만성 CDK9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (TE확실히)을연구합니다.

요약

프로토콜은 비 유전적 결함 전사 신장의 시험관 내 뮤린 암종 모델을 자세히 설명합니다. 여기서, CDK9의 만성 억제는 모든 암 유형의 약 20%에서 존재하는 임상적으로 과용된^TE 를 모방하고 연구하기 위해 프로-염증 반응 유전자를 따라 RNA Pol II의 생산적인 신장을 억압하는 데 사용된다.

초록

우리는 이전에 암의 부분 집합이 mRNA 전사 신장 (TE)에 있는 광범위한 결핍을 가진 글로벌 전사 deregulations에 의해 정의된다는 것을 보고했습니다- 우리는 TE와 같은 암을^확실히칭합니다. 특히, TE^확실히 암은 그들의 억압으로 이끌어 내는 인터페론/JAK/STAT 및 TNF/NF-θB 통로와 같은 유전자의 큰 세트에서 가짜 전사 및 결함이 있는 mRNA 처리를 특징으로 합니다. TE는 신장 세포 암및 전이성 흑색종 환자에 있는 종양의^확실히 특수형은 면역 요법에 있는 나쁜 반응 및 결과와 유의하게_{상관합니다.} ^면역 요법에 대한 중요한 장애물을 포팅으로 -이 프로토콜의 목표는 이러한 광범위하고 비 유전적 연구를 위해 체외 TE^확실히 마우스 모델을 확립하는 것입니다. 암에 있는 전사 이상 및 새로운 통찰력, 기존 약에 대한 새로운 용도를 얻거나, 그 같은 암에 대하여 새로운 전략을 찾아내십시오. 우리는 RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)의 C 말단 반복 도메인(CTD)에 세린 2 잔기의 인산화를 폐지하기 위해 만성 플라보피리돌 중재 CDK9 억제를 상세히 설명하며, RNA Pol II의 방출을 생산적인 전사체로 억제합니다. 신장. TE가^확실히 어떤 특정 체세포 돌연변이의 밑에 분류되지 않다는 것을 감안할 때, 약리학 모형은 유리하고, 그(것)들에서 관찰된 광범위한 전사 및 후생유전학 결함을 가장 잘 모방합니다. 플라보피리돌의 최적화된 치사용량의 사용은 전사 신장 및 mRNA 처리 결함에서 비유전적 광범위한 중단의 일반화 가능한 모델을 만드는 유일한 효과적인 전략이며, 임상적으로 관찰된 TE를 밀접하게 모방합니다. ^확실히 특성. 따라서, TE의 이 모형은^확실히 면역성이 있는 중재한 세포 공격에 저항하는 에서 그(것)들을 가능하게 하는 세포 자율적인 요인을 해부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

서문

거의 모든 활성 유전자의 발현에서 중요한 속도 제한 단계는 프로모터 근위식 일시에서 생산적인 신장^1,2로의RNA 폴리머라제 II(RNA Pol II)의 전이이다. 전사 신장의 후생 유전학 적 dysregulationTE^확실히로 정의 된 여러 인간의 악성 종양의 진행에 도움이 주어진, 가난한 응답에 달하는 프로 염증 반응 경로에서 최적이 아닌 신호로 이어지는 면역 요법^3에대한 결과, 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 암에서 이러한 광범위한 비 유전 적 전사 이상을 연구하는 유용한 시험관 내 모델을 확립하는 것입니다. 이러한 관점에서, CDK9의 만성 약리학적 억제의 사용은 전사 신장 및 mRNA 처리 결함에 있는 비 유전적 광범위한 중단의 일반화 가능한 모형을 만들기위한 효과적인 전략이다. 만성 CDK9 억제를 사용하는 근거는 RNA Pol II의 C 말단 반복 도메인(CTD)에 세린 2 잔기의 인산화를 제거하여 RNA Pol II의 방출을 생산적인 전사 신장으로 억제한다는 것입니다. 또한,^TE확실히 암, 우리의 그룹^3에의해 이전에 설명한, 어떤 특정 체세포 돌연변이의 밑에 분류되지 않습니다. 따라서 비유전적(pharmaological) 모델은 유리하며 그(것)들에서 관찰된 광범위한 전사 및 후생유전학 적 결함을 가장 잘 모방한다. 본 명세서의 방법은 뮤린 암세포의 만성 플라보피리돌 치료 모델의 생성 및 특성화를 상세히 설명한다. 이 방법은 더 긴 게놈 길이를 특징으로 하는 유전자를 따라 전사 신장을 명백하게 방해하며, TNF/NF-θB 및 인터페론/STAT 신호와 같은 유도성 발현과 함께, 심오하게 조절되는 유전자의 수준에서 제어됩니다. 전사 신장^3,4,5. 전반적으로, 전사 신장 결함의 이 최적화된 뮤린 세포주 모형은 새로 기술된^{TE를 연구하는} 우리의 지식에 유일한 모형이 확실히 종양을 연구하기 위하여- 반대로 종양 면역 공격에 저항을, 악용하기 위하여 유용한 시스템을 렌더링하고 암에서 핵심 전사 기계에서 비 유전 적 결함의 취약점을 검사 vis-à-vis 면역 매개 세포 공격.

프로토콜

신시내티 아동 연구 재단의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 및 기관 생물 안전위원회는 모든 동물 실험 절차 (IACUC 프로토콜 #2017-0061 및 IBC 프로토콜 #IBC2016-0016)를 승인했으며, 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 설명된 표준에 따라 수행되었다.

1. 플라보피리돌 치료에 의한 RNA Pol II의 만성 억제-기본 전략

1. 종자 B16/F10 마우스 흑색종 세포는 저밀도 (0.2 x 10⁶⁾그들의 해당 배지에서 10cm 배양 판 (덜베코의 변형 된 독수리 배지 [DMEM], 10 % 태아 소 혈청 [FBS], 1 % 페니실린 및 연쇄상 구균 [펜 / 스트렙]) 및 밤새 인큐라토리 37°C, 5%_CO2 가습 인큐베이터에.
2. 다음 날, 1x 인산완충식염수(PBS)로 세포를 세척하고, RNA Pol II 연신계 p-TEFb(사이클린 T/CDK9)의 억제제인 플라보피리돌의 서브치명적인 용량(25nM으로 추정)을 가진 배양 배지의 새로운 배치를 추가합니다-1주일 동안 추가 없이 하위 배양.
3. flavopiridol 처리의 주 에 따라,^{TE에서 본} 전사 신장 결점의 각종 속성을 재량화하는 모형의 능력을 평가하기 위하여 확증적인 계산을 능력을 확실히 암.

2. 생성된 마우스^TE에서 의한 인터페론(IFN) 통로 및 종양 괴사 인자(TNF) 경로 신호의 결함있는 RNA Pol II 기능 및 손상을 평가하는 확인 면역블롯 분석법

1. 배양 균등수 (10⁵⁾B16/F10 마우스 흑색종 세포와 부모 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 두 개의 서로 다른 세트에 12 웰 플레이트 (RNA Pol II 기능 특성화에 대한 하나의 세트및 사이토 카인에 대한 다른 세트 자극)을 37°C에서 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안.
2. 다음날, 37°C에서 45분 동안 마우스 IFN-γ, IFN-α(5 ng/mL) 또는 TNF-α(5 ng/mL)로 설정된 사이토카인 자극에서 세포를 치료한다.
3. 지금, 사이토카인 및 RNA Pol II 기능적 특성화 세트 모두에서 세포로부터 단백질을 추출하는 것은 다음과 같은 방식으로 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 용해 완충액을 이용하여 설정한다:
   1. 1x PBS로 세포를 세척하고 잘 당 50 μL의 lyse. 4 °C, 21,130 x g에서용해 된 세포를 긁어 낸 다음.
   2. 세제 용해 (Bradford 또는 유사한 분석법)에 따라 단백질 농도에 대한 표준 색색 분석법을 사용하여 세포 용해 초온제에서 단백질을 측정합니다.
4. 각 시료에서 측정된 단백질(15 μg)을 4%-18% 나트륨 도데실 황산염(SDS) 폴리아크릴라미드 젤로 적재하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮긴다.
5. 1시간 동안 1시간 동안 트리스 완충식포-폴리소르베이트 20(TBST)에서 5% 건조 우유에서 PVDF 멤브레인을 차단하고 1차 항체를 가진 4°C에서 하룻밤 배양을 한 후(RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II; 1:1000; H3K36me3 1:2000; 총 H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFθB 1:1000; p-NFθB 1:1000; β-액틴 1:5000) 5% 소 혈청 알부민.
6. 다음날, PVDF 멤브레인을 실온(RT)에서 15분 동안 1x TBST로 세척하고, 적절한 이차 항체(RNA Pol II, p-SER2 RNA Pol II, p-SER5 RNA Pol II, P-SER5 RNA Pol II, H3K36me3, 총 H33에 대한 항-토끼(1:5000)로 배양한다. STAT1, p-STAT1, NFθB 및 p-NFθB는 RT에서 50분 동안 향상된 화학발광을 함유한 시판 고추냉이 과산화 증제(HRP) 기판을 사용하여 단백질 신호를 감지합니다.
   참고: β-액틴 1차 사용은 HRP-컨쥬게이드, 따라서 이차없이 개발될 수 있다.

3. 생성된 마우스 TE에서 mRNA 처리 결함을 평가하는 확인 분석법^확실히 모델

1. 종자 동등한 수 (0.2 x 10⁶⁾플라보피리돌 처리 B16/F10 마우스 흑색종 세포 및 부모 B16/F10 마우스 흑색종 세포를 37°C에서 37°C에서 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 처리하였다.
2. RNA 추출 시약 또는키트(물자 표)를이용하여 60% 동률에서 배양된 세포로부터 총 RNA를 추출한다.
3. 추출된 총 RNA로부터 rRNA를 다음과 같은 방식으로 고갈시면 다음과 같은 방식으로
   참고: 낮은 입력 프로토콜은 rRNA를 고갈시키기 위해 시판되는 키트에서 공동 선택되었습니다.
   1. 한 개의 수조 또는 열 블록을 70-75°C로 설정하고 다른 수조 또는 열 블록을 37°C로 설정합니다.
   2. 1 μL의 선택적 rRNA 고갈 프로브와 30 μL의 하이브리드화 버퍼로 총 RNA(뉴클레아제 없는 물 2 μL에 100-500 ng)를 추가하고, 소용돌이에 의해 부드럽게 혼합하고 5 분 동안 70-75 °C에서 배양하십시오.
   3. 이제 튜브를 37°C 수조/열 블록으로 옮기고, 30분 동안 시료를 37°C로 냉각시우려한다.
   4. 1.5 mL RNase-free 미세원원원지 튜브에서 선택적 rRNA 고갈 프로브 자기 비드를 소용돌이에 의해, 및 비드의 aliquot 75 μL을 재중단시켰다.
   5. 비드 서스펜션을 마그네틱 분리기위에 1분 동안 놓습니다. 부드럽게 흡인하고 상급을 버립니다. 75 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가하고 자기 분리 후 상판을 폐기하여 다시 한 번 구슬을 세척반복합니다.
   6. 혼성화 완충제의 75 μL에서 세척된 비드를 재중단하고, 25 μL의 바이쿼트(aliquot)를 다른 튜브에 재중단하고 나중에 사용하기 위해 37°C에서 유지한다.
   7. 나머지 50 μL 비드를 자기 분리기위에 1분 동안 놓고 상한체를 버립니다. 혼성화 완충제의 20 μL에서 비드를 다시 중단하고 나중에 사용하기 위해 37 °C에서 유지하십시오.
   8. RNA/선택적 rRNA 고갈 프로브 혼합물을 30분 동안 37°C로 냉각한 후, 튜브를 잠시 원심분리하여 튜브의 바닥으로 샘플을 수집하였다.
   9. 3.3.7단계에서 준비된 자기 비드로 RNA/선택적 rRNA 고갈 프로브 혼합물의 33 μL을 전달한다. 저속 소용돌이로 섞으세요.
   10. 튜브를 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 배양 중에 내용물기를 가끔 부드럽게 섞으세요. 이어서 튜브의 바닥에 샘플을 수집하기 위해 간단한 원심분리를 하였다.
   11. 튜브를 자기 분리기 위에 1분 동안 놓고 rRNA-프로브 복합체를 펠렛합니다. 이번에는 상급을 버리지 마십시오. 상급은 rRNA 고갈된 RNA를 포함합니다.
   12. 3.3.6단계에서 25 μL의 구슬 튜브를 자기 분리기위에 1분 동안 놓고 상한체를 버립니다. 3.3.11 단계에서 상급체를 구슬의 새로운 튜브에 추가합니다. 저속 소용돌이로 섞으세요.
   13. 튜브를 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 배양 중에 내용물기를 가끔 부드럽게 섞으세요. 튜브를 잠시 원심분리하여 튜브의 바닥으로 샘플을 수집합니다.
   14. 튜브를 자기 분리기 위에 1분 동안 놓고 rRNA-프로브 복합체를 펠렛합니다. 상급제는 버리지 마십시오. rRNA 고갈RNA를 함유하는 상층부(약 53 μL)를 새로운 튜브로 옮니다.
   15. 분광광도계에 의하여 RNA 수율의 농도를 측정합니다.
4. 올리고(dT)25를 함유하는 자기 비드에 대한 입력으로 rRNA 고갈된 샘플의 절반을 사용하여 다음과 같은 방식으로 polyA⁺ RNA를 추출합니다.
   참고: 자기 비드의 표면에 결합된 올리고 dT 서열을 사용하여 폴리아 테일 메신저 RNA를 분리하는 이 프로토콜은 시판되는키트(물자 표)로부터공동 선택되었다.
   1. >30s에 대한 간략하게 소용돌이에 의해 바이알내의 올리고 dT 비드를 재중단하고 200 μL의 올리고 dT 비드를 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 한다. 바인딩 버퍼의 동일한 볼륨(200 μL)을 추가하고 다시 일시 중단합니다.
   2. 튜브를 자석에 1 분 동안 놓고 상류를 버립니다. 이제, 자석으로부터 튜브를 제거하고 100 μL의 결합 완충제에서 세척된 올리고 dT 비드를 다시 중단한다.
   3. 입력 rRNA 고갈 된 총 RNA 샘플의 부피를 100 μL로 10mMM Tris-HCl pH 7.5로 조정합니다. 이제 바인딩 버퍼의 100 μL을 추가합니다.
   4. 이차 RNA 구조를 방해하기 위해 2 분 동안 65 °C로 가열하십시오. 지금, 즉시 얼음에 배치.
   5. 총 RNA의 200 μL을 100 μL 세척 된 구슬에 추가하십시오. RT에서 5분 동안 로터에서 지속적으로 회전하여 완전히 혼합하고 바인딩할 수 있습니다.
   6. 튜브를 자석에 1-2 분 동안 놓고 조심스럽게 모든 상급체를 제거하고 조심스럽게 모든 상급을 제거하십시오.
   7. 자석에서 튜브를 제거하고 세척 버퍼 200 μL을 추가합니다.
5. 추출 광도계에 의해 추출된 폴리아⁺ RNA의 순도와 농도를 측정합니다.
   참고: 1.90-2.00의 260/280 비율과 모든 RNA 샘플에 대해 260/230 의 260/230 비율이 허용되는 것으로 간주됩니다.
6. 단클론 7-메틸구아노신을 사용하여 면역 침전5-프라임 캡드 RNA를 면역 침전증에 단백질 A 컬럼에 입력으로 섹션 3.3에서 rRNA 고갈 된 샘플의나머지 절반을 사용 다음과 같은 방식으로 항체:
   참고: 시판되는 RNA 면역침전 키트를 사용하여 m7G 캡핑 메신저 RNA를 분리하는 이 프로토콜은 공동 선택되고 추가로 수정되었다.
   1. 제조자의 프로토콜에 따라 RIP 키트로부터 얻어진 단백질A 자기 비드를 세척하여 항체를 비드에 미리 결합한다.
   2. 7-메틸구아노신 항체의 3 μg(키트에 제공된 토끼 IgG는 네거티브 컨트롤을 사용할 수 있음)을 키트로부터 100 μL 세척 버퍼에 부유된 미세원심지 튜브에 구슬을 사용한다.
   3. RT. 원심분리기 튜브에서 30 분 동안 저속 회전으로 인큐베이션 한 다음 튜브를 자기 분리기에 놓고 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
   4. 튜브를 제거하고 키트와 소용돌이에서 500 μL의 세척 버퍼를 잠시 추가합니다. 튜브를 잠시 후 다시 한 번 자기 분리를 제거하고 상판을 제거합니다.
   5. 3.6.4 단계를 다시 한 번 반복합니다.
   6. 약 120 ng의 rRNA 고갈(섹션 3.3으로부터)을 미리 세척된 7-메틸구아노신 항체 결합 구슬에 첨가한다. RNase 억제제 1 μL을 첨가합니다. 가벼운 교반으로 1-1.5 시간 동안 RT에서 배양하십시오.
   7. 10s에 대한 300 x g에서 구슬을 스핀 다운하고 새로운 미세 원심 분리 튜브에 뚜껑이없는 (비- 메틸 과노신) mRNA를 포함하는 상급물질을 제거합니다.
   8. 100 μL의 세척 버퍼를 추가하고 두 번 더 비슷하게 씻으하십시오. 수집된 상급체를 동일한 미세원심지 튜브에 풀링하여 미뚜껑이 없는(비-7-메틸과노신) mRNA로 표시하였다. 얼음에 보관하십시오.
   9. 7 M 요소, 2% SDS, 0.35 M NaCl, 10 mM EDTA 및 10 mM Tris, pH 7.5를 함유하는 300 μL의 요소 용해 완충액(ULB)을 함유하는 비드로부터 mRNA(7-메틸구아노신) mRNA를 65°C에서 2-3-3분 동안 가열한다.
   10. 용출 된 샘플 (뚜껑 및 미포함 된 mRNA)의 300 μL의 페놀 : 클로로 포름 : 이소아밀 알코올 (25 : 24 : 1; 시판 가능)을 혼합하십시오 (4 °C에서 보관). 뒤집어잘 섞어서 약 10분간 그대로 두은 다음 다시 부드럽게 섞어주세요.
   11. 18,928 x g의 원심분리기를 2분 간 조심스럽게 피펫하여 상층을 신선한 튜브로 만들고 바닥층을 버립니다.
   12. 300 μL의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1; 4°C에서 보관)을 시료에 넣습니다. 18,928 x g에서 원심 분리기를 1 분 동안 잘 섞어 조심스럽게 상단 층을 신선한 튜브에 파이펫하고 바닥 층을 버립니다.
   13. 2-포르파놀 300 μL과 3M 아세테이트 나트륨 30 μL(pH 5.2)을 뚜껑이 없는 RNA에 넣습니다. 샘플을 몇 번 반전시키고 20 시간 동안 -20 °C에 놓습니다.
   14. 이제 4°C에서 10분 동안 18,928 x g에서 샘플을 원심분리합니다. 조심스럽게 상류를 제거하고 70 % 에탄올의 500 μL을 추가합니다.
   15. 4 °C에서 10 분 동안 18,928 x g에서 다시 원심 분리기. 조심스럽게 상류물을 버리고 RT에서 펠릿을 5 분 이내에 건조시십시오.
7. 분광광도계에 의하여 RNA 수율의 순도 및 농도를 측정합니다. 260/280 비율은 모든 RNA 샘플에 대해 1.90-2.00, 260-230 비율의 범위에 있어야 합니다.

4. FasL 매개 세포 사멸에 마우스 TE의 반응을 평가하는 확인 분석법^확실히 모델

1. 플라보피리돌의 종자 동등한 수(30,000세포)는 B16/F10 마우스 흑색종 세포와 부모B16/F10 마우스 흑색종 세포를 그들의 상응하는 배지(DMEM)에서 96웰 배양판에서, 37°C에서 하룻밤 배양하고, 5%_CO2 가습 부 화기.
2. h의 다른 농도를 가진 배양후드에서 세포를 치료 (0.1-1000 ng/mL) 존재 10 μg/mL 항-그의 항체및 37°C에서 24 시간 동안 배양, 5%_CO2 가습 인큐베이터.
3. 1x PBS 버퍼로 세척하여 죽은 세포를 제거합니다. 부착된 세포를 RT에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하고 4% 파라포름알데히드(씻을 필요가 없음)를 버리고 크리스탈 바이올렛 용액(메탄올 20%, 1x PBS에서 0.5% 크리스탈 바이올렛)으로 얼룩을 30분 동안 제거합니다.
4. 수돗물로 접시를 부드럽게 헹구어 여분의 얼룩을 제거합니다. RT에서 플레이트를 건조상태로 유지하십시오.
5. 1x PBS에 용해된 100 μL의 100 μL에서 크리스탈 바이올렛을 재용해 내고, 마이크로플레이트 리더에서 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 밀도를 측정한다.

5. 항원 특이적 세포독성 T 세포 발작에 대한 마우스 TE의 반응을^평가하는 탐사 분석법

1. OT-I CD8+ 세포독성 T 세포 발작(CTL)의 격리 및 활성화
   1. 마우스 CD8 T 셀 분리 키트를 사용하여 자기 세포 분리에 의해 OT-I TCR TG RAG-1−− 마우스의 비장으로부터 CD8+ 세포를 다음과 같이 정화한다:
      1. 완전한 RPMI 매체에 두 개의 OT-I TCR TG RAG-1−/− 마우스에서 두 개의 비장을 수확합니다.
      2. 70 μm 필터로 비장을 으깨서 20 mL의 RPMI로 채워진 50 mL 튜브에 보관하고, 주사기의 뒷면을 사용하여 지방만 필터에 남습니다.
      3. 4°C에서 5분 동안 220 x g에서 원심분리기를 통과한다. 상급제는 버리십시오.
      4. 이전 원심분리 단계에서 비장 펠릿에 적혈구 (RBC) 용해 완충액 1 mL을 추가하고 혼합물을 1 분 동안 피펫합니다.
      5. 최대 10mL의 RPMI를 추가하여 솔루션을 중화합니다.
      6. 220 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상급을 버리고 RPMI의 10 mL에서 다시 일시 중단하십시오.
      7. 계산을 위해 작은 별칭을 가져 가라. 나머지 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 220 x g에서.
      8. 계산된 모든 백만 개의 세포에 대해, 시판되는 자기 분리 시스템 버퍼(Mojo buffer 또는 이와 유사한 완충제)의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
      9. 5.1.8 단계에서 펠릿 세포의 1 mL마다 부피 100 μL의 항체 칵테일을 준비합니다. 항체 칵테일에는 비오틴 항 CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ 및 CD44가 포함됩니다.
      10. 이 칵테일을 1 mL 펠릿 셀에 넣고 15 분 동안 얼음에 보관하십시오.
      11. 1mL 재부유 펠릿 비장 세포에 첨가된 항체 칵테일의 100 μL마다 자기(스트렙타비딘) 비드 100 μL을 추가합니다. 15분 동안 얼음에 보관하십시오.
      12. 시판시 사용 가능한 자기 분리 시스템 버퍼 7mL를 추가합니다. 지금, 신선한 튜브에 혼합물의 약 3-4 mL의 알리쿼트. 잘 섞어서 자석에 5분 동안 고정시다.
      13. 액체 (CD8 + 세포 포함)를 얼음에 신선한 튜브에 장식합니다. 이제, 5.1.12단계로부터 혼합물의 나머지 3-4 mL을 튜브로 그리고 5분 동안 자석에 고정시키고, 액체(CD8+ 세포의 두 번째 배치)를 얼음 위에 보관된 CD8+ 세포의 첫 번째 배치를 포함하는 동일한 튜브에 액체(CD8+ 세포의 두 번째 배치)를 고정한다.
   2. 종자 공학 부착 섬유 아세포 APC-(MEC) B7. SigOVA)라인은 특정 ovalbumin (OVA)유래, H-2Kb 제한 펩티드 에피토프 OVA257-264 (SIINFEKL)와 함께, 24 웰 플레이트에서 웰 당 75,000 세포에서 37°C, 5%_CO2 가미드 인큐베이터에서.
      참고: 사용된 부착 섬유아세포는 CCHMC에 있는 에디스 얀센 박사의 실험실에서 받은 선물입니다. 이 라인은 원래 라호야 알레르기 및 면역학 연구소의 스티븐 P. 숀버거 박사의 연구실에서 만들어졌습니다^6.
   3. 24 시간 후, HEPES 버퍼, 나트륨 피루바트, L-글루타민 및 높은 포도당으로 시판되는 Iscove의 수정 된 덜베코 배지 (IMDM)로 APC의 단층을 한 번 씻고 0.5 x 10⁶ 순진한 OT-I CD8 + 세포를 2mMM의 2mMM에서 추가하십시오. 50 mM β-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-글루타민 및 HEPES 및 10 % FBS로 보충.
   4. 20 시간 후, 부드럽게 비 부착 OT-I 세포를 수확 (부동 OT-I 세포와 배양 접시에 매체를 수집하고 2 분 동안 191 x g에서 세포를 펠릿하여; 가능한 OT-I 세포를 계산) 공동 배양을 위해 그들을 전송.
2. B16/F10-OVA 세포를 가진 CD8+ 세포의 공동 배양
   1. 종자 OT-I-유래 CD8+ 세포는 B16/F10(항원 ovalbumin 결여), 처리되지 않은 B16/F10-OVA, B16/F10-OVA 와 함께 공동 배양에서 1:1(각각 300,000개 세포)의 비율로 1주일 동안 플라보피리돌(25 nM)으로 사전 처리된 DME 를 6주에 잘 처리했습니다. 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 37°C에서 20시간 동안 미디어를.
   2. 20시간 후, OT-I-유래 CD8+ 세포를 제거한다(부동 OT-I 유래 CD8+ 세포로 배양 접시내의 배지를 수집함으로써). 부착된 B16/F10-OVA 세포를 1x PBS로 세척합니다.
   3. 0.05% EDTA에서 부착된 B16/F10-OVA 세포의 세 그룹을 5분 동안 트립신을 함유한 트립신을 트립시니화시켰다.
   4. 수확한 B16/F10-OVA 세포를 차가운 PBS(0.5% FBS 및 0.05% 나트륨 아지드 포함)에 배양하여 생존용 염료 및 관련 라벨이 부착된 항체(고칠 수 있는 생존성 염색 염료 e780, AF647-접합 마우스 CD8 및 BV421-컨쥬게이트 마우스4)로 배양하여 염색 ).
   5. 유세포분석에 의한 B16/F10-OVA 세포의 세 그룹의 생존 가능성을 분석한다.

결과

여기서, 우리는 25 nM에서 플라보피리돌로 치료한 만성 서브치사(도2)에의해 얻어진^TE확실히 세포 모델을 확립하기 위한 상세한 계획(도1)을제공한다. 도 3에서,플라보피리돌로 치료한 3일 동안, B16 OVA 세포는 TE의 부분적인 특성을^확실히 나타내지만, 1주일의 치료 후, B16/F10 OVA 세포는 RNA Pol I...

토론

RNA Pol II 신장 조절은 악성 세포의 이점에 대한 자극 반응유전자 발현을 조절하기 위한 결정적인 지렛대로 대두되고^{있다 5,7,8.} 발기인-근위성 일시 중단을 극복하여 연신장 및 후속 mRNA 생산을 위해서는 P-TEFb^9,10,11의키나아제 활성이 요구됩니다. 우리의 모델...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
hhis6FasL	Cell Signaling	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
12 well plates	Falcon	353043
20% methanol	Fisher Chemical	A412-4
24-well plates	Falcon	351147
4–18% SDS polyacrylamide gel	Bio-Rad	4561086
4% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5% dry milk	Bio-Rad	170-6404
7-Methylguanosine antibody	BioVision	6655-30T
96-well plates	Cellstar	655180
AF647-conjugated mouse CD8	Biolegend	100727
antibiotic and antimycotic	Gibco	15240-062
anti-His antibody	Cell Signaling	2366 P
Anti-Rabit	Cell Signaling	7074	Dilution 1:5000
Anti-Rat	Cell Signaling	7077S	Dilution 1:5000
Bradford assay Kit	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421-conjugated mouse CD45	Biolegend	109831
crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
Fixable Live/Dead staining dye e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	Dilution 1:2000
IFN-α	R&D systems	12100-1
IFN-γ	R&D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007
NF-κB	Cell Signaling	8242s	Dilution 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κB	Cell Signaling	3033s	Dilution 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Active Motif	61083	Dilution 1:500
p-Ser5-RNAPII	Active Motif	61085	Dilution 1:1000
p-STAT1	Cell Signaling	7649s	Dilution 1:1000
RiboMinu Eukaryote Kit	Ambion	A10837-08
RIPA buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948
RNAPII	Active Motif	61667	Dilution 1:1000
STAT1	Cell Signaling	9175s	Dilution 1:1000
TNF-α	R&D systems	410-MT-010
total H3	Cell Signaling	4499	Dilution 1:2000
Tri reagent	Sigma	T9424
Triton	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-Actin	Cell Signaling	12620S	Dilution 1:5000
β-ME	G Biosciences	BC98