。

引言

宽场单光子电压敏感染料(VSD)成像的散装染色脑切片制剂已成为一个有用的定量工具,以评估神经回路1,2,3,4的动态.在分析了膜激发5、6、7、VSD成像引起的光学特性变化后,科恩等人于20世纪70年代初首次描述了VSD成像。 9;当染料直接探测膜电位变化(即神经元的主要信号)时,它是实时监测大脑功能的合适方法。

最早的VSD具有理解大脑系统的理想特征,如快速时间常数,以跟踪神经元膜电位事件的快速动力学,以及线性随膜电位变化9,10,11,12,13,14,15.与其他成像实验类似,这种技术需要广泛的特定调谐,如照相机、光学、软件和切片生理学,以达到预期的结果。由于这些技术缺陷,对于大多数不专门从事这种技术的实验室来说,在初步努力期间的预期效益并不一定实现。

技术难度的主要原因是VSD在切片制剂的批量染色时对膜潜在变化的灵敏度较低。光学信号的大小(即荧光的分量变化)通常在生理条件下是控制(F0)信号的10-4-10-3。神经元膜电位变化的时间尺度约为毫秒到几百毫秒。为了测量神经元膜电位的变化,用于录制的摄像机应该能够获取高速(10 kHz 到 100 Hz)的图像。VSD 的低灵敏度和跟随神经信号所需的速度要求在高速的摄像机上收集大量光,并且具有高信噪比 (S/N)2、16。

记录系统的光学元件也是确保收集足够光线和改善S/N的关键元件。光学器件实现的放大倍率通常过低,例如 1 倍到 10 倍,以可视化局部功能神经回路。例如,为了可视化海马电路的动态,大约5的放大倍率是合适的。这种低放大倍率具有低荧光效率;因此,先进的光学设备将有利于这种记录。

此外,切片生理学也是必不可少的。由于成像分析要求切片完好无损,因此需要仔细处理切片。此外,为维持切片的可存活性而采取的措施,亦是重要的18。

本文介绍了切片制备、VSD 染色和测量的协议。本文还概述了对VSD、成像器件和光学器件的改进,以及对实验系统的其他改进,这些改进使这种方法能够用作一种简单、强大和定量的测定,用于可视化大脑功能的修饰19,20,21,22,23,24,25。该技术还可用于海马切片1的CA1区域的长期强权。此外,该技术在光记录单个神经细胞26的膜电位方面也很有用。

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研究方案

所有动物实验均按照德岛邦里大学动物护理和使用委员会批准的规程进行。以下切片制备协议几乎是一个标准程序27,但修改是VSD染色和记录的协议。

1. 实验前的准备

  1. 准备股票A(表1),股票B(表2)和股票C(表3)溶液,并存放在冰箱中。
  2. 准备1L的人工脑脊液(ACSF)(表4,见步骤3),并保存在冰箱中。
  3. 准备1L的改性ACSF(表5),并保存在冰箱里。
  4. 在 2 mL 小瓶中分配 500 μL 胎儿血清 (FBS) 等分,并储存在冰箱中。
  5. 将 4% 的琼脂粉溶解在 ACSF (约 120 mL) 中的微波炉中,然后倒入 90 mm 一次性培养皿中。在进一步使用之前,应冷藏琼脂板。
  6. 在实验前一天将下列物品放入冰箱中:手术托盘、切片器容器和铝冷却块(120 x 120 x 20 mm3)。
  7. 确保有足够的有机玻璃环,带用于切片处理系统的膜过滤器17、28(参见步骤 6.12)。
  8. 在微波炉中将2%的琼脂粉溶解在3M KCl的50 mL中。使用用于接地电极的微移液器,在 200 μL 吸头中获取约 85 μL 的暖琼脂-KCl 溶剂。将尖端分离到静止的琼脂 3 M KCl 凝胶中。重复此步骤,用 2% 的琼脂填充约 20-40 个提示。

2. 准备VSD(di-4-ANEPPS)库存解决方案

  1. 用超纯水制备1mL的10%聚乙氧-酯油用油溶液。
  2. 将1mL乙醇加入一小瓶di-4-ANEPPS(5毫克小瓶),涡旋和声波10分钟。该溶液将变成深红色,可能残留的di-4-ANEPPS晶体。
    注:此步骤中使用的乙醇应新鲜打开。
  3. 将溶液转移到带 O 型环的 2 mL 微管中。向下旋转溶液,加入500 μL的10%聚乙氧酸酯油液。
    注:染料是高度亲脂的。DMSO 和 poloxamer 也可用于溶解 di-4-ANEPPS,但就膜电位变化时的光信号而言,我们发现使用乙醇-聚乙氧基酯油可产生更好的信噪比。这可能与溶剂向细胞膜的转移率有关。
  4. 涡旋和声波,直到染料完全溶解。
  5. 避免暴露在光线下,并保存在冰箱中。请勿存放在冰箱中。这种股票可以持续几个月。
    注:在实验当天,按照步骤 3-9 操作。

3. ACSF (1 L) 的每日准备 (表 4)

  1. 称量NaCl,NaHCO3,和葡萄糖在烧瓶。
  2. 将 950 mL 的蒸馏水加入烧瓶,然后开始冒泡,使用 95% O2/5% CO2气体。
  3. 将 2.5 mL 的 A 溶液添加到烧瓶中,并在室温下孵育约 10 分钟。
  4. 将 2.5 mL 的 C 库存溶液添加到烧瓶中。
  5. 加入蒸馏水,使溶液为1升。

4. 染色 VSD 溶液的每日准备

  1. 在超音速器中将 500 μL 的 FBS 和 VSD 库存溶液(步骤 2)中进行 5 分钟声波处理。
  2. 将 500 μL 新鲜制备的 ACSF 添加到 FBS 小瓶中。
  3. 将20(小鼠)或40(大鼠)μL VSD库存溶液加入小瓶。
  4. 超声波和涡旋小瓶,直到溶液变成淡橙色。

5. 手术准备

  1. 将 100 mL 的冷冻 ACSF 分别放入 300 mL 不锈钢容器、300 mL 烧杯和塑料容器中,并将其放入冰箱中。将150 mL的冷冻改性ACSF(表2)倒入另一个烧杯中,并放入冰柜中。等待解决方案冷却;所花时间应事先测量和确定。
  2. 折叠以将剃须刀刀片(碳钢,工业级 0.13 mm 厚,两侧刀片)折成切片机的一半。
    注:另一半可用于使用适当的刀片支架进行解剖。
  3. 从 ACSF 4% 琼脂板上准备一个带调整夹具的块(图 1)。
  4. 准备一个潮湿的孵育室(界面类型室;一个经过改良的1.2 L紧闭密封盒,带有硅胶包装),以保持大脑切片在生理上存活(图2);在小容器中加入 ACSF,在 95% O2/5% CO2气体中加入碳酸盐,并在顶部填充 90 mm x 20 mm 培养皿。
    注:应将较小的培养皿(60 mm x 20 mm)放在 90 mm 盘的中心,以支持盘子上的滤纸。
  5. 将盒子放在加热装置上,等待 20 分钟将其加热至 28°C。
  6. 将碎冰加入切片机的容器。将以下仪器放入不锈钢桶(小)冰上:手术刀、刀片支架、环钳、琼脂块和切片机阶段。保持冷冻ACSF和改良的ACSF在冰和气泡与95%O2/5% CO2气体(又名卡博根)。
  7. 将以下乐器放入大桶(大):剪刀(大、小)、钳子、铲子、勺子和对角钳。

6. 外科手术(老鼠)

  1. 在烟罩中使用烟胶麻醉小鼠。通过检查动物脚趾捏时的踏板反射来评估麻醉水平。
  2. 将鼠标斩首,将头部浸入冰冷的 ACSF 中,放在不锈钢手术托盘中。
  3. 在1分钟内提取大脑,并将其放入装有冷冻ACSF的烧杯5分钟。
  4. 把大脑从烧杯里拿出来,用手术刀修剪大脑块(图3A)。
  5. 将大脑块放在 4% 的琼脂块上(步骤 5.3,图 3B)。两个半球都可以安装在琼脂块上。用滤纸擦拭块中多余的 ACSF。
  6. 将薄胶(超级胶水)涂在切片台上。将琼脂块放在其上,并用滤纸擦拭多余的粘合剂。
  7. 使用脑琼块顶部的移液器轻轻涂抹少量冰冷的 ACSF (+5 mL)。这将有助于巩固多余的超级胶水,防止胶水覆盖大脑和干扰切片。
  8. 将切片器表固定到切片器托盘 (图 3C) 并倒入修改后的 ACSF。
  9. 将切片器设置为低速,刀片频率最大。
  10. 将切片厚度设置为 350-400 μm 并开始切片(图 3C)。将切片按顺序放置在切片托盘的角落,以便可以轻松分辨切片的深度。通常可以从一个半球获得三到五个切片。
  11. 使用 30 G 针头切断脑干部分 (图 3D)。
    注:如有必要,应在双目显微镜下对脑切片进行显微手术,如 CA3-CA1 边界之间的切口。
  12. 使用小笔尖的油漆刷,将切片放在膜过滤器的中心(0.45 μm 孔隙,PTFE 膜,直径 13 mm)上,用全玻璃环17(15 mm 外径、11 mm 内径、1 毫米厚度图3E) 进行。将环放在潮湿的回收室中(图2),并固定盖子以保持内部压力高。
    注:切片将在 30 分钟内粘到膜上,并可在记录室的后续步骤中使用环进行处理。无需使用权重或其他度量来保持切片原位。
  13. 调整切片在环中的方向和位置,以确保其居中居中且方向一致(请参阅步骤 9.3)。
  14. 将试样在28°C下保持30分钟,然后在室温下至少10至30分钟,以回收切片。
    注:切片现在可以保持良好的生理状态至少15小时。

7. 切片的染色和染色(小鼠)

  1. 使用微移液器将染色溶液的 100-110 μL(步骤 4)轻轻涂抹在环上的每片上。八到九片可以沾染步骤 4 中制备的一个染色溶液。将切片留20分钟进行染色。
  2. 在容器中制备 50-100 mL 的 ACSF,并将带切片试样的环放入容器中冲洗染色溶液。
  3. 将冲洗过的切片存放在另一个孵化室。在实验之前等待 1 小时以上以恢复。
    注:孵化室可以从气体中分离,在密封的条件下移动到记录位置。没有气体供应,切片至少可以存活 20 分钟。当您需要将切片移动到另一个位置进行录制时,这非常有用。

8. 实验装置的日常制备

  1. 打开放大器、计算机和摄像机系统,并检查软件是否正在运行。
  2. 将 ACSF 放入 50 mL 管中,并放入带卡博根的气泡中。
  3. 使用蠕动泵循环 ACSF。将流速调整到大约 1 mL/min。
  4. 调整吸液器的高度,使实验室内的液位始终恒定。
    注:溶液的电平对于获得稳定的记录很重要,因此,应该使用微操作器进行调整。
  5. 安装由黄色芯片组成的接地电极,其中填充了 3 M KCl 琼脂 (2%)(步骤 1.8) 进入带有 3 M KCl 溶液的 Ag-AgCl 导线的支架。
  6. 使用锥形薄管黄尖将少量 ACSF(约体积的三分之二)填充到玻璃电极中(1 mm 外径,0.78 mm 内径,用微移液器拉拔器),并将其放入电极支架中。
  7. 将支架连接到安装在操纵器中的杆上。使用放大器确保电极电阻约为 1 MΩ。
    注:长柄宽开口(4-8 μm开口)贴片式电极应适合现场记录和作为刺激电极。

9. 开始录制会话

  1. 用钳子从潮湿的室内进行切片准备。
  2. 快速将切片放在显微镜下的实验室(图4)。
  3. 将环的边缘牢固地推入硅胶 O 型环中。小心不要破坏实验室的膜或底部。
    注:在视野中刺激和记录电极的方向时,应考虑切片的方向。健康切片应粘在膜过滤器上,因此无需使用其他设备来固定切片,如重量和尼龙网。
  4. 将刺激电极和场电位记录电极的尖端置于显微镜下的切片上,并带有透射光。
  5. 使用电生理记录系统检查响应。使用给定配置确认通常(非染色)电生理记录。
    注:记录电极可以省略,但可用于检查切片的生理学。
  6. 在 10 kHz 采样时,将激发光强度调整为摄像机最大容量的大约 70-80%,在试样处与5x 水浸物镜和 1x PLAN APO 管透镜进行采样时,该容量为 13-15 mW/cm 2。激发光波长为 530 nm,发射滤波器必须大于 590 nm。
    注:使用快门将激发光量降至最低。连续的光线照射可能会恶化切片的生理。光的可能有害影响取决于光的强度和持续时间。使用电生理记录来判断光的效果。在强度为13-15 mW/cm2的情况下,约1s的曝光应该是公差的上限。
  7. 使用荧光光源调整采集系统的对焦,因为焦点可能因波长而异并开始采集。
  8. 检查图像采集软件中的数据。
    注:我们使用原始微编程包的数值分析软件进行详细分析。

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结果

图5显示了在小鼠海马切片的CA1区域对舍弗附带物进行电刺激时具有代表性的光信号。图 5A中的连续图像显示应用任何空间和时间滤波器之前的光信号,而图 5B显示应用 5 x 5 x 5 立方滤波器(高斯内核卷积、5 x 5 空间卷积和 5 到时间维度)两次。由于帧速率高(0.1 ms/frame)和高空间分辨率(100 像素 x 100 像素),滤波器...

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讨论

切片生理学对于收集正确的信号至关重要。在本议定书中使用环膜过滤系统可确保切片在整个程序2、16、17中保持健康且不变形。其他系统可用于在记录期间保持切片生理学,但切片不应在任何时候变形,因为成像需要切片的每个部分都保持健康。环形膜过滤系统也更适合染色,因为这有助于我们最大限度地减少所需的染色溶液的?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

TT 获得 JSPS KAKENHI 赠款 (JP16H06532, JP16K21743、JP16H06524、JP16K0038 和 JP15K00413)来自 MEXT,卫生、劳动和福利部(MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 和 H30 [18062156])。我们要感谢编辑(www.editage.jp)的英语语言编辑。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
High speed image acquisition systemBrainvision co. Ltd.MiCAM - UltimaImaging system
High speed image acquisition systemBrainvision co. Ltd.MiCAM 02Imaging system
Macroscepe for wide field imagingBrainvision co. Ltd.THT macroscopemacroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizerBrainvision co. Ltd.LEX-2GLED illumination
Image acquisition softwareBrainvision co. Ltd.BV-anaimage acquisition software
Multifunctional electric stimulatorBrainvision co. Ltd.ESTM-8Stimulus isolator+AD/DA converter
SlicerLeicaVT-1200Sslicer
SlicerLeicaVT-1000slicer
Blade for slicerFeather Safety Razor Co., Ltd.#99027carbon steel razor blade
Membrane filter for slice supportMerk Millipore Ltd., MA, USAOmnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,membrane filter/0.45 13
Numerical analysis softwareWavemetrics Inc., OR, USAIgorProanalysing software
Stimulation isolatorWPI Inc.A395Stimulus isolator
AD/DA converterInstrutechITC-18AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPSInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAcatalog number: D-1199VSD: Di-4-ANEPPS
PoloxamerInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPluronic F-127 P30000MPpoloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oilSigma-AldrichCremophor EL C5135polyethoxylated castor oil

参考文献

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