JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, apoptotik tirositler ve periton makrofajlar hazırlamak ve effersitoz verimliliğini ve apoptotik tirositlerin özel inhibitörü-aracılı engellemesini analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol yapay boncuk ve bakteri dahil olmak üzere diğer parçacıklar hücre aracılı boşluk geniş bir uygulama vardır.

Özet

Hücre apoptozis doğal bir süreçtir ve embriyonik gelişim, homeostatik düzenleme, bağışıklık toleransı indüksiyon ve inflamasyonun çözünürlüğü önemli bir rol oynar. Vücutta apoptotik enkaz birikimi zaman içinde sistemik otoimmün hastalıklara yol açan kronik inflamatuar tepkiler tetikleyebilir. Engelli apoptotik hücre boşluğu, çeşitli otoimmün hastalıklarda karışmıştır. Apoptotik boşluk fizyolojik koşullarda nadiren algılanan karmaşık bir süreçtir. Bu bol yüzey reseptörleri ve sinyalizasyon molekülleri içerir. Apoptotik hücre boşluğu sürecini incelemek, yeni terapilerinin gelişmesine yol açabilecek anlayışlı moleküler mekanizmalar ve sonraki biyolojik tepkiler sağlar. Burada, apoptotik tirositlerin indüksiyonu, periton makrofajların hazırlanması, ve osiyometri ve mikroskopi ile apoptotik hücre boşluğu analizi için protokoller açıklanmaktadır. Tüm hücreler belirli bir aşamada apoptozis geçecek, ve birçok konut ve dolaşım hücreleri apoptotik enkaz alabilir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol birçok uygulamada apoptotik hücre bağlama ve diğer birçok hücre türleri tarafından yutulması karakterize etmek için kullanılabilir.

Giriş

Vücudumuzun günlük olarak 1-10 milyar apoptotik hücreler üretir. Apoptotik hücrelerin böyle çok sayıda bağışıklık tepkiler sessiz kalır bir şekilde temizlenmelidir. Apoptotik hücrelerin zamanında temizlenmesini sağlamak için, çok sayıda doku yerleşik hücresi ve dolaşım hücresi apoptotik hücreleri yutan mekanizmalar geliştirir1. Çeşitli enflamatuar hastalığın ve otoimmün2' nin başlangıcı ve progresyonunda apoptozin işlevsiz olarak düzenlenmesi ortaya çıkarılmıştır. Apoptosis Ayrıca kanser gelişiminin patogenezinde ve Konvansiyonel tedavilere karşı sonraki direncinde kritik bir rol oynamaktadır3,4. Apoptotik hücrelerin kaldırılması genellikle immünolojik tolerans5ile bağlantılı olabilecek bir anti-inflamatuar yanıtı teşvik eder. Apoptotik hücre boşluklarının bozulması kendi kendine immünizasyonu tahrik ediyor ve hem insanlar hem de fareler6' da sistemik otoimmün hastalıkların gelişmesine katkıda bulunur.

Hücreler apoptozis geçmesi, onlar fosfatidilserine maruz (PtdSer) membranın dış broşür için iç broşür. Ptdser daha sonra yüzey reseptörleri ile fagositler tarafından tanınacaktır. Bir düzine reseptörlerin üzerinde tanımak ve/veya apoptotik hücrelerin yutulma kolaylaştırmak için tespit edilmiştir. Genel olarak, apoptotik hücre boşlukunda yer alan en az üç tip yüzey reseptörü vardır: reseptörleri tethering, apoptotik hücreleri tanımak; gıdıklamalar reseptörleri, başlatmak engulfment; reseptörleri, tüm süreci kolaylaştırmak7. TAM reseptör Tirozin kinazlar (TAM RTKs) TYRO-3, AXL ve Mer oluşur ve öncelikle bağışıklık sisteminin miyeloid hücreleri tarafından ifade edilir8. TAM RTKs 'nin birincil fonksiyonu, apoptotik hücrelerin ve enkaz fagositik çıkarılması kolaylaştırarak, tethering reseptörleri olarak hizmet etmektir. Grubumuz yıllardır otoimmünite ortamında TAM aracılı apoptotik hücre boşluğu okudu. K vitamini bağımlı protein büyüme tutuklama spesifik protein 6 (Gas6) ve protein S (artıları) bağlar ve tam reseptörleri aktive9,10. Gas6 kalp, böbrek ve akciğerde üretilmektedir. Artılar ağırlıklı olarak karaciğerde üretilmektedir11. TAM apoptotik hücrelerin Gas6/ProS N-terminali apoptotik bir hücre üzerinde PtdSer bağlanır ve Gas6/ProS C-terminali fagositlerin yüzeyine demirlemiş TAM reseptörlerine bağlanır böyle bir şekilde tanır. Diğer reseptörlerle birlikte, apoptotik hücrelerin Yutulmaları12oluşur. Mer hem ligin artıları ve Gas6 bağlayabilirsiniz olsa da, biz Gas6 tek ligand olarak görünür olduğunu bulundu, bu anti-Mer antikor tarafından engellenmiş olabilir apoptotik hücrelerin Mer-aracılı makrophaj fagositoz13. Macrofajlar profesyonel phagocytes vardır. Apoptotik hücrelerin makrofajlar tarafından hızlı bir şekilde temizlenmesi, inflamasyonun inhibisyonu ve hücre içi antijenlere karşı otoimmün tepkiler için önemlidir. Mer reseptörü Tirozin kinaz, makrophaj Yutulmaları ve apoptotik hücrelerin etkili boşluğu için önemlidir14. Fare dalağında, Mer ağırlıklı olarak marjinal bölge ve somut vücut makrofajlar13ifade eder.

Burada sunulan protokol, hücre apoptozu ikna etmek ve süreci ve efferocytosis etkinliğini ölçmek için yollar göstermek için temel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokoller, farklı kökenlerin apoptotik hücrelerin yutulmasında diğer hücre türleri tarafından effersitoz çalışması için kolayca adapte edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Deneysel fareler, fareler kolonisinde yetiştirilen ve sürdürülür. Tüm hayvan çalışmaları, Cincinnati Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıERUC) yönergelerine göre yapılmıştır.

1. CFD etiketli apoptotik thymosit hazırlanması

  1. İki naif C57/B6 fareler tarafından Co2 inhalasyon için 10 dakika ve göğüs boşluğu açmak için ortadan kaldırmak, çıkarmak (dışarı çekin) eğri ince uçlu forseps ile doku kültürü Petri yemek içine timus 10 ml RPMI1640 orta.
  2. Mikroskop slaytlar iki buzlu uçları karşı tüm timus taşlama ve sonra 100 μm hücre süzgeci ile süspansiyon filtre tek hücreli süspansiyon elde.
  3. 10 ml timus süspansiyon 50 ml tüp içine toplamak ve 5 dakika için 300 x g Santrifüjü.
  4. , 40 ml 1x PBS içinde pelletini, supernatant çıkarın ve bir hemocytometer ile hücre numaralarını saymak.
  5. 300 x g 'de santrifüjün 5 dakika ve süpernatant çıkarın.
  6. 2 x 10 8 hücrelere kadar tek hücreli süspansiyon olarak 50 ml 'lik bir tüpte 20 ml 1x PBS içinde pelletini ( Eğer daha fazla 2 x 108 hücreler, başka bir hücre geri kalanı yeniden pelletini 20 ml farklı bir 50 ml tüp 1 x PBS).
  7. 5 μM CFSE 'ye eşit hacimli (20 mL) 1x PBS ile ayrı bir 50 mL tüpte pipetleme 40 μL CFSE stok çözeltisi (2,5 mM) ile 20 mL 1x PBS içine yerleştirin ve tüpü 2-3 kez tersine çevirerek iyi karıştırın.
  8. Ekle 20 mL CFSE dan adım 1,7 içine 20 mL hücre süspansiyon adım 1,6 (CFSE son konsantrasyonu şimdi 2,5 μM).
    Not: her 20 mL hücreli süspansiyon Için 20 mL CFSE tüpü gereklidir.
  9. Hücre ve CFSE karışımı tüp 2-3 kez tersine çevir ve 2 dakika en fazla oda sıcaklığında karanlıkta karışımı inhale, daha sonra 10 mL ısı inaktive at serumu ekleyerek reaksiyonu durdurun.
  10. 50 mL tüp karışımından 300 x g 'de oda sıcaklığında 5 dakika Santrifüjü.
    Not: CFSE etiketleme başarılı olursa, hücre Pelet renk açık sarı olacak.
  11. Süpernatant çıkarın ve 40 ml 1x PBS içinde hücre Pelet pelletini ve bir hemocytometer ile saymak hücre numaraları.
  12. Hücre süspansiyon 300 x g 5 dakika Santrifüjü ve supernatant atın.
  13. 40 ml RPMI1640 orta ile tekrar hücre Pelet yıkayın.
  14. RPMI1640 doku kültürü Orta (RPMI1640, 20 mm HEPES, 10% FBS (ısı inaktive), 20 mm glutamin ve 1x pen/strep) ile süpernatant ve pelletini hücreleri kaldırmak 100 mm doku kültürü çanak 7 x 106 hücreler/ml konsantrasyonda.
    Not: daha fazla hücre elde edilir, ayrı bir 100 mm doku kültürü çanak gerekir.
  15. % 5 CO2ile birlikte verilen doku kültürü inkübatörü Içinde 37 °c ' de 4 h Için 1 μM ve kültürün son konsantrasyonunda hücre süspansiyon kültürüne staurosporin ekleyin.

2. periton makrofajlar hazırlanması

  1. İki C57B6 fareler (veya laboratuvarda herhangi bir gen manipüle fareler) intraperitoneal 1 ml% 3 yaş thioglycollate 0 ile enjekte.
  2. Adım 1,1 olarak gün 5 ' te fareler euthanize, kesilmiş ve karın derisi açık soyma ama periton bozulmamış bırakın. Periton boşluğu, 18 G iğne ile bağlı 10 ml 'lik bir şırınga kullanarak periton boşluğa 10 ml yıkama tamponunu (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) hızlı bir şekilde itmek suretiyle temizleyin.
  3. Yıkama tamponunu aynı iğne/şırınga ile yavaşça alın ve yıkama tamponunu 50 mL 'Lik bir tüpün içine toplayın (detaylar Janssen Lab madde15' e bakın).
  4. İki kez 1x PBS ile periton gavaj yıkayın, 2 x 106 hücreler/ml ve kısım 500 μL bir yoğunlukta RPMI1640 doku kültürü ortamında periton makrofajlar pelletini her iyi 24-kuyu plaka içine. 2 h için bir doku kültürü kuluçk plaka bırakın.
  5. Kayan hücreleri, iki kez 500 μL taze kültür ortamı ile duman çekiş ve değiştirerek kaldırın.
  6. İsteğe bağlı olarak, TAM reseptör Tirozin inhibitörü, RXDX-106, şekil efsanelerinde gösterilen konsantrasyonlarda makrophaj kültürünün her bir iyi içine ekleyin ve başka bir 2 h için inküye.

3. apoptotik thymosit ile periton makrofajların ortak kültürü

  1. 1. adımda apoptotik thymositler toplayın ve RPMI1640 orta ile üç kez yıkayın. Apoptotik indüksiyon verimliliği bu aşamada Annexin V/7-AAD kiti ile ölçülebilir.
  2. Deneysel düzenlemeye göre (örn., bkz. Şekil 1) 0-12 x 106 hücreleri (500 μL orta) protokol #2 makrophaj kültürlerinin her bir kuyunda dağıtın. Bu 24-kuyu plaka her iyi 1 mL tüm kültür hacmi yapar. Apoptotik thymosit ilavesi hemen önce kültür içine engelleme antikor ekleyin.
  3. % 5 CO2ile birlikte verilen bir doku kültürü kuluçte 4 h Için 37 °c ' de hücre karışımı kültürü.
  4. Ücretsiz yüzen apoptotik hücreleri kaldırmak için iki kez 1x PBS (500 μM EDTA içeren) ile kültürün her iyi yıkayın.
  5. Bu aşamada CD11b-PE ile plaka bağlı makrofajlar leke.
    1. Plakaya bağlı makrofajları bir kez boyama tamponunu (1x PBS,% 1 BSA) yıkayın.
    2. Her kuyunda 2 μL CD11b-PE içeren 200 μL boyama tamponu ekleyin.
    3. Plakası 4 °C ' de 20 dakika boyunca inküyin.
    4. Boya tamponu ile plakanın her iyi üç kez yıkayın.
    5. 200 μL boyama tamponu ekleyin ve floresan mikroskobu altında görüntü analizi için plaka devam edin.
  6. Alternatif olarak, PBS 'de 1% 1 ml lidokain ekleyerek plakaya bağlı makrofajları ayırın ve 37 °c ' de 10 dak.
  7. Plakaya bağlı makrofajları tekrar pipetleme ile ayırın.
  8. Makrophaj süspansiyonunu bireysel 5 mL yuvarlak alt FACS tüpüne 24-kuyu plakasının her bir kuyusuna aktarın.
  9. 300 x g 'de santrifüjün 5 dk.
  10. Süpernatant 'ı çıkarın ve 2 μL CD11b-PE (boyama tamponunda 1:200 seyreltme) içeren 200 μL boya tamponu ekleyin.
  11. Hücre süspansiyonunu 4 °C ' de 20 dakika boyunca boyama tamponunun içine atın.
  12. Hücre süspansiyonunu iki kez boyama tampon ile yıkayın.
  13. 200 μL boyama tamponu ekleyin ve bir akış sitometresi ile FACS analizi için devam ve cfse pozitifliği makrofajlar yüzdesi için analiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Apoptotik tirmositlerin periton makrophaj aracılı Yutulmaları analizi. Peritoneal makrofajlar ve apoptotik hücreler, protokolde açıklandığı gibi hazırlanmış ve kültürlü bir şekilde hazırlanmıştır. Macrofajlar müstakil ve buz üzerinde 20 dakika boyunca PE konjuza Anti-CD11b antikor ile lekelenmiş. Makrofajlar sonra yıkanır ve bir akış cytometer işlenir. Görüldüğü gibi, kültürde hiçbir apoptotik hücre eklenmediği zaman sağ alt çeyreğinde CFSE pozitif makrophaj bulun...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Apoptozis birçok sinyal Cascades içeren ve protein ifadesi, salgılanması ve ulaşım indükler bir son derece uyumlu hücre ölüm sürecidir. Apoptozis genellikle hücresel morfoloji değişiklikleri ile ilişkilidir17. Apoptotik hücreler, site 'ye göç etmek için fagositler çeken sitokinleri ve kemokinlere aktif olarak serbest bırakır ve sıkı kontrol18' in altında son derece karmaşık bir yol olan alay sürecini başlatır. Öte yandan, necrotik hücre ölü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Shao laboratuvarında yapılan araştırmalar, tıp fakültesinden araştırma yenilikçi Ödülü ve Iç tıp bölümü 'nden küçük fakülte pilot Ödülü, Cincinnati Üniversitesi ve NIDDK/NıH 'dan Grant DK K01_095067 tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ack lysing bufferGIBCOA10492
Annexin V/7-AADBD Pharmingen559763
Anti-Mer antibodyR&D SystemsBAF591
CD11b-PE (clone M1/70)BD Pharmingen553311
CFSEInvitrogenC1157
DMSOSigma-AldrichD-2650
EDTA (0.5 mM)GIBCO15575-020
FACS tubesBD Biosciences352017
Frosted slidesFisher Scientific12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)Invitrogen26050088
LidocaineSigma-AldrichL-5647Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1xCorning21040CV
RPMI-1640Corning10040CV
RXDX-106Selleck ChemicalsCEP-40783
Staurosprine (100mg)Fisher ScientificBP2541-100Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer ModifiedBD Biosciences243010Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

Referanslar

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319(2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 147makrophajapoptotik h crelereffersitozimm nofluorescent mikroskopisiak sitometriTAM resept r Tirozin kinazlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır