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Resumo

Nós introduzimos um método de gravação óptica reprodutível e estável para fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível. O artigo descreve a coloração de corante sensível à tensão e a gravação de sinais ópticos usando preparações convencionais de corte hipocampal.

Resumo

A imagem latente da tintura tensão-sensível do fóton do largo-campo único (VSD) de preparações da fatia do cérebro é uma ferramenta útil para avaliar a conectividade funcional em circuitos neurais. Devido à mudança fracionária no sinal de luz, tem sido difícil usar este método como um ensaio quantitativo. Este artigo descreve sistemas de manipulação óptica e fatia especiais, que tornam esta técnica estável e confiável. O artigo atual demonstra a manipulação, a mancha, e a gravação da fatia das fatias hippocampal VSD-manchadas em detalhe. O sistema mantém condições fisiológicas por um longo tempo, com boa coloração, e previne movimentos mecânicos da fatia durante as gravações. Além disso, permite a coloração de fatias com uma pequena quantidade do corante. O sistema ótico alcança a abertura numérica elevada na baixa ampliação, que permite a gravação do sinal de VSD na taxa de frame máxima de 10 quilohertz, com resolução espacial do pixel x 100-pixel 100. Devido à alta taxa de quadros e à resolução espacial, essa técnica permite a aplicação dos filtros pós-gravação que fornecem uma relação sinal-ruído suficiente para avaliar as mudanças nos circuitos neurais.

Introdução

A imagem latente da tintura tensão-sensível do fóton do largo-campo único (vsd) de preparações Bulk-manchadas da fatia do cérebro transformou-se uma ferramenta quantitativa útil para avaliar a dinâmica de circuitos neurais1,2,3,4 . Após a análise das alterações nas propriedades ópticas devido à excitação de membrana5,6,7, a imagem de VSD foi descrita pela primeira vez no início da década de 1970 por Cohen e outros6,7, 9.; é um método adequado para monitorar as funções cerebrais em tempo real, como o corante diretamente sonda as mudanças de potencial de membrana (ou seja, o sinal primário dos neurônios).

Os VSDs os mais adiantados possuíram as características desejáveis para compreender o sistema do cérebro, tal como um tempo-constante rápido para seguir a cinética rápida de eventos potenciais da membrana neuronal, e a linearidade com a mudança no potencial de membrana9, 10 de , 11 anos de , 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de , 15. similar a outras experiências da imagem latente, esta técnica exige uma escala larga de afinações específicas, tais como as câmeras, o sistema ótico, o software, e a fisiologia da fatia, para realizar os resultados desejados. Devido a estas armadilhas técnicas, os benefícios esperados durante os esforços iniciais não se materializam necessariamente para a maioria dos laboratórios que não se especializou nesta técnica.

A causa primordial da dificuldade técnica era a baixa sensibilidade do VSD para a mudança potencial da membrana quando aplicada à mancha maioria de preparações da fatia. A magnitude do sinal óptico (ou seja, a alteração fracionária na fluorescência) é geralmente 10-4-10-3 do sinal de controle (F0) condições fisiológicas. A escala de tempo da mudança potencial da membrana em um neurônio é aproximadamente milissegundos a poucas centenas de milissegundos. Para medir as alterações no potencial de membrana do Neuron, a câmera que está sendo usada para a gravação deve ser capaz de adquirir imagens com alta velocidade (10 kHz a 100 Hz). A baixa sensibilidade do VSD e a velocidade necessária para seguir o sinal neural requer uma grande quantidade de luz a ser coletada na câmera em alta velocidade, com uma alta relação sinal-ruído (S/N)2,16.

A ótica do sistema de gravação também é um elemento crítico para garantir a coleta de luz suficiente e para melhorar S/N. A ampliação alcançada pela ótica é muitas vezes excessivamente baixa, como 1X a 10X, para visualizar um circuito neural funcional local. Por exemplo, para visualizar a dinâmica do circuito hipocampal, uma ampliação de aproximadamente 5 seria adequada. Essa baixa ampliação tem baixa eficiência de fluorescência; Conseqüentemente, o sistema ótico avançado seria benéfico para tal gravação.

Além disso, a fisiologia da fatia também é essencial. Uma vez que a análise de imagem requer que as fatias sejam intactas, é necessária uma manipulação cuidadosa da fatia17. Além disso, as medidas tomadas para manter a viabilidade da fatia por um tempo mais longo são importantes18.

O presente artigo descreve o protocolo para preparação de fatias, coloração de VSD e medições. O artigo também descreve as melhorias para o VSDs, dispositivo de imagem e óptica, e outros refinamentos adicionais para o sistema experimental que permitiram que este método para ser usado como um ensaio simples, poderoso e quantitativo para visualizar o modificação das funções cerebrais19,20,21,22,23,24,25. A técnica pode igualmente ser amplamente utilizada para a potenciação a longo prazo na área CA1 de fatias hippocampal1. Além disso, esta técnica também é útil na gravação óptica de potenciais de membrana em uma única célula nervosa26.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais da Universidade Tokushima Bunri. O seguinte protocolo para a preparação da fatia é quase um procedimento padrão27 , mas as modificações têm sido os protocolos de coloração e gravação com VSD.

1. preparação antes do dia da experiência

  1. Prepare as soluções de estoque A (tabela 1), estoque B (tabela 2) e estoque C (tabela 3) e armazene em um refrigerador.
  2. Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) (tabela 4, ver passo 3) e mantê-lo na geladeira.
  3. Prepare 1 L de ACSF modificado (tabela 5) e mantenha-o na geladeira.
  4. Dispensar 500 μL de alíquotas de soro bovino fetal (FBS) em frascos de 2 mL e armazenar num congelador.
  5. Dissolva 4% de pó de ágar em ACSF (ca. 120 mL) em um microondas e despeje-o em um prato de Petri descartável de 90 mm. A placa de agar deve ser refrigerada antes da utilização.
  6. Coloque os seguintes itens em um freezer no dia anterior ao experimento: uma bandeja cirúrgica, um recipiente de fatiador e um bloco de resfriamento de alumínio (120 x 120 x 20 mm3).
  7. Assegure-se de que há uns anéis suficientes do plexiglass com os filtros de membrana para o sistema de manipulação da fatia17,28 (veja etapa 6,12).
  8. Dissolva 2% de pó de ágar em 50 mL de KCl de 3 M em um microondas. Tome em torno de 85 μL do dissolvente morno do agar-KCl em 200 pontas do μL usando uma micropipeta para o elétrodo de aterramento. Retire a ponta para o ágar ainda quente 3 M gel KCl. Repita o passo para preencher cerca de 20-40 pontas com 2% de agar.

2. preparação da solução de ações VSD (di-4-ANEPPS)

  1. Prepare 1 ml de solução de óleo de rícino polietoxilado 10% com água ultra-pura.
  2. Adicione 1 ml de etanol a um frasco para injetáveis de di-4-anepps (frasco para injetáveis de 5 mg), vortex e proceda durante 10 min. A solução transformar-se-á em uma cor vermelha profunda com os resíduos pequenos possíveis dos cristais de di-4-ANEPPS.
    Nota: O etanol utilizado nesta etapa deve ser recém-aberto.
  3. Transfira a solução para um microtubo de 2 mL com um anel-O. Gire para baixo a solução e adicione 500 μl da solução do óleo de rícino polietoxilado 10%.
    Nota: O corante é altamente lipofílico. DMSO e POLOXAMER também pode ser usado para dissolver di-4-ANEPPS, mas em termos de sinal óptico em cima da mudança no potencial de membrana, descobrimos que o uso de óleo de rícino etanol-polyethoxylated dá uma melhor relação sinal-ruído. Isso pode estar relacionado à taxa de transferência de solvente para a membrana celular.
  4. Vortex e proceda até que o corante foi completamente dissolvido.
  5. Evite a exposição à luz e mantê-lo em um refrigerador. Não conservar num congelador. O estoque pode durar por alguns meses.
    Nota: No dia do experimento, siga as etapas 3-9.

3. preparação diária do ACSF (1 L) (tabela 4)

  1. Pesar NaCl, NaHCO3, e glicose em um balão.
  2. Adicionar 950 mL de água destilada ao balão e começar a borbulhar com 95% O2/5% co2 Gas.
  3. Adicionar 2,5 mL de stock uma solução ao balão e incubar durante aproximadamente 10 min à temperatura ambiente.
  4. Adicionar 2,5 mL de solução de estoque C ao balão.
  5. Adicione a água destilada para fazer a solução a 1 L.

4. preparação diária da mancha VSD Ssolution

  1. SONICATE um frasco de 500 μL de FBS e VSD solução de ações (passo 2) em um ultra-sonicator por 5 min.
  2. Adicionar 500 μL de ACSF preparado na hora no frasco para injetáveis de FBS.
  3. Adicionar 20 (no caso de ratos) ou 40 (no caso de ratos) μL de solução de VSD para o frasco para injetáveis.
  4. Ultra-SONICATE e vórtice do frasco até que a solução se torne laranja pálido.

5. preparação para a cirurgia

  1. Tomar 100 mL de ACSF refrigerados separadamente em um recipiente de aço inoxidável 300 mL, um copo de 300 mL, e um recipiente de plástico, e colocá-los em um freezer. Despeje 150 mL de ACSF modificada refrigerada (tabela 2) em outro copo e coloque-o no congelador. Aguarde até que as soluções sejam refrigeradas; o tempo tomado deve ser medido e determinado de antemão.
  2. Dobre para quebrar uma lâmina de barbear (aço carbono, grau industrial 0,13 mm de espessura, lâmina em ambos os lados) na metade para o slicer.
    Nota: A outra metade pode ser usada para a dissecção com um suporte apropriado da lâmina.
  3. Prepare um bloco da placa de ágar ACSF 4% com um gabarito de ajuste (Figura 1).
  4. Prepare uma câmara de incubação úmida (uma câmara de tipo de interface; uma caixa selada apertada de 1,2 L com uma embalagem de silicone) para manter as fatias cerebrais fisiologicamente vivas (Figura 2); Adicionar ACSF em um pequeno recipiente e carbonato com 95% O2/5% co2 gás, e encher um 90 mm x 20 mm placa de Petri com ACSF em para o topo.
    Nota: Um prato de Petri menor (60 mm x 20 mm) deve ser colocado no centro do prato de 90 mm para suportar um papel de filtro no prato.
  5. Coloque a caixa em um dispositivo de aquecimento e aguarde 20 min para aquecê-lo até 28 ° c.
  6. Adicione gelo esmagado no recipiente da fatiadora. Coloque os seguintes instrumentos em uma cuba de aço inoxidável (pequena) no gelo: bisturi, porta-lâminas, pinças de anel, bloco de agar e um estágio de fatiador. Manter congelado ACSF e modificado ACSF em gelo e bolha com 95% O2/5% co2 gás (aka. Carbogen).
  7. Coloque os seguintes instrumentos em uma Cuba (grande): tesouras (grandes, pequenas), pinças, uma espátula, uma colher e alicates diagonais.

6. cirurgia (camundongos)

  1. Anestesie o rato utilizando isoflurano numa capa de fumos. Avalie o nível da anestesia verific o reflexo do pedal do animal em cima da pitada do dedo do pé.
  2. Decapitar o rato e mergulhar a cabeça em Ice-Cold ACSF em uma bandeja cirúrgica de aço inoxidável.
  3. Extraia o cérebro dentro de 1 min e coloque-o em um copo contendo ACSF refrigerados por 5 min.
  4. Tire o cérebro do copo e, usando um bisturi, aparar o bloco de cérebro (Figura 3a).
  5. Coloque o bloco cerebral em um bloco de ágar 4% (etapa 5,3, Figura 3B). Ambos os hemisférios podem ser montados em um bloco de ágar. Limpe o excesso de ACSF do bloco com um papel de filtro.
  6. Aplique o adesivo fino (colagem super) à tabela do slicer. Coloque o bloco de agar sobre ele e limpe o excesso de adesivo usando um papel de filtro.
  7. Aplique suavemente uma pequena quantidade de ACSF gelada (~ 5 mL) usando uma pipeta da parte superior do bloco de ágar-cérebro. Isso vai ajudar a solidificar o excesso de cola super e evitar a cola de cobrir o cérebro e perturbar o corte.
  8. Corrija a tabela de segmentação de dados na bandeja da segmentação de dados (Figura 3C) e despeje o ACSF modificado.
  9. Defina o slicer para uma velocidade lenta, com a freqüência da lâmina no máximo.
  10. Defina a espessura da fatia para 350-400 μm e comece a fatiar (Figura 3C). Coloque as fatias no canto da bandeja de fatia em uma seqüência, de modo que a profundidade das fatias pode ser facilmente distinguida. Geralmente três a cinco fatias podem ser obtidas de um hemisfério.
  11. Corte a porção do tronco cerebral usando uma agulha de 30 G (Figura 3D).
    Nota: A microcirurgia na fatia do cérebro, como um corte entre a borda de-CA1, deve ser feita nesta fase um microscópio binocular, se necessário.
  12. Usando uma pequena escova de pintura derrubado, coloque a fatia no centro do filtro de membrana (poros de 0,45 μm, membrana de PTFE, 13 mm de diâmetro) realizada com o anel de plexiglass17 (15 mm de diâmetro externo, 11 mm de diâmetro interno, 1 mm de espessura, Figura 3E). Coloque o anel na câmara de recuperação úmida (Figura 2) e fixe a tampa para manter a pressão interna alta.
    Nota: As fatias furarão à membrana dentro de 30 minutos e podem ser seguradas com os anéis nas etapas subseqüentes na câmara de gravação. Não há necessidade de usar pesos ou outras medidas para manter a fatia no lugar.
  13. Ajuste a direção e a posição da fatia no anel para garantir que ela esteja bem centralizada e tenha uma direção consistente (consulte a etapa 9,3).
  14. Deixe a amostra a 28 ° c durante 30 min e, em seguida, à temperatura ambiente durante pelo menos 10 a 30 min para a recuperação das fatias.
    Nota: As fatias podem agora reter a boa condição physiological pelo menos para 15 h.

7. coloração e enxaguamento das fatias (camundongos)

  1. Aplique suavemente 100-110 μL da solução de coloração (passo 4) em cada fatia do anel utilizando uma micropipeta. Oito a nove fatias podem ser manchadas com uma solução de coloração preparada na etapa 4. Deixe as fatias por 20 min para a coloração.
  2. Prepare 50-100 mL de ACSF em um recipiente e põr o anel com o espécime cortado nele para enxaguar a solução de mancha.
  3. Guarde a fatia enxaguada em outra câmara de incubação. Aguarde mais de 1 h para recuperação antes do experimento.
    Nota: A câmara de incubação pode ser separada do gás e movida para o local de gravação em uma condição selada apertada. A fatia pode permanecer viva por pelo menos 20 minutos sem abastecimento de gás. Isso é útil no caso de você precisar mover a fatia para outro local para gravação.

8. preparação diária de aparelhos experimentais

  1. Ligue o amplificador, o computador e o sistema de câmaras e verifique se o software está a funcionar.
  2. Coloque ACSF em um tubo de 50 mL e bolha com Carbogen.
  3. Use uma bomba peristáltica para circular o ACSF. Ajuste a vazão para aproximadamente 1 mL/min.
  4. Ajuste a altura da pipeta de sucção para que o nível de líquido dentro da câmara do experimento seja sempre constante.
    Nota: O nível da solução é importante para obter uma gravação estável, portanto, o ajuste deve ser feito usando um micromanipulador.
  5. Instale o eletrodo de aterramento composto de chip amarelo preenchido com 3 M de agar KCl (2%) (passo 1,8) num suporte com um fio Ag-AgCl com uma pequena quantidade de solução de 3 M de KCl.
  6. Encha uma pequena quantidade de ACSF (aproximadamente dois-terço do volume) no elétrodo de vidro (diâmetro exterior de 1 milímetro, diâmetro interno de 0,78 milímetros puxado com um extrator da micropipeta) usando uma ponta amarela Tube afilada fina e coloc a no suporte do elétrodo.
  7. Prenda o suporte à haste instalada no manipulador. Certifique-se de usar um amplificador que a resistência do eletrodo é de aproximadamente 1 MΩ.
    Nota: A abertura larga da longo-pata (abertura de 4-8 μm) o tipo elétrodo do remendo deve ser bom para a gravação do campo e como um elétrodo de estimulação.

9. iniciando uma sessão de gravação

  1. Tome uma preparação da fatia da câmara úmida com fórceps.
  2. Coloque rapidamente a fatia sobre uma câmara experimental o microscópio (Figura 4).
  3. Empurre a borda do anel firmemente no anel-O de silicone. Tenha cuidado para não quebrar a membrana ou a parte inferior da câmara experimental.
    Nota: A direção da fatia deve ser levada em consideração em relação à direção dos eletrodos estimulantes e de gravação no campo de visão. A fatia saudável deve furar ao filtro da membrana assim que não há nenhuma necessidade de usar outros dispositivos para fixar as fatias tais como pesos e malhas de nylon.
  4. Coloc a ponta do elétrodo de estimulação e o elétrodo de gravação potencial do campo na fatia o microscópio com luz transmitida.
  5. Use o sistema de gravação eletrofisiológica para verificar a resposta. Confirme a gravação electrofisiológica usual (não manchada) com a configuração dada.
    Nota: O eletrodo de gravação pode ser omitido, mas é útil para verificar a fisiologia da fatia.
  6. Ajuste a intensidade da luz de excitação para aproximadamente 70-80% da capacidade máxima na câmera que corresponde a 13-15 mW/cm2 na amostra quando a amostragem em 10 kHz com 5x lente objetiva de imersão de água e 1x plano APO lente do tubo. O comprimento de onda claro da excitação é 530 nanômetro, e o filtro da emissão deve ser > 590 nanômetro.
    Nota: Use um obturador para minimizar a quantidade de luz de excitação. A exposição à luz contínua pode deteriorar a fisiologia da fatia. O possível efeito prejudicial da luz depende da intensidade e duração da luz. Use a gravação eletrofisiológica para julgar o efeito da luz. Em caso da força de 13-15 mW/cm2, aproximadamente 1 s a exposição deve ser o limite superior da tolerância.
  7. Ajuste o foco com o sistema de aquisição usando a fonte de luz fluorescente porque o foco pode ser diferente dependendo do comprimento de onda e iniciar a aquisição.
  8. Examine os dados em um software de aquisição de imagem.
    Nota: Nós usamos o pacote original do microprogramação do software numérico da análise para a análise detalhada.

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Resultados

A Figura 5 mostra o sinal ótico representativo em cima da estimulação elétrica da garantia de Schaffer na área CA1 de uma fatia do hippocampal do rato. As imagens consecutivas na Figura 5a mostram o sinal óptico antes de quaisquer filtros espaciais e temporais serem aplicados, enquanto a Figura 5b mostra os mesmos dados após a aplicação de um filtro cúbico 5 x 5 x 5 (uma convolução do ker...

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Discussão

A fisiologia da fatia é vital para coletar o sinal direito. O uso do sistema de filtro da anel-membrana neste protocolo assegura-se de que a fatia permaneça saudável e un-distorcida durante todo o procedimento2,16,17. Outros sistemas podem ser usados para reter a fisiologia da fatia durante a gravação, mas a fatia não deve ficar deformada a qualquer momento, pois a imagem precisa de cada parte da fatia para ser saudável. ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

TT recebeu o JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 e JP15K00413) da MEXT e subsídios do Ministério da saúde, trabalho e bem-estar (MHLW-Kagaku-Ippan-H27 [15570760] e h30 [18062156]). Gostaríamos de agradecer a Editage (www.editage.jp) para edição de idioma inglês.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
High speed image acquisition systemBrainvision co. Ltd.MiCAM - UltimaImaging system
High speed image acquisition systemBrainvision co. Ltd.MiCAM 02Imaging system
Macroscepe for wide field imagingBrainvision co. Ltd.THT macroscopemacroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizerBrainvision co. Ltd.LEX-2GLED illumination
Image acquisition softwareBrainvision co. Ltd.BV-anaimage acquisition software
Multifunctional electric stimulatorBrainvision co. Ltd.ESTM-8Stimulus isolator+AD/DA converter
SlicerLeicaVT-1200Sslicer
SlicerLeicaVT-1000slicer
Blade for slicerFeather Safety Razor Co., Ltd.#99027carbon steel razor blade
Membrane filter for slice supportMerk Millipore Ltd., MA, USAOmnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,membrane filter/0.45 13
Numerical analysis softwareWavemetrics Inc., OR, USAIgorProanalysing software
Stimulation isolatorWPI Inc.A395Stimulus isolator
AD/DA converterInstrutechITC-18AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPSInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAcatalog number: D-1199VSD: Di-4-ANEPPS
PoloxamerInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPluronic F-127 P30000MPpoloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oilSigma-AldrichCremophor EL C5135polyethoxylated castor oil

Referências

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