Экспериментальный анализ Апоптотического тимоцита с помощью макрофагов

Резюме

Здесь мы представляем протокол для подготовки апоптозных тимоцитов и перитонеальных макрофагов и анализировать эффективность эффофоцитоз и конкретных ингибитор-опосредованной блокировки апоптотического тимоцитов поглощает. Этот протокол имеет широкое применение в клеточной опосредованной зазор других частиц, включая искусственные бусы и бактерии.

Аннотация

Апоптоз клеток является естественный процесс и играет решающую роль в эмбрионального развития, гомеостатическое регулирование, индукции иммунной толерантности, и разрешение воспаления. Накопление апоптотического мусора в организме может вызвать хронические воспалительные реакции, которые приводят к системным аутоиммунным заболеваниям с течением времени. Нарушенного апоптотического клеточного допуска был замешан в различных аутоиммунных заболеваний. Апоптотический зазор – это сложный процесс, который редко обнаруживается в физиологических условиях. Она включает в себя обильные поверхностные рецепторы и сигнальные молекулы. Изучение процесса апоптотического клеточного расчистки обеспечивает проницательные молекулярные механизмы и последующие биологические реакции, которые могут привести к развитию новых терапевтических средств. Здесь мы описываем протоколы для индукции апоптотических тимоцитов, подготовку перитонеальных макрофагов, а так же анализ апоптотических клеточных расчистки по течению цитометрии и микроскопии. Все клетки будут подвергаться апоптозу на определенном этапе, и многие жилые и циркулирующих клеток может поглощения апоптотического мусора. Таким образом, описанный здесь протокол может быть использован во многих приложениях для характеризации апоптотического клеточного связывания и проглатывания многими другими типами клеток.

Введение

Наше тело генерирует 1-10 миллиард апоптотических клеток на ежедневной основе. Такое большое количество апоптотических клеток должно быть очищено таким образом, что иммунные реакции остаются покоя. Для обеспечения очистки апоптотических клеток своевременно, многочисленные виды тканей резидентов клеток и циркулирующих клеток разработать механизмы, чтобы поглотить апоптотических клеток¹. Дисфункциональные регулирование апоптоза был замешан в возникновении и прогрессирования различных воспалительных заболеваний и аутоиммунитет². Апоптоз также играет решающую роль в патогенезе развития рака и его последующее сопротивление традиционным лечения^3,4. Удаление апоптотических клеток обычно способствует противовоспалительной реакции, которые могут быть связаны с иммунологической толерантности⁵. Нарушение апоптотического клеточного расчистки стимулирует самоиммунизацию и способствует развитию системных аутоиммунных заболеваний как у людей, так и у мышей⁶.

Когда клетки проходят апоптоз, они подвергают воздействию фосфатидилсерина (Птдзер) из внутренней листки в внешнюю брошюру мембраны. Птдзер будет распознан фагоцитами через поверхностные рецепторы. Более десятка рецепторов были определены распознавать и/или способствовать поглощает апоптозных клеток. В общем, есть по крайней мере три типа поверхностных рецепторов, участвующих в апоптосной клеточной очистки: привязывая рецепторы, признают Апоптотические клетки; Щекотка рецепторов, инициировать поглощает; рецепторы, облегчающие весь процесс⁷. Таминовых рецепторов тирозина (там Риткс) состоят из Tyro-3, AXL, и мER и в первую очередь выражены миелоидных клеток иммунной системы⁸. Основная функция там Риткс заключается в том, чтобы служить привязывая рецепторы, облегчая фагоцитическое удаление апоптотических клеток и мусора. Наша группа изучила там опосредованный апоптотический клеточный зазор в условиях аутоиммунитета на долгие годы. Витамин к-зависимый рост белка арест специфического белка 6 (Gas6) и белка S (плюсы) связывается и активирует там рецепторы^9,10. Gas6 вырабатывается в сердце, почках и легких. Профи в основном производятся в печени¹¹. ТАМ признает апоптозных клеток таким образом, что N-терминал Gas6/профи связывается с Птдзер на апоптотической клетке и C-терминал Gas6/профи связывается с там рецепторов, которые закреплены на поверхности фагоцитов. Вместе с другими рецепторами, поглощает Апоптотические клетки происходит¹². Хотя Mer может связываться как с лигандами профи и Gas6, мы обнаружили, что Gas6, как представляется, единственным лигандов для Mer опосредованного фагоцитоза апоптоз клеток, которые могут быть заблокированы анти-Mer антитела¹³. Макрофаги являются профессиональными гогоцитами. Быстрое оформление апоптозных клеток макрофагами имеет важное значение для ингибирования воспаления и аутоиммунные реакции против внутриклеточных антигенов. Mer рецептор тирозинкиназы имеет решающее значение для затопления макрофагов и эффективного оформления апоптотических клеток¹⁴. В селезенке мыши, Mer главным образом выражает на предельной зоне и материальном теле макрофагах¹³.

Представленный здесь протокол описывает базовый метод индуцирования апоптоза клеток и демонстрирует способы измерения процесса и эффективности эффоцитоза. Эти протоколы могут быть легко адаптированы для изучения эффофоцитоз другими типами клеток в поглощает апоптозных клеток различного происхождения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Подопытных мышей разводили и поддерживали в нашей мышиных колониях. Все животные работы были проведены в соответствии с руководящими принципами институционального ухода за животными и Комитета по использованию (ИАКУК) Университета Цинциннати.

1. Подготовка CFSE помечены апоптотических тимоцитов

1. Эвтаназии двух наивных C57/В6 мышей по CO₂ вдыхании 10 мин и рассечения, чтобы открыть грудную полость, удалить (вытащить) тимуса с изогнутыми тонкой наконечник щипцы в ткань культуры Петри, содержащий 10 мл RPMI1640 среды.
2. Получить одну клеточную суспензию, шлифовальные весь тимус против двух матовое концы микроскопа слайды, а затем фильтр подвески через 100 мкм сетчатый фильтр.
3. Соберите суспензию 10 мл тимуса в трубку 50 mL и центрифугу на 300 x g в течение 5 мин.
4. Снимите supernatant, ресуспензируем в 40 мл 1x PBS, и Кол-во номера клеток с хемоцитометер.
5. Центрифуга на 300 x g для 5 мин и удалить supernatant.
6. Ресуспензируем в 20 мл 1x PBS в 50 mL трубки в качестве одной ячейки подвески с до 2 х 10⁸ клеток (если больше, чем 2 х 10⁸ клеток, ресуспензируем остальные клетки в другой 20 мл 1 х PBS в различных 50 ml трубки).
7. Сделать 5 мкм CFSE в равном объеме (20 мл) 1x PBS в отдельной 50 mL трубки на пипетки 40 мкл из CFSE складе решение (2,5 mM) в 20 мл 1x PBS и хорошо перемешать путем инвертинг трубки 2-3 раз.
8. Добавить 20 мл CFSE из шага 1,7 в 20 мл клеточной суспензии из шага 1,6 (окончательная концентрация CFSE в настоящее время 2,5 мкм).
   Примечание: для каждой ячейки суспензии 20 мл требуется 20 мл трубки CFSE.
9. Инвертировать ячейку и CFSE смесь трубки 2-3 раз и инкубировать смесь в темноте при комнатной температуре в течение максимум 2 мин, затем остановить реакцию, добавив 10 мл тепла-инактивированных лошадь сыворотки.
10. Центрифуга 50 mL смесь трубки на 300 x g для 5 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Если маркировка CFSE успешно, ячейки гранулы станет светло-желтого цвета.
11. Удалите супернатант и ресуспензируем ячейки гранул в 40 мл 1x PBS и Кол-номера клеток с хемоцитометер.
12. Центрифуга ячейки подвески на 300 x g в течение 5 минут и отбросить supernatant.
13. Вымойте ячейку гранул снова с 40 мл среднего RPMI1640.
14. Удалите супернатант и ресуспензируем клетки с RPMI1640 культуры ткани среды (RPMI1640, 20 мм HEPES, 10% ФБС (тепло инактивированных), 20 мм глютамина, и 1x Пен/стрептококк) при концентрации 7 х 10⁶ клеток/мл в 100 мм ткани культуры блюдо.
    Примечание: если больше клеток получены, отдельный 100-мм ткани культуры блюдо будет необходимо.
15. Добавьте ставроспорина в культуру суспензии клеток в конечной концентрации 1 мкм и культуры на 4 ч при температуре 37 ° с в инкубаторе культуры ткани поставляется с 5% CO₂.

2. Приготовление перитонеальных макрофагов

1. Впрыснуть два C57B6 мышей (или любой ген-манипулировали мышей в лаборатории) интрааперитиально с 1 мл 3% в возрасте тиоглисопоставления в день 0.
2. Эвтаназии мышей в день 5, как в шаге 1,1, вырезать и очистить открытой брюшной кожи, но оставить брюшины нетронутыми. Флеш брюшной полости, быстро нажав 10 мл буфера мытья (RPMI1640, 2% ФБС, 0,04% ЭДТА) в брюшной полости с использованием шприца 10 мл прилагается с 18 г иглы.
3. Медленно извлекайте буфер мытья с той же иглой/шприцом и соберите буфер для мытья в 50 mL (подробности относятся к лабораторной статье Янссен¹⁵).
4. Вымойте перитонеальный Гавриил дважды с 1x PBS, ресуспензируем перитонеальный макрофаги в RPMI1640 ткань культуры среды при плотности 2 х 10⁶ клеток/мл и Алиготе 500 мкл в каждый колодец 24-хорошо пластины. Оставьте тарелку в инкубаторе тканевой культуры на 2 ч.
5. Удалите плавающие клетки, аспирин и заменив 500 мкл свежей культуры среды, в два раза.
6. По желанию добавьте ингибитор тирозин там рецептора, RXDX-106, в концентрациях, указанных в рисунке легенды в каждый колодец макрофагов культуры и инкубировать еще 2 ч.

3. co-культура перитонеальных макрофагов с апоптотической тимоцитов

1. Соберите Апоптотические тимоциты из шага 1 и промойте три раза с RPMI1640 средой. Эффективность апоптотической индукции можно измерить на данном этапе с помощью приложения V/7-ад.
2. Распределите 0-12 x 10⁶ клеток (в 500 мкл среды) в каждый колодец макрофагов культур от протокола #2, в соответствии с экспериментальной договоренности (например, см. диаграмму 1). Это делает весь объем культуры 1 мл в каждом хорошо 24-хорошо пластины. Добавить блокирующего антитела в культуру непосредственно перед добавлением апоптотических тимоцитов.
3. Культура клеточной смеси при температуре 37 ° c для 4 ч в инкубаторе культуры ткани поставляется с 5% CO₂.
4. Вымойте каждый колодец культуры с 1x PBS (содержащий 500 мкм ЭДТА) дважды, чтобы удалить свободно плавающие апоптозных клеток.
5. Пятно пластины связанных макрофаги с CD11b-PE на данном этапе.
   1. Вымойте пластины связанных макрофаги с окрашивания буфера (1x PBS, 1% БСА) один раз.
   2. Добавьте 200 мкл окрашивания буфера, содержащего 2 мкл CD11b-PE в каждый колодец.
   3. Инкубировать пластины при температуре 4 °C в течение 20 мин.
   4. Вымойте каждый колодец пластины три раза с окрашивания буфера.
   5. Добавить 200 мкл окрашивания буфера и приступить пластины для анализа изображений под флуоресцентным микроскопом.
6. Кроме того, отделить пластины связанных макрофагов, добавив 1 мл 1% лидокаин в PBS и инкубации в течение 10 минут при температуре 37 ° c.
7. Отсоедините пластину связанных макрофагов с повторным пипеткой.
8. Перенесите суспензию макрофагов в индивидуальную 5 мл-нижнюю панель FACS с каждой скважины 24-хорошо пластины.
9. Центрифуга на 300 x g в течение 5 мин.
10. Удалите супернатант и добавьте 200 мкл окрашивания буфера, содержащего 2 мкл CD11b-PE (1:200 разбавления в буфере окрашивания).
11. Инкубировать клеточную суспензию в окрашивании буфера при температуре 4 °C в течение 20 мин.
12. Вымойте клеточную подвеску дважды при окрашивании буфера.
13. Добавить 200 мкл окрашивания буфера и приступить к анализу FACS с потоком cytometer и проанализировать процент от макрофагов положительности CFSE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Анализ перитонеального макрофага-опосредованного затопления апоптотических тимоцитов. Перитонеальных макрофагов и апоптотических клеток были подготовлены и совместно культивировали как описано в протоколе. Макрофаги были отделены и запятнанные с a сопрягано Anti-CD11b антител...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Апоптоз является высоко консервативны клеточной смерти процесс, который включает в себя множество каскадов сигнала и индуцирует выражение белка, секреции и транспортировки. Апоптоз часто ассоциируется с клеточными изменениями морфологии¹⁷. Апоптотические клетки активно...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.