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Resumen

Introducimos un método de grabación óptica reproducible y estable para las rebanadas cerebrales utilizando tinte sensible al voltaje. El artículo describe la tinción de tinte sensible al voltaje y el registro de señales ópticas utilizando preparaciones convencionales de corte de hipocampo.

Resumen

La imagen de tinte sensible al voltaje de fotón (VSD) de campo ancho de las preparaciones de corte cerebral es una herramienta útil para evaluar la conectividad funcional en circuitos neuronales. Debido al cambio fraccionario en la señal de luz, ha sido difícil utilizar este método como un ensayo cuantitativo. En este artículo se describen los sistemas especiales de manipulación de equipos ópticos y de corte, que hacen que esta técnica sea estable y confiable. El presente artículo muestra en detalle el manejo de las rebanadas, la tinción y el registro de las rebanadas de hipocampo teñidas con VSD. El sistema mantiene las condiciones fisiológicas durante mucho tiempo, con buena tinción, y evita los movimientos mecánicos de la rebanada durante las grabaciones. Además, permite la tinción de rodajas con una pequeña cantidad del tinte. La óptica logra una alta apertura numérica con bajo aumento, lo que permite la grabación de la señal VSD a la velocidad de fotogramas máxima de 10 kHz, con resolución espacial de 100 píxeles x 100 píxeles. Debido a la alta velocidad de fotogramas y la resolución espacial, esta técnica permite la aplicación de los filtros posteriores a la grabación que proporcionan una relación señal-ruido suficiente para evaluar los cambios en los circuitos neuronales.

Introducción

La imagen de tinte sensible al voltaje de fotones de campo ancho (VSD) de preparaciones de rebanadas cerebrales teñidas a granel se ha convertido en una herramienta cuantitativa útil para evaluar la dinámica de los circuitos neuronales1,2,3,4 . Después del análisis de los cambios en las propiedades ópticas debido a la excitación de la membrana5,6,7, imágenes VSD fue descrito por primera vez a principios de la década de 1970 por Cohen y otros6,8, 9. ; es un método adecuado para monitorear las funciones cerebrales en tiempo real, ya que el tinte sondea directamente los cambios potenciales de la membrana (es decir, la señal primaria de las neuronas).

Los primeros VSD poseían las características deseables para entender el sistema cerebral, como una rápida constante en el tiempo para seguir la rápida cinética de los eventos potenciales de la membrana neuronal, y la linealidad con el cambio en el potencial de membrana9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Al igual que otros experimentos de imágenes, esta técnica requiere una amplia gama de ajustes específicos, como las cámaras, óptica, software y fisiología de la rebanada, para lograr los resultados deseados. Debido a estos escollos técnicos, los beneficios esperados durante los esfuerzos iniciales no necesariamente se materializaron para la mayoría de los laboratorios que no se especializaron en esta técnica.

La causa primaria de la dificultad técnica fue la baja sensibilidad del VSD hacia el cambio potencial de membrana cuando se aplica a la tinción a granel de preparaciones de rodajas. La magnitud de la señal óptica (es decir, el cambio fraccionario en fluorescencia) es generalmente 10-4-10-3 de la señal de control (F0) en condiciones fisiológicas. La escala de tiempo del cambio potencial de membrana en una neurona es de aproximadamente milisegundos a pocos cientos de milisegundos. Para medir los cambios en el potencial de membrana de la neurona, la cámara que se utiliza para la grabación debe ser capaz de adquirir imágenes a alta velocidad (10 kHz a 100 Hz). La baja sensibilidad de VSD y la velocidad necesaria para seguir la señal neuronal requiere una gran cantidad de luz para ser recogido en la cámara a alta velocidad, con una alta relación señal-ruido (S/N)2,16.

La óptica del sistema de grabación también es un elemento crítico para garantizar la recopilación de luz suficiente y para mejorar S/N. El aumento logrado por la óptica es a menudo excesivamente bajo, como 1X a 10X, para visualizar un circuito neural funcional local. Por ejemplo, para visualizar la dinámica del circuito hipocampal, un aumento de aproximadamente 5 sería adecuado. Dicho bajo aumento tiene baja eficiencia de fluorescencia; por lo tanto, la óptica avanzada sería beneficiosa para dicha grabación.

Además, la fisiología de las rebanadas también es esencial. Dado que el análisis de imágenes requiere que los sectores estén intactos, se necesita un manejo cuidadoso de las rebanadas17. Además, las medidas adoptadas para mantener la viabilidad de las rebanadas durante más tiempo son importantes18.

En el presente artículo se describe el protocolo para la preparación de rodajas, tinción VSD y mediciones. El artículo también describe las mejoras en los VSD, el dispositivo de imagen y la óptica, y otros refinamientos adicionales al sistema experimental que han permitido que este método se utilice como un ensayo sencillo, potente y cuantitativo para visualizar el modificación de las funciones cerebrales19,20,21,22,23,24,25. La técnica también puede ser ampliamente utilizada para la potenciación a largo plazo en el área CA1 de las rodajas de hipocampo1. Además, esta técnica también es útil en la grabación óptica de potenciales de membrana en una sola célula nerviosa26.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Tokushima Bunri. El siguiente protocolo para la preparación de sectores es casi un procedimiento estándar27, pero las modificaciones han sido los protocolos de tinción y grabación con VSD.

1. Preparación Antes del día del experimento

  1. Preparar el stock A (Tabla 1), stock B (Tabla 2), y stock C (Tabla3) soluciones y almacenar en un refrigerador.
  2. Preparar 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (Tabla4, ver paso 3) y guardarlo en el refrigerador.
  3. Prepare 1 L de ACSF modificado (Tabla5)y guárdelo en el refrigerador.
  4. Dispensar alícuotas de suero bovino fetal (FBS) de 500 ml en viales de 2 ml y almacenarlas en un congelador.
  5. Disolver el 4% del agar en polvo en ACSF (ca. 120 ml) en un microondas y verterlo en un plato Petri desechable de 90 mm. La placa de agar debe refrigerarse antes de su uso posterior.
  6. Coloque los siguientes elementos en un congelador el día anterior al experimento: una bandeja quirúrgica, un recipiente de rebanadora y un bloque de enfriamiento de aluminio (120 x 120 x 20 mm3).
  7. Asegúrese de que haya suficientes anillos de plexiglás con filtros de membrana para el sistema de manipulación de rodajas17,28 (ver paso 6.12).
  8. Disolver el 2% del agar en polvo en 50 ml de 3 M KCl en un microondas. Tomar alrededor de 85 l del disuelto de agar-KCl caliente en puntas de 200 ml utilizando un micropipeta para el electrodo de puesta a tierra. Separe la punta en el gel de agar todavía caliente de 3 M KCl. Repita el paso para llenar alrededor de 20-40 consejos con 2% de agar.

2. Preparación de la solución de stock VSD (di-4-ANEPPS)

  1. Prepare 1 ml de 10% de solución de aceite de ricino polioxilado con agua ultrapura.
  2. Añadir 1 ml de etanol a un vial de di-4-ANEPPS (vial de 5 mg), vórtice y sonicato durante 10 min. La solución se convertirá en un color rojo intenso con posibles pequeños residuos de los cristales di-4-ANEPPS.
    NOTA: El etanol utilizado en este paso debe estar recién abierto.
  3. Transfiera la solución a un microtubo de 2 ml con una tórica. Gire hacia abajo la solución y agregue 500 sl de 10% de solución de aceite de ricino polietoxilado.
    NOTA: El tinte es altamente lipofílico. DMSO y poloxámero también se pueden utilizar para disolver di-4-ANEPPS pero en términos de la señal óptica tras el cambio en el potencial de la membrana, encontramos que el uso de etanol -aceite de ricino polietoxilado da una mejor relación señal-ruido. Esto podría estar relacionado con la tasa de transferencia de disolvente a la membrana celular.
  4. Vórtice y sonicar hasta que el tinte se haya disuelto por completo.
  5. Evite la exposición a la luz y guárdela en un refrigerador. No almacenar en un congelador. Las acciones pueden durar unos meses.
    NOTA: El día del experimento, siga los pasos 3-9.

3. Preparación diaria de ACSF (1 L) (Tabla 4)

  1. Pesar NaCl, NaHCO3y glucosa en un matraz.
  2. Añadir 950 ml de agua destilada al matraz y empezar a burbujear con 95% O2/5% CO2 gas.
  3. Añadir 2,5 ml de stock Una solución al matraz e incubar durante aproximadamente 10 min a temperatura ambiente.
  4. Añadir 2,5 ml de solución c de stock al matraz.
  5. Añadir agua destilada para hacer la solución a 1 L.

4. Preparación diaria de la solución VSD de tinción

  1. Sonicar un vial de 500 l de solución de material DE FBS y VSD (paso 2) en un ultra-sonicador durante 5 min.
  2. Añadir 500 ml de ACSF recién preparado en el vial de FBS.
  3. Añadir al vial 20 (en caso de ratones) o 40 (en caso de ratas) de solución en stock de VSD.
  4. Ultra-sonicado y vórtice el vial hasta que la solución se vuelva naranja pálido.

5. Preparación para la cirugía

  1. Tome 100 ml de ACSF refrigerado por separado en un recipiente de acero inoxidable de 300 ml, un vaso de precipitados de 300 ml y un recipiente de plástico, y colóquelos en un congelador. Vierta 150 ml de ACSFmodificado refrigerado (Tabla 2) en otro vaso de precipitados y colóquelo en el congelador. Espere hasta que las soluciones se enfríen; el tiempo que se toma debe medirse y determinarse de antemano.
  2. Doblar para romper una cuchilla de afeitar (acero al carbono, grado industrial de 0,13 mm de espesor, hoja en ambos lados) en la mitad para la cortadora.
    NOTA: La otra mitad se puede utilizar para la disección con un portacuchillas adecuado.
  3. Prepare un bloque de la placa de agar ACSF 4% con una plantilla de ajuste (Figura1).
  4. Preparar una cámara de incubación húmeda (una cámara de tipo interfaz; una caja sellada apretada de 1,2 L modificada con un empaque de silicona) para mantener las rodajas cerebrales fisiológicamente vivas (Figura2); añadir ACSF en un recipiente pequeño y carbonato con 95% O2/5% CO2 gas, y llenar una placa Petri de 90 mm x 20 mm con ACSF en la parte superior.
    NOTA: Se debe colocar una placa Petri más pequeña (60 mm x 20 mm) en el centro de la placa de 90 mm para apoyar un papel de filtro en el plato.
  5. Ponga la caja en un dispositivo de calefacción y espere 20 minutos para calentarla hasta 28 oC.
  6. Agregue hielo triturado en el recipiente de la cortadora. Coloque los siguientes instrumentos en una cuba de acero inoxidable (pequeña) sobre hielo: bisturí, portacuchillas, pinzas de anillo, bloque de agar y una etapa de cortadora. Mantenga el ACSF congelado y el ACSF modificado sobre hielo y burbuja con 95% O2/5% CO2 gas (también conocido como carbogen).
  7. Coloque los siguientes instrumentos en una tina (grande): tijeras (grandes, pequeñas), pinzas, una espátula, una cuchara y alicates diagonales.

6. Cirugía (Mice)

  1. Anestetizar el ratón usando isoflurano en una campana de humo. Evalúe el nivel de la anestesia comprobando el reflejo del pedal del animal al pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del día.
  2. Descapita el ratón y sumerja la cabeza en ACSF helado en una bandeja quirúrgica de acero inoxidable.
  3. Extraiga el cerebro en 1 min y colóquelo en un vaso de precipitados que contenga ACSF refrigerado durante 5 min.
  4. Saca el cerebro del vaso de precipitados y, con un bisturí, recorta el bloqueo cerebral (Figura3A).
  5. Coloque el bloqueo cerebral en un bloque de agar 4% (paso 5.3, Figura 3B). Ambos hemisferios se pueden montar en un bloque de agar. Limpie el exceso de ACSF del bloque con un papel de filtro.
  6. Aplique adhesivo fino (súper pegamento) a la mesa de corte. Coloque el bloque de agar sobre él y limpie el exceso de adhesivo con un papel de filtro.
  7. Aplica suavemente una pequeña cantidad de ACSF helado (5 ml) usando una pipeta de la parte superior del bloque cerebro-agar. Esto ayudará a solidificar el exceso de súper pegamento y evitar que el pegamento cubra el cerebro y perdor el corte.
  8. Fije la tabla de segmentación de datos a la bandeja de segmentación de datos (figura3C)y vierta el ACSF modificado.
  9. Ajuste la cortadora a una velocidad lenta, con la frecuencia de la hoja al máximo.
  10. Establezca el espesor de la rebanada en 350-400 m y comience a cortar (Figura3C). Coloque los sectores en la esquina de la bandeja de cortes en una secuencia, de modo que la profundidad de las rebanadas se pueda distinguir fácilmente. Por lo general, se pueden obtener de tres a cinco rebanadas de un hemisferio.
  11. Cortar la porción del tronco cerebral usando una aguja de 30 G (Figura 3D).
    NOTA: La microcirugía en la rebanada cerebral, como un corte entre el borde CA3-CA1, debe realizarse en esta etapa bajo un microscopio binocular, si es necesario.
  12. Usando un cepillo de pintura con punta pequeña, coloque la rebanada en el centro del filtro de membrana (0,45 mm de poros, membrana de PTFE, diámetro de 13 mm) sujeta con el anillo de plexiglás17 (15 mm de diámetro exterior, 11 mm de diámetro interior, 1 mm de espesor, Figura 3E). Coloque el anillo en la cámara de recuperación húmeda (Figura2) y fije la cubierta para mantener la presión interna alta.
    NOTA: Las rodajas se pegarán a la membrana dentro de 30 minutos y se pueden manejar con los anillos en los pasos posteriores en la cámara de grabación. No hay necesidad de utilizar pesas u otras medidas para mantener la rebanada en su lugar.
  13. Ajuste la dirección y la posición de la rebanada en el anillo para asegurarse de que está bien centrada y tiene una dirección coherente (consulte el paso 9.3).
  14. Dejar la muestra a 28oC durante 30 min, y luego a temperatura ambiente durante al menos 10 a 30 min para la recuperación de rodajas.
    NOTA: Las rodajas ahora pueden conservar una buena condición fisiológica al menos durante 15 h.

7. Manchado y enjuado de las rebanadas (Mice)

  1. Aplique suavemente 100-110 l de la solución de tinción (Paso 4) en cada rebanada del anillo utilizando un micropipeta. Ocho a nueve rodajas se pueden teñir con una solución de tinción preparada en el paso 4. Deje las rodajas durante 20 minutos para la tinción.
  2. Preparar 50-100 ml de ACSF en un recipiente y poner el anillo con muestra en rodajas en él para enjuagar la solución de tinción.
  3. Guarde la rebanada enjuagada en otra cámara de incubación. Espere más de 1 h para la recuperación antes del experimento.
    NOTA: La cámara de incubación se puede separar del gas y trasladarse al lugar de grabación en condiciones herméticas y selladas. La rebanada puede permanecer viva durante al menos 20 minutos sin suministro de gas. Esto es útil en caso de que necesite mover el sector a otro lugar para la grabación.

8. Preparación diaria del Aparato Experimental

  1. Encienda el amplificador, el ordenador y el sistema de cámara, y compruebe que el software se está ejecutando.
  2. Coloque ACSF en un tubo de 50 ml y burbuja con carbogen.
  3. Utilice una bomba peristáltica para hacer circular el ACSF. Ajuste el caudal a aproximadamente 1 ml/min.
  4. Ajuste la altura de la pipeta de aspiración para que el nivel de líquido dentro de la cámara de experimento sea siempre constante.
    NOTA: El nivel de la solución es importante para obtener un registro estable, por lo tanto, el ajuste debe realizarse utilizando un micromanipulador.
  5. Instale el electrodo de tierra compuesto de viruta amarilla llena de agar 3 M KCl (2%) (paso 1.8) en un soporte con un cable Ag-AgCl con una pequeña cantidad de solución KCl de 3 M.
  6. Llene una pequeña cantidad de ACSF (aproximadamente dos tercios del volumen) en el electrodo de vidrio (1 mm de diámetro exterior, 0,78 mm de diámetro interno tirado con un tirador de micropipeta) usando una punta amarilla de entubada delgada cónica y colóquela en el soporte del electrodo.
  7. Fije el soporte a la varilla instalada en el manipulador. Asegúrese de que el uso de un amplificador de resistencia al electrodo es de aproximadamente 1 M.
    NOTA: El electrodo de tipo parche de apertura ancha de vástago largo (4-8 m de apertura) debe ser bueno para la grabación de campo y como un electrodo estimulante.

9. Inicio de una sesión de grabación

  1. Tome una preparación de rodajas de la cámara húmeda con fórceps.
  2. Coloque rápidamente la rebanada en una cámara experimental bajo el microscopio (Figura4).
  3. Empuje el borde del anillo firmemente en la junta tórica de silicona. Tenga cuidado de no romper la membrana o la parte inferior de la cámara del experimento.
    NOTA: La dirección de la rebanada debe tenerse en cuenta con respecto a la dirección de los electrodos estimulantes y de grabación en el campo de visión. La rebanada saludable debe adherirse al filtro de membrana por lo que no hay necesidad de utilizar otros dispositivos para fijar las rebanadas tales como pesas y mallas de nylon.
  4. Coloque la punta del electrodo estimulante y el electrodo de registro potencial de campo en la rebanada bajo el microscopio con luz transmitida.
  5. Utilice el sistema de grabación electrofisiológica para comprobar la respuesta. Confirme el registro electrofisiológico habitual (no manchado) con una configuración determinada.
    NOTA: El electrodo de grabación se puede omitir, pero es útil para comprobar la fisiología de la rebanada.
  6. Ajuste la intensidad de la luz de excitación a aproximadamente el 70-80% de la capacidad máxima en la cámara que corresponde a 13-15 mW/cm2 en la muestra al tomar muestras a 10 kHz con lente objetivo de inmersión en agua 5x y 1lente de tubo PLAN APO. La longitud de onda de la luz de excitación es de 530 nm, y el filtro de emisión debe ser > 590 nm.
    NOTA: Utilice un obturador para minimizar la cantidad de luz de excitación. La exposición continua a la luz puede deteriorar la fisiología de las rebanadas. El posible efecto nocivo de la luz depende de la intensidad y duración de la luz. Utilice el registro electrofisiológico para juzgar el efecto de la luz. En caso de la resistencia de 13-15 mW/cm2, aproximadamente 1 s de exposición debe ser el límite superior de la tolerancia.
  7. Ajuste el enfoque con el sistema de adquisición utilizando la fuente de luz fluorescente porque el enfoque puede ser diferente dependiendo de la longitud de onda e iniciar la adquisición.
  8. Examine los datos en un software de adquisición de imágenes.
    NOTA: Utilizamos el paquete original de microprogramación de software de análisis numérico para el análisis detallado.

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Resultados

La Figura 5 muestra la señal óptica representativa tras la estimulación eléctrica de la garantía de Schaffer en el área CA1 de una rebanada de hipocampo de ratón. Las imágenes consecutivas en la Figura 5A muestran la señal óptica antes de que se aplicaran filtros espaciales y temporales, mientras que la Figura 5B muestra los mismos datos después de aplicar un filtro cúbico de 5 x 5 x 5 (u...

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Discusión

La fisiología de la rebanada es vital para recoger la señal correcta. El uso del sistema de filtro de anillo-membrana en este protocolo garantiza quela rebanada permanezca sana y sin distorsión durante todo el procedimiento 2,16,17. Otros sistemas se pueden utilizar para retener la fisiología de las rebanadas durante la grabación, pero la rebanada no debe deformarse en ningún momento, ya que la imagen necesita que cada par...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

TT recibió la Beca JSPS KAKENHI (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 y JP15K00413) de MEXT y subvenciones del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] y H30 [18062156]). Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por la edición en inglés.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
High speed image acquisition systemBrainvision co. Ltd.MiCAM - UltimaImaging system
High speed image acquisition systemBrainvision co. Ltd.MiCAM 02Imaging system
Macroscepe for wide field imagingBrainvision co. Ltd.THT macroscopemacroscope
High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizerBrainvision co. Ltd.LEX-2GLED illumination
Image acquisition softwareBrainvision co. Ltd.BV-anaimage acquisition software
Multifunctional electric stimulatorBrainvision co. Ltd.ESTM-8Stimulus isolator+AD/DA converter
SlicerLeicaVT-1200Sslicer
SlicerLeicaVT-1000slicer
Blade for slicerFeather Safety Razor Co., Ltd.#99027carbon steel razor blade
Membrane filter for slice supportMerk Millipore Ltd., MA, USAOmnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores,membrane filter/0.45 13
Numerical analysis softwareWavemetrics Inc., OR, USAIgorProanalysing software
Stimulation isolatorWPI Inc.A395Stimulus isolator
AD/DA converterInstrutechITC-18AD/DA converter
Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPSInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAcatalog number: D-1199VSD: Di-4-ANEPPS
PoloxamerInvitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USAPluronic F-127 P30000MPpoloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)
Polyethoxylated castor oilSigma-AldrichCremophor EL C5135polyethoxylated castor oil

Referencias

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