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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Introduciamo un metodo di registrazione ottica riproducibile e stabile per le fette cerebrali usando coloranti sensibili alla tensione. L'articolo descrive la colorazione sensibile alla tensione e la registrazione di segnali ottici utilizzando preparazioni convenzionali di fette ippocampali.

Abstract

L'imaging a singolo contenuto fotonico sensibile alla tensione (VSD) a singolo campo dei preparati delle fette cerebrali è uno strumento utile per valutare la connettività funzionale nei circuiti neurali. A causa del cambiamento frazionario nel segnale luminoso, è stato difficile utilizzare questo metodo come analisi quantitativa. Questo articolo descrive speciali sistemi di ottica e gestione delle fette, che rendono questa tecnica stabile e affidabile. Il presente articolo illustra in dettaglio la gestione, la colorazione e la registrazione delle fette di ippocampale macchiate di VSD. Il sistema mantiene le condizioni fisiologiche per lungo tempo, con una buona colorazione, e previene i movimenti meccanici della fetta durante le registrazioni. Inoltre, consente la colorazione delle fette con una piccola quantità di colorante. L'ottica raggiunge un'apertura numerica elevata a basso ingrandimento, che consente la registrazione del segnale VSD alla frequenza fotogrammi massima di 10 kHz, con una risoluzione spaziale di 100 x 100 pixel. A causa dell'elevata frequenza fotogrammi e della risoluzione spaziale, questa tecnica consente l'applicazione dei filtri di post-registrazione che forniscono un rapporto segnale-rumore sufficiente per valutare i cambiamenti nei circuiti neurali.

Introduzione

L'imaging a singolo campo fotonico sensibile alla tensione (VSD) di preparazioni di fette cerebrali macchiate di massa è diventato un utile strumento quantitativo per valutare la dinamica dei circuiti neurali1,2,3,4 . Dopo l'analisi dei cambiamenti nelle proprietà ottiche dovute all'eccitazione della membrana5,6,7, l'imaging VSD è stato descritto per la prima volta nei primi anni '70 da Cohen e altri6,8, 9. è un metodo adatto per monitorare le funzioni cerebrali in tempo reale in quanto il colorante sonda direttamente i potenziali cambiamenti della membrana (cioè, il segnale primario dei neuroni).

I primi VSD possedevano le caratteristiche desiderabili per comprendere il sistema cerebrale, come una costante temporale veloce per seguire la rapida cinetica degli eventi potenziali della membrana neuronale e la linearità con il cambiamento nel potenziale della membrana9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15. Simile ad altri esperimenti di imaging, questa tecnica richiede una vasta gamma di accordature specifiche, come le telecamere, l'ottica, il software e la fisiologia delle fette, per ottenere i risultati desiderati. A causa di queste insidie tecniche, i benefici attesi durante gli sforzi iniziali non si sono necessariamente concretizzati per la maggior parte dei laboratori che non si sono specializzati in questa tecnica.

La causa primordiale della difficoltà tecnica era la bassa sensibilità del VSD verso il potenziale cambiamento della membrana quando applicato alla colorazione alla rinfusa dei preparati della fetta. La grandezza del segnale ottico (cioè il cambiamento frazionario della fluorescenza) è di solito 10-4-10-3 del segnale di controllo (F0) in condizioni fisiologiche. La scala temporale del potenziale cambiamento della membrana in un neurone è di circa millisecondi a poche centinaia di millisecondi. Per misurare i cambiamenti nel potenziale di membrana del neurone, la fotocamera utilizzata per la registrazione dovrebbe essere in grado di acquisire immagini ad alta velocità (da 10 kHz a 100 Hz). La bassa sensibilità di VSD e la velocità necessaria per seguire il segnale neurale richiede una grande quantità di luce da raccogliere alla fotocamera ad alta velocità, con un alto rapporto segnale-rumore (S/N)2,16.

L'ottica del sistema di registrazione è anche un elemento critico per garantire la raccolta di luce sufficiente e migliorare S/N. L'ingrandimento ottenuto dall'ottica è spesso eccessivamente basso, come 1X a 10X, per visualizzare un circuito neurale funzionale locale. Ad esempio, per visualizzare la dinamica del circuito ippocampale, sarebbe adatto un ingrandimento di circa 5. Tale basso ingrandimento ha bassa efficienza di fluorescenza; pertanto, l'ottica avanzata sarebbe vantaggiosa per tale registrazione.

Inoltre, la fisiologia della fetta è anche essenziale. Poiché l'analisi di imaging richiede che le fette siano intatte, è necessaria un'attenta manipolazione delle fette17. Inoltre, le misure adottate per mantenere la vitalità della fetta per un tempo più lungo sono importanti18.

Il presente descrive il protocollo per la preparazione di sezioni, colorazione VSD e misure. L'articolo descrive anche i miglioramenti apportati ai VSD, al dispositivo di imaging e all'ottica e altri miglioramenti aggiuntivi al sistema sperimentale che hanno permesso di utilizzare questo metodo come un saggio semplice, potente e quantitativo per visualizzare il modifica delle funzioni cerebrali19,20,21,22,23,24,25. La tecnica può anche essere ampiamente utilizzata per il potenziamento a lungo termine nell'area CA1 di fette ippocampali1. Inoltre, questa tecnica è utile anche nella registrazione ottica dei potenziali della membrana in una singola cellula nervosa26.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Tokushima Bunri. Il seguente protocollo per la preparazione delle fette è quasi una procedura standard27 , ma le modifiche sono state i protocolli di colorazione e registrazione con VSD.

1. Preparazione prima del giorno dell'esperimento

  1. Preparare le soluzioni stock A (Tabella 1), stock B (Tabella 2) e magazzino C ( Tabella3) e conservare in frigorifero.
  2. Preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (Tabella 4, vedere il passaggio 3) e tenerlo in frigorifero.
  3. Preparare 1 L di ACSF modificato (Tabella 5) e tenerlo in frigorifero.
  4. Erogare 500 -Ll di siero bovino fetale (FBS) in 2 fiale mL e conservare in un congelatore.
  5. Sciogliere il 4% della polvere di agar in ACSF (ca. 120 mL) in un forno a microonde e versarlo in un piatto Petri usa e getta da 90 mm. La piastra di agar deve essere refrigerata prima di un ulteriore utilizzo.
  6. Posizionare i seguenti elementi in un congelatore il giorno prima dell'esperimento: un vassoio chirurgico, un contenitore a fette e un blocco di raffreddamento in alluminio (120 x 120 x 20 mm3).
  7. Assicurarsi che ci siano sufficienti anelli di plexiglass con filtri a membrana per il sistema di movimentazione delle fette17,28 (vedere il passaggio 6.12).
  8. Sciogliere il 2% della polvere di agar in 50 mL di 3 M KCl in un forno a microonde. Prendere circa 85 l del dissoltore caldo agar-KCl in 200 punte l utilizzando una micropipetta per l'elettrodo di messa a terra. Staccare la punta nel gel agar 3 M KCl ancora caldo. Ripetere il passaggio per riempire circa 20-40 punte con 2% agar.

2. Preparazione della soluzione di riserva VSD (di-4-ANEPPS)

  1. Preparare 1 mL di 10% di olio di ricino polyethoxylated con acqua ultra-pura.
  2. Aggiungere 1 mL di etanolo a una fiala di di-4-ANEPPS (5 mg di fiala), vortice e sonicare per 10 min. La soluzione si trasformerà in un colore rosso intenso con possibili piccoli residui dei cristalli di-4-ANEPPS.
    NOT: L'etanolo utilizzato in questo passaggio deve essere appena aperto.
  3. Trasferire la soluzione su un microtubo da 2 mL con un anello O. Abbassare la soluzione e aggiungere una soluzione ad olio di ricino poliesssidi del 10% da 10% da ralli.
    NOT: Il colore è altamente lipofilo. DMSO e poloxamer possono anche essere utilizzati per sciogliere di-4-ANEPPS, ma in termini di segnale ottico al cambiamento nel potenziale della membrana, abbiamo scoperto che l'uso di olio di ricino etanolo-polyethoxylated dà un migliore rapporto segnale-rumore. Questo potrebbe essere correlato alla velocità di trasferimento del solvente alla membrana cellulare.
  4. Vortice e sonicare fino a quando il tinrito si è completamente sciolto.
  5. Evitare l'esposizione alla luce e conservarla in frigorifero. Non conservare in un congelatore. Lo stock può durare per alcuni mesi.
    NOT: Il giorno dell'esperimento, seguire i passaggi 3-9.

3. Preparazione giornaliera di ACSF (1 L) (tabella 4)

  1. Pesare NaCl, NaHCO3e glucosio in una fiaschetta.
  2. Aggiungere 950 mL di acqua distillata al pallone e iniziare a spumeggiare con 95% O2/ 5% gas CO2.
  3. Aggiungere 2,5 mL di brodo Una soluzione al pallone e incubare per circa 10 min a temperatura ambiente.
  4. Aggiungere 2,5 mL di soluzione stock C al pallone.
  5. Aggiungere acqua distillata per rendere la soluzione a 1 L.

4. Preparazione giornaliera della ssoluzione VSD colorazione

  1. Sonicare una fiala 500 -L di FBS e vsD soluzione stock (passaggio 2) in un ultra-sonicatore per 5 min.
  2. Aggiungere 500 -L di ACSF appena preparato nella fiala di FBS.
  3. Aggiungere 20 (in caso di topi) o 40 (in caso di ratti) - L di soluzione stock VSD alla fiala.
  4. Ultra-sonicare e vortice la fiala fino a quando la soluzione diventa arancio pallido.

5. Preparazione per la Chirurgia

  1. Prendere 100 mL di ACSF refrigerato separatamente in un contenitore in acciaio inossidabile da 300 ml, un becher da 300 mL e un contenitore di plastica e metterli in un congelatore. Versare 150 mL di ACSF modificato refrigerato (Tabella 2) in un altro becher e metterlo nel congelatore. Attendere che le soluzioni siano refrigerate; il tempo impiegato deve essere misurato e determinato in anticipo.
  2. Piegare per rompere una lama di rasoio (acciaio al carbonio, grado industriale 0,13 mm di spessore, lama su entrambi i lati) a metà per l'affettatrice.
    NOT: L'altra metà può essere utilizzata per la dissezione con un supporto della lama corretto.
  3. Preparare un blocco dalla piastra agar ACSF 4% con un jig di regolazione (Figura 1).
  4. Preparare una camera di incubazione umida (una camera di tipo interfaccia; una scatola sigillata tesa 1,2 L modificata con un imballaggio in silicone) per mantenere le fette cerebrali fisiologicamente vive (Figura 2); aggiungere L'ACSF in un piccolo contenitore e il carbonato con 95% O2/5% di CO2 gas e riempire una parabola Petri da 90 mm x 20 mm con ACSF nella parte superiore.
    NOT: Un piatto Petri più piccolo (60 mm x 20 mm) deve essere posto al centro del piatto da 90 mm per sostenere una carta da filtro sul piatto.
  5. Mettere la scatola su un dispositivo di riscaldamento e attendere 20 min per riscaldarlo fino a 28 gradi centigradi.
  6. Aggiungere il ghiaccio tritato nel contenitore dell'affettatrice. Posizionare i seguenti strumenti in una vasca in acciaio inossidabile (piccola) sul ghiaccio: bisturi, portala, pinzette ad anello, blocco di agar e uno stadio di affettatrice. Mantenere congelato ACSF e modificato ACSF su ghiaccio e bolla con 95% O2/ 5% GAS CO2 (aka. carbogen).
  7. Mettere i seguenti strumenti in una vasca (grande): forbici (grandi, piccole), pinzette, una spatola, un cucchiaio e pinze diagonali.

6. Chirurgia (Topi)

  1. Anestesizzare il mouse utilizzando isoflurane in un cappuccio fuma. Valutare il livello dell'anestesia controllando il riflesso del pedale dell'animale sulla punta pizzicamento.
  2. Decapitare il topo e immergere la testa in ACSF ghiacciato in un vassoio chirurgico in acciaio inossidabile.
  3. Estrarre il cervello entro 1 min e metterlo in un becher contenente ACSF refrigerato per 5 min.
  4. Togliere il cervello dal becher e, usando un bisturi, tagliare il blocco cerebrale (Figura 3A).
  5. Posizionare il blocco cerebrale su un blocco di agar del 4% (passaggio 5.3, Figura 3B). Entrambi gli emisferi possono essere montati su un blocco di agar. Pulire l'ACSF in eccesso dal blocco con una carta da filtro.
  6. Applicare sottile adesivo (super colla) al tavolo affettatrice. Posizionare il blocco di agar su di esso e pulire l'adesivo in eccesso utilizzando una carta da filtro.
  7. Applicare delicatamente una piccola quantità di ACSF ghiacciato utilizzando una pipetta dalla parte superiore del blocco di cervello-agar. Questo aiuterà a solidificare super colla in eccesso e impedire alla colla di coprire il cervello e disturbare il taglio.
  8. Fissare il tavolo dei filtri dei dati nel vassoio dei filtri dei dati (Figura 3C) e versare l'ACSF modificato.
  9. Impostare il filtro dei dati a una velocità lenta, con la frequenza della lama al massimo.
  10. Impostare lo spessore della fetta su 350-400 m e iniziare a affettare (Figura 3C). Posizionare le fette sull'angolo del vassoio delle fette in una sequenza, in modo che la profondità delle fette possa essere facilmente distinta. Di solito da tre a cinque fette possono essere ottenute da un emisfero.
  11. Tagliare la porzione di gambo del cervello utilizzando un ago 30 G (Figura 3D).
    NOT: La microchirurgia sulla fetta cerebrale, come un taglio tra il confine CA3-CA1, deve essere eseguita in questa fase al microscopio binoculare, se necessario.
  12. Utilizzando un piccolo pennello a punta, posizionare la fetta al centro del filtro a membrana (0,45 m pori, PTFE-membrana, 13 mm di diametro) tenuto con l'anello di plexiglass17 (15 mm di diametro esterno, 11 mm di diametro interno, 1 mm di spessore, Figura 3E). Posizionare l'anello nella camera di recupero umida (Figura 2) e fissare il coperchio per mantenere alta la pressione interna.
    NOT: Le fette si attaccano alla membrana entro 30 min e possono essere maneggiate con gli anelli nelle fasi successive della camera di registrazione. Non è necessario utilizzare pesi o altre misure per mantenere la sezione in posizione.
  13. Regolare la direzione e la posizione della fetta nell'anello per assicurarsi che sia ben centrata e abbia una direzione coerente (vedere il passaggio 9.3).
  14. Lasciare l'esemplare a 28 gradi centigradi per 30 min, quindi a temperatura ambiente per almeno 10-30 min per il recupero delle fette.
    NOT: Le fette possono ora mantenere una buona condizione fisiologica almeno per 15 h.

7. Colorazione e risciacquo delle fette (Topi)

  1. Applicare delicatamente 100-110 l'applicazione della soluzione di colorazione (passaggio 4) su ogni fetta sull'anello utilizzando una micropipetta. Da otto a nove fette possono essere macchiate con una soluzione di colorazione preparata nel passaggio 4. Lasciare le fette per 20 min per la colorazione.
  2. Preparare 50-100 mL di ACSF in un contenitore e mettere l'anello con campione a fette in esso per sciacquare la soluzione di colorazione.
  3. Conservare la fetta sciacquata in un'altra camera di incubazione. Attendere più di 1 h per il recupero prima dell'esperimento.
    NOT: La camera di incubazione può essere staccata dal gas e spostata nel luogo di registrazione in condizioni sigillate strette. La fetta può rimanere viva per almeno 20 min senza alimentazione di gas. Ciò è utile nel caso in cui sia necessario spostare la sezione in un'altra posizione per la registrazione.

8. Preparazione giornaliera di Apparatus Sperimentale

  1. Accendere l'amplificatore, il computer e il sistema di fotocamera e verificare che il software sia in esecuzione.
  2. Mettere ACSF in un tubo da 50 mL e bolla con carbogen.
  3. Utilizzare una pompa peristaltica per far circolare l'ACSF. Regolare la portata a circa 1 mL/min.
  4. Regolare l'altezza della pipetta di aspirazione in modo che il livello del liquido all'interno della camera di esperimento sia sempre costante.
    NOT: Il livello della soluzione è importante per ottenere una registrazione stabile, quindi, la regolazione deve essere fatta utilizzando un micromanipolatore.
  5. Installare l'elettrodo di terra costituito da chip giallo riempito con 3 M KCl agar (2%) (passaggio 1.8) in un supporto con un filo Ag-AgCl con piccola quantità di soluzione KCl 3 M.
  6. Riempire una piccola quantità di ACSF (circa due terzi del volume) nell'elettrodo di vetro (1 mm di diametro esterno, diametro interno di 0,78 mm tirato con un estrattore di micropipette) utilizzando una punta gialla sottile tubo latatrice e posizionarla nel supporto dell'elettrodo.
  7. Attaccare il supporto all'asta installata nel manipolatore. Assicurarsi con un amplificatore che la resistenza dell'elettrodo è di circa 1 M.
    NOT: L'elettrodo di tipo patch a lunga apertura (4-8 m di apertura) dovrebbe essere buono per la registrazione sul campo e come elettrodo stimolante.

9. Avvio di una sessione di registrazione

  1. Prendere una fetta di preparazione dalla camera umida con pinze.
  2. Posizionare rapidamente la fetta su una camera sperimentale al microscopio (Figura 4).
  3. Spingere saldamente il bordo dell'anello nell'anello O in silicone. Fare attenzione a non rompere la membrana o il fondo della camera di esperimento.
    NOT: La direzione della fetta deve essere presa in considerazione per quanto riguarda la direzione degli elettrodi stimolanti e di registrazione nel campo visivo. La fetta sana deve attaccarsi al filtro della membrana in modo che non sia necessario utilizzare altri dispositivi per fissare le fette come pesi e maglie di nylon.
  4. Posizionare la punta dell'elettrodo stimolante e il potenziale di campo che registra l'elettrodo sulla fetta al microscopio con luce trasmessa.
  5. Utilizzare il sistema di registrazione elettrofisiologica per controllare la risposta. Confermare la consueta registrazione elettrofisiologica (non macchiata) con una determinata configurazione.
    NOT: L'elettrodo di registrazione può essere omesso, ma è utile per controllare la fisiologia della fetta.
  6. Regolare l'intensità della luce di eccitazione a circa il 70-80% della capacità massima della fotocamera che corrisponde a 13-15 mW/cm2 al campione durante il campionamento a 10 kHz con obiettivo obiettivo ad immersione in acqua 5x e obiettivo tubo 1x PLAN APO. La lunghezza d'onda della luce di eccitazione è di 530 nm e il filtro di emissione deve essere > 590 nm.
    NOT: Utilizzare un otturatore per ridurre al minimo la quantità di luce di eccitazione. L'esposizione alla luce continua può deteriorare la fisiologia della fetta. Il possibile effetto dannoso della luce dipende dall'intensità e dalla durata della luce. Utilizzare la registrazione elettrofisiologica per giudicare l'effetto della luce. In caso di resistenza di 13-15 mW/cm2, circa 1 s esposizione dovrebbe essere il limite superiore della tolleranza.
  7. Regolare la messa a fuoco con il sistema di acquisizione utilizzando la fonte di luce fluorescente perché la messa a fuoco può essere diversa a seconda della lunghezza d'onda e avviare l'acquisizione.
  8. Esaminare i dati in un software di acquisizione immagini.
    NOT: Abbiamo utilizzato un pacchetto di microprogrammazione originale di software di analisi numerica per un'analisi dettagliata.

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Risultati

La figura 5 mostra il segnale ottico rappresentativo sulla stimolazione elettrica della garanzia Schaffer nell'area CA1 di una fetta di ippocampo di topo. Le immagini consecutive in Figura 5A mostrano il segnale ottico prima dell'applicazione di qualsiasi filtro spaziale e temporale, mentre la figura 5B mostra gli stessi dati dopo l'applicazione di un filtro cubico 5 x 5 x 5 (una convoluzione del ker...

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Discussione

La fisiologia della fetta è fondamentale per raccogliere il segnale giusto. L'uso del sistema di filtro ad anello-membrana in questo protocollo assicura chela fetta rimanga sana e non distorta durante tutta la procedura 2,16,17. Altri sistemi possono essere utilizzati per mantenere la fisiologia della fetta durante la registrazione, ma la fetta non dovrebbe deformarsi in qualsiasi momento in quanto l'imaging ha bisogno di ogni ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

TT ha ricevuto il JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 e JP15K00413) di MEXT e sovvenzioni del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] e H30 [18062156]). Ringraziamo Editage (www.editage.jp) per l'editing in lingua inglese.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
High speed image acquisition systemBrainvision co. Ltd.MiCAM - UltimaImaging system
High speed image acquisition systemBrainvision co. Ltd.MiCAM 02Imaging system
Macroscepe for wide field imagingBrainvision co. Ltd.THT macroscopemacroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizerBrainvision co. Ltd.LEX-2GLED illumination
Image acquisition softwareBrainvision co. Ltd.BV-anaimage acquisition software
Multifunctional electric stimulatorBrainvision co. Ltd.ESTM-8Stimulus isolator+AD/DA converter
SlicerLeicaVT-1200Sslicer
SlicerLeicaVT-1000slicer
Blade for slicerFeather Safety Razor Co., Ltd.#99027carbon steel razor blade
Membrane filter for slice supportMerk Millipore Ltd., MA, USAOmnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,membrane filter/0.45 13
Numerical analysis softwareWavemetrics Inc., OR, USAIgorProanalysing software
Stimulation isolatorWPI Inc.A395Stimulus isolator
AD/DA converterInstrutechITC-18AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPSInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAcatalog number: D-1199VSD: Di-4-ANEPPS
PoloxamerInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPluronic F-127 P30000MPpoloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oilSigma-AldrichCremophor EL C5135polyethoxylated castor oil

Riferimenti

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