巨噬细胞吞噬胸腺细胞吞噬的实验分析

摘要

在这里, 我们提出了一个方案, 以编制凋亡胸腺细胞和腹膜巨噬细胞, 并分析了细胞内吞的效率和特定的抑制介导的抑制凋亡胸腺细胞吞没。该协议在包括人工珠子和细菌在内的其他颗粒的细胞介导清除中有着广泛的应用。

摘要

细胞凋亡是一个自然的过程, 在胚胎发育、稳态调节、免疫耐受诱导和炎症的治疗中起着至关重要的作用。体内凋亡碎片的积累可能会引发慢性炎症反应, 随着时间的推移导致全身自身免疫性疾病。凋亡细胞清除障碍与各种自身免疫性疾病有关。凋亡清除是一个复杂的过程, 在生理条件下很少检测到。它涉及丰富的表面感受器官和信号分子。研究凋亡细胞清除过程提供了深刻的分子机制和随后的生物反应, 这可能导致新的治疗方法的发展。在这里, 我们描述了诱导凋亡胸腺细胞, 腹腔巨噬细胞的制备, 以及流式细胞仪和显微镜分析凋亡细胞清除的协议。所有细胞在一定阶段都会发生凋亡, 许多体内和循环细胞可以吸收凋亡碎片。因此, 这里描述的协议可用于许多应用, 以表征凋亡细胞结合和摄入的许多其他细胞类型。

引言

我们的身体每天产生1-10 个凋亡细胞。如此大量的凋亡细胞必须以免疫反应保持静止的方式清除。为了确保及时清除凋亡细胞, 多种组织驻体细胞和循环细胞发展出吞没凋亡细胞^{的机制 1}。细胞凋亡的功能失调调节与各种炎症性疾病的发生和进展有关, 自身免疫 2。细胞凋亡在癌症发展的发病机制及其对常规治疗的抵抗力^3,4中也起着至关重要的作用。去除凋亡细胞通常会促进抗炎反应, 这可能与免疫耐受⁵有关。凋亡细胞清除的干扰推动了自我免疫, 并有助于人类和小鼠^全身自身免疫性疾病的发展。

当细胞发生凋亡时, 它们将磷脂酰丝氨酸 (PtdSer) 从内小叶暴露到膜的外小叶。然后, PtdSer 将通过表面受体被吞噬细胞识别。已经发现了十几个受体, 以识别和/或促进凋亡细胞的吞没。一般情况下, 至少有三种类型的表面受体参与凋亡细胞清除: 网络受体, 识别凋亡细胞;发痒的受体, 启动吞没;陪护受体, 促进整个过程⁷。TAM 受体酪氨酸激酶 (TAM Rtk) 由tyro-3、 axl 和mer 组成, 主要由免疫系统的骨髓细胞^表达8。TAM Rtk 的主要功能是作为连接受体, 促进凋亡细胞和碎片的吞噬性去除。本组多年来一直在自身免疫环境下研究 TAM 介导的凋亡细胞清除。维生素 k 依赖性蛋白生长抑制特定蛋白 6 (gas6) 和蛋白 s (pros) 结合并激活 tam 受体^9,10。Gas6 产生于心脏、肾脏和肺部。P s 主要是在肝脏^中产生的11。TAM 识别凋亡细胞的方式是, Gas6/ProS 的 n 端与凋亡细胞上的 PtdSer 结合, Gas6/ProS 的 c 端与锚定在吞噬细胞表面的 TAM 受体结合。与其他受体一起, 凋亡细胞吞没^{发生 12}。虽然尔可以与配体 ProS 和 Gas6 结合, 但我们发现 Gas6 似乎是 em 介导的凋亡细胞巨噬细胞吞噬的唯一配体, 而这可以被抗莫抗体13阻断.巨噬细胞是专业的吞噬细胞。巨噬细胞快速清除凋亡细胞对于抑制细胞内抗原的炎症和自身免疫反应具有重要意义。莫氏受体酪氨酸激酶是巨噬细胞吞没和凋亡细胞^的有效清除14的关键。在小鼠脾脏中, Maer 主要表现为边缘区和有形体巨噬细胞¹³。

本文介绍的协议描述了诱导细胞凋亡的基本方法, 并演示了检测细胞凋亡过程和效率的方法。这些方案可以很容易地适应研究其他细胞类型的自泡增多症, 在不同来源的凋亡细胞吞没。

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研究方案

实验小鼠在我们的小鼠群体中进行了培育和维持。所有动物工作都是根据辛辛那提大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的指导方针进行的。

1. CFSE 标记凋亡胸腺细胞的制备

1. 用 CO2 吸入_使两只天真的 C57/B6 小鼠安乐死 10分钟, 并解剖打开胸腔, 用弯曲的细尖钳将胸腺取出 (拔出) 到含有 RPM1640 培养基的10毫升的组织培养培养皿中。
2. 通过将整个胸腺磨成显微镜滑块的两个磨砂端, 然后通过100μm 的细胞过滤器过滤悬浮液, 获得单个细胞悬浮液。
3. 收集10毫升胸腺悬浮液到一个50毫升管和离心机在 300 x g 5分钟。
4. 取出上清液, 在 1x PBS 的40毫升中重新悬浮, 并用血细胞计计数细胞数。
5. 以 300 x g 离心 5分钟, 并去除上清液。
6. 在一个50毫升的 PBS 管中, 以 2X10 8 细胞为单细胞悬浮液 (如果超过 2 x 10^8个细胞, 在另一个 50 ml 管中重新悬挂另一个 20 毫升的 1 x pbs 中的其余细胞), 在 1x pbs 的20毫升中重新悬浮。
7. 通过将40μl 的 cfse 库存溶液 (2.5 Mm) 移注到 1x PBS 的 20 mL 中, 在等量 (20 毫升) 的 1X PBS 中, 在等量 (20 毫升) 的情况下, 将5μm 的 CFSE 制成, 并通过将试管反转2-3 次进行混合。
8. 将1.7 步 CFSE 的20毫升从步骤1.6 加入20毫升细胞悬浮液中 (CFSE 的最终浓度现在为 2.5μm)。
   注: 每20毫升电池悬浮液, 需要一个20毫升的 CFSE 管。
9. 将细胞和 CFSE 混合物管反转2-3 次, 在室温下在黑暗中孵育混合物, 最长为 2分钟, 然后通过加入10毫升的热灭活马血清来停止反应。
10. 在室温下, 以 300 x g 离心50 毫升管混合物5分钟。
    注: 如果 CFSE 标签成功, 细胞颗粒将成为浅黄色的颜色。
11. 取出上清液, 重新悬浮细胞颗粒在 1x PBS 的40毫升和计数细胞数与血细胞计。
12. 以 300 x g 离心细胞悬浮液 5分钟, 并丢弃上清液。
13. 用 RPMI1640 培养基40毫升再次清洗细胞颗粒。
14. 用 RPMI1640 组织培养基 (RPMI1640, 20 mM hepes, 10% FBS (热灭活)、20 mM 谷氨酰胺和 1x Pen/strep) 去除上清液并重新悬浮细胞, 浓度为 7 x¹⁰ 6 6 细胞/mM。
    注: 如果获得更多的细胞, 将需要一个单独的100毫米组织培养盘。
15. 在最终浓度为1μm 的细胞悬浮培养中加入 staurosporine, 并在提供 5% CO2 的组织培养孵化器中在37°c 时培养 4小时.

2. 腹腔巨噬细胞的制备

1. 在第0天用3% 的硫代乙酸酯1毫升的1毫升注入两只 C57B6 小鼠 (或实验室中的任何基因操纵小鼠)。
2. 如步骤1.1 所述, 在第5天对老鼠进行安乐死, 切开并剥落腹部皮肤, 但保持腹膜完整。用连接 18 g 针的10毫升注射器将10毫升的洗涤缓冲液 (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA) 推入腹腔腔, 冲洗腹腔。
3. 用相同的针管慢慢回收洗涤缓冲液, 并将洗涤缓冲液收集到50毫升管中 (详情见詹森实验室^第15条)。
4. 用 1x PBS 清洗腹膜灌胃两次, 以 2 x¹⁰ 6 细胞和 aliquot 500μl 的密度将 RPMI1640 组织培养基中的腹腔巨噬细胞重新悬浮到24井板的每口井中。将钢板放在组织培养孵化器中2小时。
5. 通过吸气和更换500μl 的新鲜培养基, 两次取出漂浮细胞。
6. 或者, 加入 TAM 受体酪氨酸抑制剂 RXDX-106, 在图传说中显示的浓度到巨噬细胞培养的每口井和孵育2小时。

3. 腹腔巨噬细胞与凋亡胸腺细胞的共培养

1. 从步骤1收集凋亡胸腺细胞, 并用 RPMI1640 培养基清洗三次。在此阶段, 用附件素 v函7-AAD 试剂盒可以测量凋亡诱导的效率。
2. 根据实验安排 (例如, 见图 1), 将 0-12 x¹⁰ 6个细胞 (500μl 介质) 从协议 #2 分配到巨噬细胞培养物的每口井中 。这使得24井板的每口井的整个培养体积为1毫升。在凋亡胸腺细胞加入之前, 将阻断抗体添加到培养中。
3. 在提供 5% CO2 的组织培养孵化器中, 在37°c 下培养细胞混合物 4小时.
4. 用 1x PBS (含 500Μm EDTA) 清洗每个培养物的油井两次, 以去除自由漂浮的凋亡细胞。
5. 在这一阶段用 CD11b-pe 染色板状巨噬细胞。
   1. 用染色缓冲液 (1x PBS, 1% BSA) 清洗一次板状巨噬细胞。
   2. 在每口井中加入200Μl 含有 2μl Cd11b-pe 的染色缓冲液。
   3. 在4°c 下将板材孵化20分钟。
   4. 用染色缓冲液清洗每口井三次。
   5. 加入200Μl 染色缓冲液, 并在荧光显微镜下进行印版图像分析。
6. 或者, 在 PBS 中加入1毫升利多卡因, 在37°c 下孵育 10分钟, 分离板状巨噬细胞。
7. 用重复移液分离板状巨噬细胞。
8. 将巨噬细胞悬浮液从24井板的每口井中转移到一个5毫升的圆底流式细胞仪管中。
9. 以 300 x g 离心5分钟。
10. 取出上清液, 加入200Μl 的染色缓冲液, 其中含有2μl 的 Cd11b-pe (1: 200 染色缓冲液稀释)。
11. 在4°c 染色缓冲液中培养细胞悬浮液20分钟。
12. 用染色缓冲液清洗细胞悬浮液两次。
13. 加入200Μl 染色缓冲液, 用流式细胞仪进行流式细胞仪分析, 并分析 CFSE 阳性巨噬细胞的百分比。

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结果

腹膜巨噬细胞介导的凋亡胸腺细胞吞没分析.按照该方案的描述, 制备并联合培养腹腔巨噬细胞和凋亡细胞。巨噬细胞在冰上被 pe 共轭抗 CD11b 抗体分离并染色20分钟。然后用流式细胞仪清洗和处理巨噬细胞。如图所示, 当培养物中没有添加凋亡细胞时, 右下角象限中没有 CFSE 阳性巨噬细胞 (图 1 a 和图 2, 第一面板)。硫勒糖刺激的?...

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讨论

细胞凋亡是一个高度保守的细胞死亡过程, 涉及许多信号级联, 并诱导蛋白质的表达, 分泌和运输。细胞凋亡常与细胞形态变化有关 17。凋亡细胞主动释放细胞因子和趋化因子, 吸引吞噬细胞迁移到该位点, 并在严格控制下启动吞没过程¹⁸。另一方面, 坏死细胞死亡释放引发炎症反应的危险信号¹。凋亡细胞的有效或长时间清除会导致这些细胞的继?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.