Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour préparer les thymocytes apoptotiques et les macrophages péritonéaux et analyser l’efficacité de l’effocytose et le blocage spécifique par inhibiteur de l’engloutement des thymocytes apoptotiques. Ce protocole a une application large dans le dégagement de cellules-médiation d’autres particules y compris les billes artificielles et les bactéries.

Résumé

L’apoptose cellulaire est un processus naturel et joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire, la régulation homéostatique, l’induction de la tolérance immunitaire et la résolution de l’inflammation. L’accumulation de débris apoptotiques dans le corps peut déclencher des réactions inflammatoires chroniques qui conduisent à des maladies auto-immunes systémiques au fil du temps. Une altération de la clairance des cellules apoptotiques a été impliquée dans une variété de maladies auto-immunes. La clairance apoptotique est un processus complexe rarement détecté dans des conditions physiologiques. Il implique des récepteurs de surface abondants et des molécules de signalisation. L’étude du processus de clairance des cellules apoptotiques fournit des mécanismes moléculaires perspicaces et des réponses biologiques ultérieures, ce qui peut conduire au développement de nouvelles thérapies. Ici, nous décrivons les protocoles pour l’induction des thymocytes apoptotiques, la préparation des macrophages péritonéaux, et l’analyse de la clairance des cellules apoptotiques par cytométrie en flux et microscopie. Toutes les cellules seront soumises à une apoptose à un certain stade, et de nombreuses cellules résidentielles et circulantes peuvent absorber les débris apoptotiques. Par conséquent, le protocole décrit ici peut être utilisé dans de nombreuses applications pour caractériser la liaison de cellules apoptotiques et l’ingestion par de nombreux autres types de cellules.

Introduction

Notre corps génère 1-10 milliards de cellules apoptotiques sur une base quotidienne. Un tel grand nombre de cellules apoptotiques doit être effacé de manière à ce que les réponses immunitaires demeurent quiescentes. Pour assurer le dégagement des cellules apoptotiques en temps opportun, de nombreux types de cellules résidentes de tissu et de cellules circulantes développent des mécanismes pour engloutir les cellules apoptotiques¹. La régulation dysfonctionnelle de l’apoptose a été impliquée dans l’apparition et la progression de diverses maladies inflammatoires et de l’auto-immunité². L’apoptose joue également un rôle crucial dans la pathogenèse du développement du cancer et sa résistance subséquente aux traitements conventionnels^3,4. L’élimination des cellules apoptotiques favorise généralement une réponse anti-inflammatoire, qui peut être liée à la tolérance immunologique⁵. La perturbation de la clairance des cellules apoptotiques entraîne l’auto-immunisation et contribue au développement de maladies auto-immunes systémiques chez l’homme et la souris⁶.

Lorsque les cellules subissent l’apoptose, elles exposent la phosphatidylsérine (PtdSer) de la foliole interne à la foliole externe de la membrane. Le PtdSer sera alors reconnu par les phagocytes par les récepteurs de surface. Plus d’une douzaine de récepteurs ont été identifiés pour reconnaître et/ou faciliter l’engloutement des cellules apoptotiques. En général, il existe au moins trois types de récepteurs de surface impliqués dans le dégagement des cellules apoptotiques: récepteurs d’attachement, reconnaître les cellules apoptotiques; les récepteurs de chatouillement, initier l’engulfment; les récepteurs de chaperonner, facilitent l’ensemble du processus⁷. Les tyrosine kinases du récepteur TAM (TAM RTKs) consistent en Tyro-3, AXL et Mer et sont principalement exprimées par les cellules myéloïdes du système immunitaire⁸. La fonction principale de TAM RTKs est de servir de récepteurs d’attachement, facilitant l’élimination phagocytaire des cellules apoptotiques et des débris. Notre groupe a étudié la clairance cellulaire apoptotique médiée par TAM dans le cadre de l’auto-immunité pendant de nombreuses années. La protéine dépendante de la vitamine K-dépendant de l’arrestation de protéine 6 (Gas6) et de protéine S (ProS) se lie à et active les récepteurs de Tam^9,10. Gas6 est produit dans le coeur, les reins et les poumons. Les ProS sont principalement produits dans le foie¹¹. TAM reconnaît des cellules apoptotiques de telle sorte que le N-terminal de Gas6/ProS se lie au PtdSer sur une cellule apoptotique et le C-terminal de Gas6/ProS se lie aux récepteurs TAM qui ancrés sur la surface des phagocytes. Avec les autres récepteurs, l’flammes des cellules apoptotiques se produit¹². Bien que mer puisse se lier à la fois pour les ligands ProS et Gas6, nous avons constaté que Gas6 semble être le seul ligand pour la phagocytose de macrophages de cellules apoptotiques médiées par mer, qui peut être bloquée par l’anticorps anti-mer¹³. Les macrophages sont des phagocytes professionnels. L’élimination rapide des cellules apoptotiques par les macrophages est importante pour l’inhibition de l’inflammation et des réponses auto-immunes contre les antigènes intracellulaires. Le récepteur de la mer tyrosine kinase est essentiel pour l’engloutement des macrophages et une clairance efficace des cellules apoptotiques¹⁴. Dans la rate de souris, mer exprime principalement sur la zone marginale et les macrophages corporels¹³.

Le protocole présenté ici décrit une méthode de base pour induire l’apoptose cellulaire et de démontrer des moyens de mesurer le processus et l’efficacité de l’effocytose. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés pour étudier l’effocytose par d’autres types de cellules dans l’flammes de cellules apoptotiques d’origines différentes.

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Protocole

Des souris expérimentales ont été élevées et maintenues dans notre colonie de souris. Tous les travaux sur les animaux ont été menés conformément aux directives du Comité institutionnel de l’Université de Cincinnati sur les soins et l’utilisation des animaux (IACUC).

1. préparation des thymocytes apoptotiques étiquetés CFSE

1. Euthanasier deux souris C57/B6 naïves par CO₂ inhalation pendant 10 min et disséquer pour ouvrir la cavité thoracique, enlever (retirer) le thymus avec des pinces fines incurvées dans la boîte de Petri de culture tissulaire contenant 10 ml de milieu RPMI1640.
2. Obtenir une suspension à une seule cellule en broyant le thymus entier contre deux extrémités givrées des lames du microscope, puis filtrer la suspension à l’aide de la passoire à cellules 100 μM.
3. Prélever la suspension de thymus de 10 mL dans un tube de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
4. Retirer le surnageant, resuspendre dans 40 mL de 1x PBS, et compter les nombres de cellules avec un hémocytomètre.
5. Centrifugez à 300 x g pendant 5 min et enlevez le surnageant.
6. Resuspendre dans 20 mL de 1x PBS dans un tube de 50 mL comme suspension à une seule cellule avec jusqu’à 2 x 10⁸ cellules (si plus de 2 x 10⁸ cellules, resuspendre le reste des cellules dans un autre 20 ml de 1 x PBS dans un tube de 50 ml différent).
7. Faire 5 μM de CFSE en volume égal (20 mL) de 1x PBS dans un tube séparé de 50 mL en pipetant 40 μL de solution d’action de CFSE (2,5 mM) dans 20 mL de 1x PBS et bien mélanger en invertant le tube 2-3 fois.
8. Ajouter les 20 mL de CFSE de l’étape 1,7 dans les 20 mL de suspension cellulaire de l’étape 1,6 (la concentration finale de CFSE est maintenant de 2,5 μM).
   Remarque: pour chaque suspension de cellule de 20 mL, un tube de 20 mL de CFSE est nécessaire.
9. Inversez la cellule et le tube de mélange de CFSE 2-3 fois et Incubez le mélange dans l’obscurité à température ambiante pendant un maximum de 2 min, puis arrêtez la réaction en ajoutant 10 mL de sérum de cheval inactivé à la chaleur.
10. Centrifuger le mélange de tube de 50 mL à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    Remarque: si l’étiquetage CFSE réussit, le culot de la cellule deviendra de couleur jaune clair.
11. Retirer le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire dans 40 mL de 1x PBS et compter les nombres de cellules avec un hémocytomètre.
12. Centrifugez la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min et jetez le surnageant.
13. Laver à nouveau le culot de la cellule avec 40 mL de milieu RPMI1640.
14. Enlevez le surnageant et resuspendez les cellules avec le milieu de culture tissulaire RPMI1640 (RPMI1640, 20 mm HEPES, 10% FBS (chaleur inactivée), 20 mM de glutamine et 1x PEN/STREP) à une concentration de 7 x 10⁶ cellules/ml dans un plat de culture tissulaire de 100 mm.
    Remarque: si plus de cellules sont obtenues, un plat de culture de tissu de 100 mm séparé sera nécessaire.
15. Ajouter la la staurosporine dans la culture de suspension cellulaire à une concentration finale de 1 μM et la culture pendant 4 h à 37 ° c dans un incubateur de culture tissulaire fourni avec 5% de CO₂.

2. préparation des macrophages péritonéaux

1. Injecter deux souris C57B6 (ou toute souris manipulée par un gène dans le laboratoire) par voie intrapéritonéale avec 1 ml de thioglycolate vieilli à 3% au jour 0.
2. Euthanasier les souris au jour 5 comme à l’étape 1,1, couper et peler ouvrir la peau abdominale, mais laisser le péritoneum intact. Rincer la cavité péritonéale en poussant rapidement 10 mL de tampon de lavage (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 10 mL attachée avec une aiguille de 18 G.
3. Récupérez lentement le tampon de lavage avec la même aiguille/seringue et collectez le tampon de lavage dans un tube de 50 mL (les détails se rapportent à l’article¹⁵du laboratoire Janssen).
4. Lavez le gavage péritonéal deux fois avec 1x PBS, Resuspendez les macrophages péritonéaux dans le milieu de culture tissulaire RPMI1640 à une densité de 2 x 10⁶ cellules/ml et aliquote 500 μl dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Laisser la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 2 h.
5. Retirer les cellules flottantes en aspirant et en remplaçant avec 500 μL de milieu de culture fraîche, deux fois.
6. Eventuellement, ajouter l’inhibiteur de tyrosine de récepteur de TAM, RXDX-106, aux concentrations indiquées dans les légendes de figure dans chaque puits de la culture de macrophages et incuber pendant 2 h.

3. co-culture des macrophages péritonéaux avec des thymocytes apoptotiques

1. Collectez les thymocytes apoptotiques de l’étape 1 et lavez trois fois avec le milieu RPMI1640. L’efficacité de l’induction apoptotique peut être mesurée à ce stade avec le kit Annexin V/7-AAD.
2. Distribuer 0-12 x 10⁶ cellules (en 500 μl de milieu) dans chaque puits des cultures de macrophages du protocole #2, selon l’arrangement expérimental (p. ex., voir la figure 1). Cela rend le volume de culture entier de 1 mL dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Ajouter l’anticorps bloquant dans la culture immédiatement avant l’addition de thymocytes apoptotiques.
3. Culture du mélange cellulaire à 37 ° c pendant 4 h dans un incubateur de culture tissulaire fourni avec 5% de CO₂.
4. Lavez chaque puits de la culture avec 1x PBS (contenant 500 μM d’EDTA) deux fois pour enlever les cellules apoptotiques flottantes.
5. Tache les macrophages liés à la plaque avec CD11b-PE à ce stade.
   1. Lavez les macrophages liés à la plaque avec un tampon de coloration (1x PBS, 1% BSA) une fois.
   2. Ajouter 200 μL de tampon de coloration contenant 2 μL de CD11b-PE dans chaque puits.
   3. Incuber la plaque à 4 ° c pendant 20 min.
   4. Lavez chaque puits de la plaque trois fois avec le tampon de coloration.
   5. Ajouter 200 μL de tampon de coloration et continuer la plaque pour l’analyse d’image sous le microscope fluorescent.
6. Alternativement, détachez les macrophages liés à la plaque en ajoutant 1 mL de lidocaïne à 1% dans le PBS et en incubant pendant 10 min à 37 ° c.
7. Détachez les macrophages liés à la plaque avec le pipetage répété.
8. Transférer la suspension de macrophages dans un tube FACS à fond rond de 5 mL de chaque puits de la plaque de 24 puits.
9. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
10. Retirer le surnageant et ajouter 200 μL de tampon de coloration contenant 2 μL de CD11b-PE (1:200 dilution dans le tampon de coloration).
11. Incuber la suspension cellulaire dans le tampon de coloration à 4 ° c pendant 20 min.
12. Lavez la suspension cellulaire deux fois avec un tampon de coloration.
13. Ajouter 200 μL de tampon de coloration et procéder à l’analyse FACS avec un cytomètre de flux et analyser le pourcentage de macrophages de positivité CFSE.

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Résultats

Analyse de l’engloutement de thymocytes apoptotiques par le macrophage péritonéal. Les macrophages péritonéaux et les cellules apoptotiques ont été préparés et co-cultivés comme décrit dans le protocole. Les macrophages ont été détachés et colorés avec l’anticorps anti-CD11b conjugué au PE pendant 20 min sur la glace. Les macrophages ont ensuite été lavés et transformés dans un cytomètre à flux. Comme on le voit, il n’y a pas de macrophages positif CFSE dans le quadrant infér...

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Discussion

L’apoptose est un processus de mort cellulaire hautement conservé qui implique de nombreuses cascades de signaux et induit l’expression des protéines, la sécrétion et le transport. L’apoptose est souvent associée à des changements de morphologie cellulaire¹⁷. Les cellules apoptotiques libèrent activement des cytokines et des chimiokines qui attirent les phagocytes pour migrer vers le site et initier le processus d’engloutement, une voie extrêmement complexe sous contrôle serré

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.