慢性CDK9抑制的基于小鼠细胞系的模型，研究癌症中普遍存在的非遗传转录伸长缺陷（TE肯定）

摘要

该方案详细介绍了非遗传缺陷转录伸长的体外鼠癌模型。在这里，CDK9的慢性抑制用于抑制RNA Pol II沿亲炎反应基因的生产性伸长，以模仿和研究临床上过度服务的TE^绝对现象，存在于大约20%的所有癌症类型中。

摘要

我们以前曾报道过，癌症的子集是由全球转录性去规则定义的，mRNA转录伸长（TE）中广泛缺乏——我们称这种癌症为TE^肯定。值得注意的是，TE^绝对癌症的特点是在一组大基因（如干扰素/JAK/STAT 和 TNF/NF-+B 通路）中出现杂散转录和错误 mRNA 处理，导致其抑制。肾细胞癌和转移性黑色素瘤患者肿瘤的TE^绝对亚型与免疫治疗反应不良和结果显著_相关。鉴于研究TE^绝对癌症的重要性——因为它预示着免疫治疗的重大障碍——该协议的目标是建立一个体外TE^绝对小鼠模型，以研究这些广泛、非遗传的癌症的转录异常，获得新的见解，现有药物的新用途，或找到对付此类癌症的新策略。我们详细介绍了使用慢性黄酮介导CDK9抑制来废除RNA聚合酶II（RNA Pol II）C端重复域（CTD）上丝氨酸2残留物磷酸化，抑制RNA Pol II释放到生产性转录伸长。鉴于TE^绝对癌症没有分类于任何特定的躯体突变，药理学模型是有利的，并且最好模仿在它们中观察到的广泛转录和表观遗传缺陷。使用优化的亚致命剂量的浮华比是创建转录伸长和mRNA处理缺陷的非遗传广泛破坏的可推广模型的唯一有效策略，与临床观察的TE相仿^绝对的特点。因此，TE的这个模型^绝对可以利用解剖细胞自主因素，使它们能够抵抗免疫介导细胞攻击。

引言

几乎所有活性基因表达的一个关键速率限制步骤是RNA聚合酶II（RNA Pol II）从促进子级近端暂停向生产性伸长^率1、2的过渡。鉴于转录伸长的表观遗传调节有助于多次人类恶性肿瘤的进展，定义为TE^肯定，导致在亲炎反应通路中导致次优信号，相当于一个差的反应免疫^疗法3的结果，这个方案的首要目标是建立一个有用的体外模型来研究这些广泛的非遗传转录异常在癌症。因此，使用CDK9的慢性药理抑制是一种有效的策略，用于创建转录伸长和mRNA处理缺陷的非遗传广泛破坏的可推广模型。使用慢性CDK9抑制的原理是，它废除了RNA Pol II的C端重复域（CTD）上丝氨酸2残留物的磷酸化，从而抑制了RNA Pol II释放到生产性转录伸长。此外，TE^绝对癌症，以前描述我们^组3，没有分类下任何特定的躯体突变。因此，非遗传（药理学）模型是有利的，最好地模仿其中观察到的广泛转录和表观遗传缺陷。本文详细介绍了鼠癌细胞慢性黄体治疗模型的产生和表征。这种方法明显干扰了以长基因组长度为特征的基因的转录伸长，具有稳定启动子和诱导表达，如TNF/NF-B和干扰素/STAT信号，在转录伸长^位3，4，5。总体而言，这种可转录伸长缺陷的优化的鼠细胞系模型——我们了解的唯一模型，可以研究新描述的TE^绝对肿瘤——驱动抗肿瘤免疫攻击的抵抗力，从而产生一个有用的系统来利用和研究癌症核心转录机制中非遗传缺陷相对于免疫介导细胞攻击的脆弱性。

研究方案

辛辛那提儿童研究基金会的机构动物护理和使用委员会和机构生物安全委员会批准了所有动物实验程序（IACUC 协议#2017-0061 和 IBC 协议 #IBC2016-0016），这些实验是按照NIH《实验室动物护理和使用指南》中所述的标准进行的。

1. 通过黄酮治疗对RNA波尔II的慢性抑制-基本策略

1. 种子B16/F10小鼠黑色素瘤细胞在低密度（0.2 x 10^6）在10厘米培养板在其相应的介质（Dulbeco的改性鹰介质[DMEM]，10%胎儿牛血清[FBS]，1%青霉素和链霉素[Pen/链球菌]）和孵育过夜在37°C，5%CO2加湿培养箱中。
2. 后天，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞，并添加一批新的培养基，其中含有亚致死剂量（估计为25 nM）的黄酮，这是RNA Pol II伸长因子p-TEFb（环素T/CDK9）的抑制剂，为期一周，无需进一步子培养。
3. 经过一周的黄斑醇治疗后，执行确认性检测，以评估模型对TE^绝对癌症中转录伸长缺陷的各种属性进行重述的能力。

2. 确认免疫斑点测定，以评估有缺陷的RNA Pol II功能和干扰素（IFN）通路和肿瘤坏死因子（TNF）通路信号信号在生成的小鼠TE^绝对模型

1. 培养等于数 （10⁵） 的黄酮治疗 B16/F10 小鼠黑色素瘤细胞和父母 B16/F10 小鼠黑色素瘤细胞在两组不同的 12 孔板 （一组为 RNA Pol II 功能表征，另一组为细胞因子刺激）在37°C在5%CO2加湿培养箱过夜。
2. 第二天，用小鼠IFN-α、IFN-α（5纳克/mL）或TNF-α（5纳克/mL）在37°C下治疗细胞因子刺激集中的细胞45分钟。
3. 现在，使用放射性免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液从细胞因子和RNA Pol II功能表征集中的细胞中提取蛋白质:
   1. 用1x PBS清洗细胞，用每口井50μL的液分缓冲液将其冲洗。刮擦，然后在4°C，21，130 x g下粒细胞。
   2. 在洗涤剂溶解后（布拉德福德或类似测定）使用标准色度测定法测量细胞中溶解物中的蛋白质浓度。
4. 从每个样品中加载相等量的测量蛋白质（15μg），以4%~18%的硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶中运行，并将其转移到聚氯丁二烯（PVDF）膜上。
5. 将PVDF膜在三层缓冲盐水-多糖酸酯20（TBST）中的5%干牛奶中阻断1小时，随后在4°C与原抗体（RNA Pol II 1:1000;p-SER2 RNA Pol II 1:1000）进行过夜孵育;H3K36me3 1:2000;H3 1:2000;STAT1 1:1000;p-STAT1 1:1000;NF+B 1:1000;p-NF+B 1:1000;*-Actin 1:5000）在5%牛血清白蛋白。
6. 随后一天，在室温（RT）下用1x TBST清洗PVDF膜15分钟，用适当的二级抗体（RNA Pol II、p-SER2 RNA Pol II、p-SER2 RNA Pol II、p-SER5 RNA Pol II）用适当的二级抗体孵育它们;H3K36me3的抗兔膜（1:5000），H3K36me3，总H3，STAT1、p-STAT1、NF+B 和 p-NF+B 在 RT 处工作 50 分钟。使用市售的马萝卜过氧化物酶 （HRP） 基质检测蛋白质信号，增强化学致发光性。
   注:β-Actin主用是HRP结合的，因此无需二级开发即可。

3. 确认测定，以评估产生小鼠TE^绝对模型中的mRNA加工缺陷

1. 种子等于数量 （0.2 x 10⁶） 的黄酮治疗 B16/F10 小鼠黑色素瘤细胞和父母 B16/F10 小鼠黑色素瘤细胞在 6 孔板在 37 °C 在 5% CO₂加湿培养箱过夜。
2. 使用RNA萃取试剂或试剂盒（材料表），以60%的汇合率从培养细胞中提取总RNA。
3. 以下列方式从总提取的RNA中耗尽rRNA:
   注: 低输入协议已由商用套件选用为耗尽 rRNA
   1. 将一个水浴或热块设置为 70°C，在 37°C 时将另一个水浴或热块设置为 70-75°C。
   2. 在无核酸酶水中加入总RNA（无核酸酶2μL中的100~500 ng），在微离心管中加入1μL的选择性rRNA消耗探针和30μL的杂交缓冲液，通过涡旋轻轻混合，在70~75°C孵育5分钟。
   3. 现在，将管转移到37°C的水浴/热块，让样品冷却至37°C，持续30分钟。
   4. 通过涡旋重新悬浮选择性rRNA耗尽探针磁珠，在1.5 mL无RNase微离心管中等分75μL的磁珠。
   5. 将珠子悬架放在磁性分离器上 1 分钟，让磁珠沉淀。轻轻吸吸并丢弃上清液。再次重复洗涤珠子，加入75 μL的无核酸酶水，并在磁分离后丢弃上清液。
   6. 将洗涤的珠子重新悬浮在75 μL的杂交缓冲液中，并将其附量25μL重新悬浮到另一管中，并将其保持在37°C，以供以后使用。
   7. 将剩余的 50 μL 磁珠放在磁性分离器上 1 分钟，然后丢弃上清液。在20μL的混合缓冲液中重新悬浮珠子，并将其保持在37°C，以供日后使用。
   8. RNA/选择性rRNA耗尽探针混合物冷却至37°C30分钟后，将管短暂离心，将样品收集到管底。
   9. 从步骤3.3.7将RNA/选择性rRNA消耗探针混合物的33μL转移到制备的磁珠中。通过低速涡旋混合。
   10. 在37°C下孵育管子15分钟。在孵育过程中，偶尔轻轻混合内容物。然后进行短暂的离心，将样品收集到管的底部。
   11. 将管子放在磁性分离器上1分钟，以颗粒rRNA探针复合物。这一次不要丢弃上清液。上清液含有rRNA耗尽的RNA。
   12. 将步骤 3.3.6 中 25 μL 的磁珠管放在磁性分离器上 1 分钟。吸气并丢弃上清液。将步骤 3.3.11 中的上清液添加到新的珠子管中。通过低速涡旋混合。
   13. 在37°C下孵育管子15分钟。在孵育过程中，偶尔轻轻混合内容物。将管短暂地离心，将样品收集到管的底部。
   14. 将管子放在磁性分离器上1分钟，以颗粒rRNA探针复合物。不要丢弃上清液。将含有rRNA耗尽的RNA的上清液（约53μL）转移到新管中。
   15. 通过分光光度计测量RNA产量的浓度。
4. 使用一半的rRNA耗尽样品作为含有寡聚物（dT）25的磁珠的输入，以下列方式提取聚A⁺ RNA:
   注:这种使用与磁珠表面结合的寡聚物dT序列分离聚A尾信使RNA的协议，是从市售的试剂盒（材料表）中增选的。
   1. 通过短暂涡旋 >30 s，将 200 μL 的寡果 dT 珠转移到管中，将寡果 dT 珠重新悬浮在小瓶中。添加相同的体积 （200 μL） 的绑定缓冲液，然后重新挂起。
   2. 将管子放入磁铁中 1 分钟，然后丢弃上清液。现在，从磁铁中取出管子，将洗过的寡果 dT 珠重新悬浮在 100 μL 的装订缓冲液中。
   3. 将输入 rRNA 耗尽的总 RNA 样本的体积调整为 100 μL，10 mM Tris-HCl pHH 7.5。现在，添加100 μL的绑定缓冲液。
   4. 加热至65°C2分钟，破坏二次RNA结构。现在，立即放在冰上。
   5. 将总RNA的200μL添加到100μL洗涤的珠子中。彻底混合，在 RT 处连续旋转转子 5 分钟，允许装订。
   6. 将管子放在磁铁上 1-2 分钟，小心地取出所有上清液，并小心地去除所有上清液。
   7. 从磁铁上取下管子，并加入200 μL的洗涤缓冲液。
5. 通过分光光度计测量提取的聚A + RNA 的纯度^和浓度。
   注:对于所有RNA样本，260/280比率为1.90±2.00，260/230比2.00±2.20，均为可接受。
6. 使用第 3.3 节中剩余的一半 rRNA 耗尽样品作为蛋白质 A 柱的输入（在 RNA 免疫沉淀 [RIP] 试剂盒中提供，材料表）使用单克隆 7 甲基瓜诺辛免疫沉淀五重封顶RNA抗体以下列方式:
   注:使用市售RNA免疫沉淀试剂盒分离m7G封顶信使RNA的该协议已被增选并进一步修改。
   1. 根据制造商的协议，洗涤从RIP试剂盒中获得的磁珠，将抗体预结合到珠子上。
   2. 将3μg的7-甲基苯丙胺抗体（试剂盒中提供的兔子IgG可用于负对照）转移到悬浮在试剂盒100μL洗涤缓冲液中的微离心管中的珠子。
   3. 在RT.离心管上短暂孵育30分钟的低速旋转，然后将管子放在磁性分离器上，取出并丢弃上清液。
   4. 取出管子，从试剂盒和涡旋中加入500 μL的洗涤缓冲液。使管部短暂离心，然后再次进行磁分离，取出并丢弃上清液。
   5. 再次重复步骤 3.6.4。
   6. 将约120纳克的rRNA耗尽（从第3.3节）添加到预洗的7-甲基瓜诺苷抗体结合珠子中。加入1μL的RNase抑制剂。在RT孵育1⁄1.5小时，具有轻度搅拌。
   7. 在 300 x g下旋转珠子 10 s，并将含有未封顶（非 7-甲基瓜诺辛）mRNA的上清液去除到新的微离心管中。
   8. 加入100 μL的洗涤缓冲液，并类似地再洗两次。将收集的上清液汇集在同一微离心管中，标记为未封顶（非7-甲基瓜诺辛）mRNA。储存在冰上。
   9. 从含有7M尿素、2%SDS、0.35M NaCl、10 mM EDTA和10 mM Tris的300μL尿素溶化缓冲液（ULB）的珠子中洗脱封顶（7-甲基瓜诺辛）mRNA，在65°C加热珠子2⁄3分钟。
   10. 将 300 μL 的洗脱样品（封顶和未封顶的 mRNA）与 300 μL 的苯酚:氯仿:丙胺醇（25:24:1;市售）（储存在 4 °C 下）混合。通过反转混合好，离开约10分钟，然后再次轻轻混合。
   11. 在 18，928 x g下离心 2 分钟，小心地将顶层移至新鲜管中并丢弃底层。
   12. 在样品中加入300μL的苯酚:氯仿:二醇（25:24:1;储存在4°C下）。通过反转混合，然后在18，928 x g下离心1分钟。 小心，将顶层移至新鲜的管子，然后丢弃底层。
   13. 在封顶和未封盖的RNA中加入300μL的2-porpanol和30μL的3M醋酸钠（pH 5.2）。反转样品几次，将其置于-20°C 20小时。
   14. 现在，在4°C下将样品在18，928 x g下离心10分钟。小心地去除上清液，加入500 μL的70%乙醇。
   15. 在 4°C 下以 18，928 x g再次离心 10 分钟。小心地丢弃上清液，在RT处干燥颗粒5分钟，将颗粒重新悬浮在无核酸酶水中。
7. 通过分光光度计测量RNA产量的纯度和浓度。对于所有RNA样本，260/280比率应在1.90~2.00范围内，260/230比值在2.00~2.20之间。

4. 确认测定，以评估小鼠TE对FasL介导细胞死亡^的反应

1. 种子等数 （30，000 细胞） 的黄酮治疗 B16/F10 小鼠黑色素瘤细胞和父母 B16/F10 小鼠黑色素瘤细胞在其相应的介质 （DMEM） 的 96 孔培养板中，并在 37°C，5% CO₂加湿中孵育过夜孵化器。
2. 在10μg/mL抗他抗体的情况下，在培养罩中处理不同浓度_为h6FasL（0.1~1000纳克/mL）的细胞，并在37°C下孵育24小时，5%CO₂加湿培养箱。
3. 使用 1x PBS 缓冲液清洗，清除死细胞。在RT将附着的细胞固定在4%的甲醛中20分钟，丢弃4%的甲醛（无需清洗），用水晶紫罗兰溶液染色30分钟（20%甲醇，0.5%水晶紫罗兰在1xPBS中）。
4. 通过在自来水中轻轻涂抹盘子，去除多余的污渍。保持板在 RT 处干燥。
5. 在1x PBS中溶解的1x非离子表面活性剂中重新溶解水晶紫罗兰，并通过在微板读片器中测量570nm的吸收率来测量细胞密度。

5. 探索性测定，评估小鼠TE^对抗原特异性细胞毒性T细胞攻击的反应

1. OT-I CD8® 细胞毒性 T 细胞攻击 （CTL） 的分离和激活
   1. 使用小鼠CD8 T细胞分离试剂盒分离，从OT-I TCR Tg RAG-1+小鼠的脾脏中纯化CD8+细胞，如下所示:
      1. 在完整的 RPMI 介质中从两个 OT-I TCR Tg RAG-1+小鼠中收获两个脾脏。
      2. 将脾脏混在70 μm过滤器中，放在一个50 mL的管子上，管中装有20 mL的RPMI，使用注射器的背面，直到过滤器中只留下脂肪。
      3. 在 4°C 下以 220 x g将流量离心 5 分钟。丢弃上清液。
      4. 从前一个离心步骤向脾粒中加入1 mL红血球（RBC）裂解缓冲液，然后移液混合物1分钟。
      5. 通过加达 10 mL 的 RPMI 来中和溶液。
      6. 在 220 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。丢弃上清液，并在 10 mL 的 RPMI 中重新悬浮。
      7. 取一个小等分进行计数。在 4°C 下将剩余的 220 x g离心 5 分钟。
      8. 对于每计算的百万个细胞，在1 mL的市售磁分离系统缓冲液（Mojo缓冲器或类似缓冲器）中重新悬浮颗粒。
      9. 在步骤 5.1.1.8 中，每 1 mL 的颗粒细胞制备体积为 100 μL 的抗体鸡尾酒。抗体鸡尾酒包括:生物素抗CD4、CD105、CD45R/B220、CD11c、CD49b、TER-119、CD19、CD11b、TCR +/+和CD44。
      10. 将这种鸡尾酒加入1 mL颗粒细胞中，在冰上保存15分钟。
      11. 将100μL的磁性（链球毒）珠添加到加入1 mL再悬浮颗粒脾细胞的抗体鸡尾酒中每100μL。在冰上保持15分钟。
      12. 添加 7 mL 的商用磁分离系统缓冲器。现在，将混合物的约3⁄4 mL等分到新鲜的管子中。混合好，并固定在磁铁5分钟。
      13. 将液体（包含 CD8+ 细胞）转移到冰上的新鲜管中。现在，将步骤 5.1.1.12 中剩余的 3⁄4 mL 混合物与管子等分，并将其固定在磁铁上 5 分钟。
   2. 种子工程粘附式成纤维细胞APC-（MEC）。B7.SigOVA）线表示特异性欧巴蛋白（OVA）衍生，H-2Kb限制肽表位OVA257-264（SIINFEKL），以及共刺激分子B7.1，在24孔板中每孔75，000个细胞，在37°C，5%CO₂加湿培养箱。
      注:使用的粘附成纤维细胞是伊迪丝·詹森博士在CCHMC实验室的礼物。这条线最初是在拉霍亚过敏和免疫学^研究所6的斯蒂芬·肖恩伯格博士的实验室里创造的。
   3. 24小时后，用Iscove的改性Dulbeco的介质（IMDM）清洗APC的单层一次，商用时可使用HEPES缓冲液、丙酸钠、L-谷氨酰胺和高葡萄糖，并在IMDM的2 mL中加入0.5 x 10⁶幼稚OT-I CD8+细胞（从步骤5.1.1.13起）辅以 50 mM +-ME、2 mL EDTA、4 mM L-谷氨酰胺和 HEPES 以及 10% FBS。
   4. 20小时后，轻轻收获非粘附性OT-I细胞（通过在培养皿中收集具有浮动OT-I细胞的介质，并在191 x g下粒细胞2分钟;计数可行的OT-I细胞），并将其转移到共培养中。
2. 具有B16/F10-OVA细胞的CD8+细胞共培养
   1. 种子OT-I衍生CD8+细胞与B16/F10（缺乏抗原欧白蛋白）、未经治疗的B16/F10-OVA和B16/F10-OVA细胞在6口培养皿中，用黄热质醇（25 nM）预处理1周，在6个井盘中，具有完整的DMEM，比例为1:1（每个细胞300，000个）在 5%_CO2加湿培养箱中，在 37°C 下培养 20 小时。
   2. 20 小时后，取出 OT-I 衍生 CD8+ 细胞（通过使用浮动 OT-I 派生 CD8+ 细胞收集培养盘中的介质）。在 1x PBS 中清洗粘附性 B16/F10-OVA 细胞。
   3. 在含有胰蛋白酶的0.05%EDTA中，将三组附着的B16/F10-OVA细胞分化5分钟。
   4. 通过在冷PBS（含有0.5%FBS和0.05%阿齐德钠）中用可存活染料和相关标记抗体（可修复的可修复性染色染料e780、AF647-结合小鼠CD8和BV421-结合小鼠CD45）染色收获的B16/F10-OVA细胞).
   5. 通过流式细胞测定法分析三组B16/F10-OVA细胞的生存能力。

结果

在这里，我们提供了一个详细的方案（图1），以建立一个TE^肯定细胞模型，通过慢性亚致命（图2）治疗在25 nM使用黄体醇获得。在图3中，在使用黄酮的3天治疗中，B16 OVA细胞^明显显示出TE的部分特性，但经过一周的处理，B16/F10 OVA细胞在RNA Pol IICTD上的血清2位置表现出严重的磷酸化损失。H3K...

讨论

RNA Pol II 伸长控制已成为调节刺激反应基因表达的决定性杠杆，有利于恶性^{细胞5、7、8。}克服促进子-近端暂停至伸长和随后的mRNA生产需要P-TEFb^9，10，11的激酶活性。我们的模型利用黄酮醇（25 nM），一种必需环素依赖性激酶CDK9的抑制剂，来模拟在TE^绝对<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
hhis6FasL	Cell Signaling	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
12 well plates	Falcon	353043
20% methanol	Fisher Chemical	A412-4
24-well plates	Falcon	351147
4–18% SDS polyacrylamide gel	Bio-Rad	4561086
4% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5% dry milk	Bio-Rad	170-6404
7-Methylguanosine antibody	BioVision	6655-30T
96-well plates	Cellstar	655180
AF647-conjugated mouse CD8	Biolegend	100727
antibiotic and antimycotic	Gibco	15240-062
anti-His antibody	Cell Signaling	2366 P
Anti-Rabit	Cell Signaling	7074	Dilution 1:5000
Anti-Rat	Cell Signaling	7077S	Dilution 1:5000
Bradford assay Kit	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421-conjugated mouse CD45	Biolegend	109831
crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
Fixable Live/Dead staining dye e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	Dilution 1:2000
IFN-α	R&D systems	12100-1
IFN-γ	R&D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007
NF-κB	Cell Signaling	8242s	Dilution 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κB	Cell Signaling	3033s	Dilution 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Active Motif	61083	Dilution 1:500
p-Ser5-RNAPII	Active Motif	61085	Dilution 1:1000
p-STAT1	Cell Signaling	7649s	Dilution 1:1000
RiboMinu Eukaryote Kit	Ambion	A10837-08
RIPA buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948
RNAPII	Active Motif	61667	Dilution 1:1000
STAT1	Cell Signaling	9175s	Dilution 1:1000
TNF-α	R&D systems	410-MT-010
total H3	Cell Signaling	4499	Dilution 1:2000
Tri reagent	Sigma	T9424
Triton	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-Actin	Cell Signaling	12620S	Dilution 1:5000
β-ME	G Biosciences	BC98