A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TE definitely ) in Cancers A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdefinitely) in Cancers

Résumé

Le protocole détaille un modèle in vitro de carcinome murine de l'allongement défectueux non génétique de transcription. Ici, l'inhibition chronique de CDK9 est employée pour réprimer l'allongement productif de l'ARN Pol II le long des gènes pro-inflammatoires de réponse pour imiter et étudier le phénomène cliniquement surdes te^{certainement,} présent dans environ 20% de tous les types de cancer.

Résumé

Nous avons précédemment rapporté qu'un sous-ensemble de cancers est défini par des déréglementations transcriptionnelles globales avec des insuffisances répandues dans l'allongement de transcription d'ARNm (TE)-nous appelons tels cancers comme TE^{certainement.} Notamment, les cancers de TE sont^certainement caractérisés par la transcription fausse et le traitement défectueux d'ARNm dans un grand ensemble de gènes, tels que l'interféron/JAK/STAT et les voies de TNF/NF-B, menant à leur suppression. Le^sous-type te des tumeurs dans le carcinome rénal de cellules et les patients métastatiques de mélanome sensiblement corrélés avec la réponse et les résultats pauvres dans l'immunothérapie. Compte tenu de l'importance d'étudier les cancers DE l'TE, car il laisse présager un obstacle important contre l'immunothérapie, l'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro TE^{définitivement} souris pour étudier ces répandues, non-génétique anomalies transcriptionnelles dans les cancers et d'acquérir de nouvelles idées, de nouvelles utilisations pour les médicaments existants, ou de trouver de nouvelles stratégies contre ces cancers. Nous détaillons l'utilisation de l'inhibition chronique de CDK9 de flavopiridol négociée pour abroger la phosphorylation des résidus de sérine 2 sur le domaine de répétition C-terminal (CTD) de la polymérase II d'ARN (RNA Pol II), supprimant la libération de l'ARN Pol II dans la transcription productive Allongement. Étant donné que les cancers TE ne sont^certainement pas classés sous une mutation somatique spécifique, un modèle pharmacologique est avantageux, et imite le mieux les défauts transcriptionnels et épigénétiques répandus observés en eux. L'utilisation d'une dose sublétale optimisée de flavopiridol est la seule stratégie efficace dans la création d'un modèle généralisable de perturbation non génétique généralisée dans l'allongement de la transcription et les défauts de traitement de l'ARNm, imitant étroitement l'ETe observé cliniquement ^certainement des caractéristiques. Par conséquent, ce modèle de TE peut^certainement être exploité pour disséquer, les facteurs cellulaires autonomes leur permettant de résister à l'attaque cellulaire à médiation immunitaire.

Introduction

Une étape de limitation de taux clé dans l'expression de presque tous les gènes actifs est la transition de la polymérase D'ARN II (ARN Pol II) de la pause promoteur-proximale à l'allongement productif^1,2. Étant donné que la dysrégulation épigénétique de l'allongement transcriptionnel aide à la progression de multiples malignités humaines définies comme TE^{définitivement}, conduisant à la signalisation sous-optimale dans les voies de réponse pro-inflammatoires équivalant à une mauvaise réponse et les résultats à l'immunothérapie³, l'objectif global de ce protocole est d'établir un modèle in vitro utile pour étudier ces anomalies transcriptionnelles non génétiques répandues dans les cancers. Dans cette optique, l'utilisation de l'inhibition pharmacologique chronique du CDK9 est une stratégie efficace pour créer un modèle généralisable de perturbation non génétique généralisée dans l'allongement de la transcription et les défauts de traitement de l'ARNm. La raison d'être de l'utilisation chronique de l'inhibition du CDK9 est qu'elle abroge la phosphorylation des résidus de sérine 2 sur le domaine de répétition C-terminal (CTD) de l'ARN Pol II, réprimant ainsi la libération de l'ARN Pol II dans l'allongement productif de transcription. En outre, TE^certainement cancers, décritprécédemments par notre groupe^3,ne sont pas classifiés sous n'importe quelle mutation somatique spécifique. Par conséquent, un modèle non génétique (pharmacologique) est avantageux et imite le mieux les défauts transcriptionnels et épigénétiques répandus observés en eux. La méthode ici détaille la génération et la caractérisation du modèle chronique de traitement de flavopiridol des cellules cancéreuses de murine. Cette méthode perturbe manifestement l'allongement de la transcription le long des gènes caractérisés par des longueurs génomiques plus longues, avec des promoteurs en équilibre et des expressions inductibles telles que le TNF/NF-B et la signalisation interféron/STAT, profondément contrôlée au niveau de transcription elongation^3,4,5. Dans l'ensemble, ce modèle optimisé de ligne cellulaire murine des défauts d'allongement transcriptionnel-le seul modèle à notre connaissance pour étudier les tumeurs nouvellement décrites de TE^{certainement-conduit} la résistance à l'attaque immunitaire anti-tumorale, rendant un système utile pour exploiter et examiner les vulnérabilités des défauts non génétiques dans les machines de transcription de base dans les cancers vis-à-vis de l'attaque cellulaire à médiation immunitaire.

Protocole

Le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux et le Comité institutionnel de biosécurité de la Cincinnati Children's Research Foundation ont approuvé toutes les procédures expérimentales pour animaux (protocole de l'IACUC #2017-0061 et protocole du BAC #IBC2016-0016), et ces des expériences ont été menées conformément aux normes décrites dans le Guide des NIH sur les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Inhibition chronique de l'ARN Pol II par traitement flavopiridol—stratégie de base

1. Cellules de mélanome de souris de graine B16/F10 dans la basse densité (0.2 x 10⁶) dans une plaque de culture de 10 cm dans leur milieu correspondant (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 10% sérum bovin foetal [FBS], 1% pénicilline et streptomycine [Pen/Strep]) et incuber du jour au lendemain dans un incubateur humidifié co₂ de 37 oC, 5 %.
2. Le lendemain, lavez les cellules avec de la saline tamponnée par phosphate 1x (PBS) et ajoutez un nouveau lot de milieux de culture avec une dose sublétale (estimée à 25 nM) de flavopiridol, un inhibiteur du facteur d'allongement de l'ARN Pol II p-TEFb (cyclin T/CDK9) pendant une semaine sans plus de sous-creturing.
3. Après une semaine de traitement flavopiridol, effectuer des essais de confirmation pour évaluer la capacité du modèle à récapituler divers attributs des défauts d'allongement transcriptionnel vu dans les cancers TE^{certainement.}

2. Analyse immunoblot confirmatoire pour évaluer la fonction défectueuse de Pol II d'ARN et l'affaiblissement de la voie d'interféron (IFN) et de la signalisation de voie de nécrose de tumeur (TNF) de dans le modèle produit de TE de souris^définissant

1. Nombre égal de culture (10⁵) de flavopiridol traité B16/F10 cellules de mélanome de souris et les cellules de mélanome de souris B16/F10 parentales dans deux ensembles différents de 12 plaques de puits (un ensemble pour la caractérisation fonctionnelle de l'ARN Pol II et l'autre ensemble pour cytokine stimulation) à 37 oC dans un incubateur humidifié co₂ de 5 % pendant la nuit.
2. Le lendemain, traitez les cellules dans la stimulation cytokine fixée avec la souris IFN-, IFN-ML (5 ng/mL), ou TNF-ML (5 ng/mL) pendant 45 min à 37 oC.
3. Maintenant, extraire la protéine des cellules dans les ensembles fonctionnels de caractérisation de cytokine et d'ARN Pol II utilisant un tampon d'analyse de lyse de radioimmunoprecipitation (RIPA) de la manière suivante :
   1. Laver les cellules avec 1x PBS et le lyser avec 50 l de la mémoire tampon de lyse par puits. Gratter, puis granuler les cellules lysées à 4 oC, 21 130 x g.
   2. Mesurer la protéine dans les supernatants de lysate cellulaire à l'aide d'un analyse colorimétrique standard pour la concentration de protéines après la solubilité du détergent (Bradford ou un résultat similaire).
4. Chargez une quantité égale de protéines mesurées (15 g) de chaque échantillon pour qu'elles s'exécutent dans un gel de polyacrylamide de sulfate de dodecyl de sodium (SDS) de 4 % à 18 %, et transférez-les sur des membranes de polyvinylidede difluorure (PVDF).
5. Bloquer les membranes PVDF dans du lait sec à 5 % dans le tris tamponné saline-polysorbate 20 (TBST) pendant 1 h, suivie d'une incubation de nuit à 4 oC avec des anticorps primaires (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; total H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NF-B 1:1000; p-NF-B 1:1000; -Actin 1:5000) en 5% d'albumine de sérum bovin.
6. Le lendemain, lavez les membranes PVDF avec 1x TBST pendant 15 min à température ambiante (RT), et incubez-les avec des anticorps secondaires appropriés (anti-rat [1:5000] pour l'ARN Pol II, p-SER2 RNA Pol II, et p-SER5 RNA Pol II; anti-lapin (1:5000) pour H3K36me3, total H3, STAT1, p-STAT1, NF-B et p-NF-B) pendant 50 min à RT. Détectez les signaux protéiques à l'aide du substrat de peroxidase de raifort (HRP) disponible dans le commerce avec une chimiluminescence améliorée.
   REMARQUE : L'utilisation primaire d'Actin est HRP-conjuguée, donc elle peut être développée sans secondaire.

3. Essai de confirmation pour évaluer les défauts de traitement de l'ARNm dans le modèle DE souris généré^{TE définitivement}

1. Nombre égal de graines (0,2 x 10⁶) de cellules de mélanome de souris traitées par flavopiridol et de cellules de mélanome de souris B16/F10 parentales dans des plaques de 6 puits à 37 oC dans un incubateur humidifié de 5 % de CO₂ pendant la nuit.
2. Extraire l'ARN total des cellules cultivées à 60% de confluence à l'aide d'un réactif d'extraction d'ARN ou d'un kit (Tableau des matériaux).
3. Épuisez l'ARN du total extrait de l'ARN de la manière suivante :
   REMARQUE : Un protocole à faible entrée a été coopté à partir d'un kit disponible dans le commerce pour épuiser l'ARNr
   1. Fixez un bain d'eau ou un bloc de chaleur à 70 à 75 oC, et un autre bain d'eau ou bloc de chaleur à 37 oC.
   2. Ajouter l'ARN total (100 à 500 ng dans 2 l d'eau sans nucléane) avec 1 l de sonde sélective d'épuisement de l'ARNr et 30 l de tampon d'hybridation dans un tube de microcentrifuge, mélanger doucement par vortex et les incuber à 70 à 75 oC pendant 5 min.
   3. Maintenant, transférez les tubes dans un bain d'eau/bloc de chaleur de 37 oC, et laissez l'échantillon refroidir à 37 oC sur une période de 30 min.
   4. Resuspendre les perles magnétiques sélectives de la sonde d'épuisement de rRNA par vortexing, et aliquot 75 l de perles dans un tube microcentrifuge sans RNase de 1,5 mL.
   5. Placez la suspension de perles sur un séparateur magnétique pendant 1 min. Laissez les perles s'installer. Aspirez et jetez délicatement le supernatant. Répétez le lavage des perles une fois de plus en ajoutant 75 L d'eau sans nucléane et en jetant le supernatant après la séparation magnétique.
   6. Resuspendre les perles lavées dans 75 l de tampon d'hybridation, et aliquot 25 l à un autre tube et le maintenir à 37 oC pour une utilisation ultérieure.
   7. Placer les 50 perles restantes sur un séparateur magnétique pendant 1 min et jeter le supernatant. Resuspendre les perles dans 20 l de tampon d'hybridation et les maintenir à 37 oC pour une utilisation ultérieure.
   8. Après le refroidissement du mélange de sonde d'épuisement de l'ARN/arner sélectif à 37 oC pendant 30 min, brièvement centrifuger le tube pour recueillir l'échantillon au fond du tube.
   9. Transférer 33 L du mélange de sonde d'épuisement de l'ARN/ARN sélectif aux perles magnétiques préparées à partir de l'étape 3.3.7. Mélanger par un vortex à basse vitesse.
   10. Incuber le tube à 37 oC pendant 15 min. Pendant l'incubation, mélanger délicatement le contenu à l'occasion. Suivi d'une brève centrifugation pour prélever l'échantillon au fond du tube.
   11. Placez le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 min pour granuler le complexe de sonde d'ARNr. Cette fois, ne jetez pas le supernatant. Le supernatant contient de l'ARN appauvri par l'ARN.
   12. Placez le tube de 25 l de perles à partir de l'étape 3.3.6 sur un séparateur magnétique pendant 1 min. Aspirate et jetez le supernatant. Ajoutez le supernatant de l'étape 3.3.11 au nouveau tube de perles. Mélanger par un vortex à basse vitesse.
   13. Incuber le tube à 37 oC pendant 15 min. Pendant l'incubation, mélanger délicatement le contenu à l'occasion. Brièvement centrifuger le tube pour recueillir l'échantillon au fond du tube.
   14. Placez le tube sur un séparateur magnétique pendant 1 min pour granuler le complexe de sonde d'ARNr. Ne jetez pas le supernatant. Transférer le supernatant (environ 53 l) contenant de l'ARN appauvri par l'ARN dans un nouveau tube.
   15. Mesurer la concentration du rendement de l'ARN par un spectrophotomètre.
4. Utilisez la moitié des échantillons appauvris par l'ARNre comme entrée dans les perles magnétiques contenant de l'oligo (dT)25 pour extraire l'ARN polyA de la manière suivante :
   REMARQUE : Ce protocole d'isoler l'ARN de messager de queue de polyA utilisant des séquences de dT dT dtliés à la surface des perles magnétiques a été coopté à partir d'un kit disponible dans le commerce (tableau des matériaux).
   1. Resuspendre les perles oligo dT dans le flacon en vortexant brièvement pour 'gt;30 s et transférer 200 'L de perles oligo dT à un tube. Ajouter le même volume (200 l) de tampon de liaison et suspendre à nouveau.
   2. Placer le tube dans un aimant pendant 1 min et jeter le supernatant. Maintenant, retirez le tube de l'aimant et suspendez à nouveau les perles oligo dT lavées dans 100 l'un de tampon de liaison.
   3. Ajuster le volume de l'échantillon total d'ARN appauvri par l'ARN à 100 l avec 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Maintenant, ajoutez 100 l de tampon de liaison.
   4. Chauffer jusqu'à 65 oC pendant 2 min pour perturber les structures secondaires de l'ARN. Maintenant, placez-le immédiatement sur la glace.
   5. Ajouter les 200 L d'ARN total aux 100 perles lavées de 100 L. Bien mélanger et laisser la fixation en tournant continuellement sur un rotor pendant 5 min à RT.
   6. Placez le tube sur l'aimant pendant 1-2 min et retirez soigneusement tout le supernatant et retirez soigneusement tout le supernatant.
   7. Retirer le tube de l'aimant et ajouter 200 l de tampon de lavage.
5. Mesurer la pureté et la concentration de l'ARN polyA^extrait par un spectrophotomètre.
   REMARQUE : Un ratio de 260/280 de 1,90 à 2,00, et un rapport 260/230 de 2,00 à 2,20 pour tous les échantillons d'ARN sont jugés acceptables.
6. Utiliser la moitié restante des échantillons appauvris en ARNr de la section 3.3 comme entrée dans les colonnes de protéines A (fournies dans le kit d'immunoprécipitation de l'ARN [RIP], Tableau des matériaux) pour immunoprécipiter les ARN à cinq primes à l'aide d'un monoclonal 7-méthylguanosine anticorps de la manière suivante :
   REMARQUE : Ce protocole d'isoler l'ARN de messager plafonné de m7G utilisant un kit d'immunoprécipitation d'ARN disponible dans le commerce a été coopté et davantage modifié.
   1. Laver les perles magnétiques de protéines A obtenues à partir du kit RIP selon le protocole du fabricant pour pré-lier l'anticorps aux perles.
   2. Transférer 3 g d'anticorps 7-méthylguanosine (le lapin IgG fourni dans le kit peut être utilisé le contrôle négatif) aux perles dans un tube de microcentrifuge suspendu dans un tampon de lavage de 100 l du kit.
   3. Incuber avec une rotation à basse vitesse pendant 30 min à RT. Tubes Centrifuge brièvement, puis placer les tubes sur un séparateur magnétique, enlever et jeter le supernatant.
   4. Retirez brièvement les tubes et ajoutez 500 l de tampon de lavage du kit et vortex. Centrifuger les tubes brièvement suivi d'une séparation magnétique une fois de plus, enlever et jeter le supernatant.
   5. Répétez l'étape 3.6.4 une fois de plus.
   6. Ajoutez environ 120 ng de rRNA appauvri (de la section 3.3) aux perles liées à l'anticorps 7-méthylguanosine prélavées. Ajouter 1 l d'inhibiteur de la RNase. Incuber à RT pendant 1 h à 1,5 h avec une légère agitation.
   7. Faites tourner les perles à 300 x g pour 10 s et retirez le supernatant contenant l'ARNm non plafonné (non-7-méthylguanosine) à un nouveau tube de microcentrifugeur.
   8. Ajouter 100 l de tampon de lavage et laver deux fois de plus de la même façon. Mettre en commun le supernatant recueilli dans le même tube microcentrifuge étiqueté non plafonné (non-7-méthylguanosine) ARNm. Conserver sur la glace.
   9. Éluter l'ARNm plafonné (7-méthylguanosine) des perles avec 300 l de tampon de lyse d'urée (ULB) contenant 7 M d'urée, 2 % de SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA et 10 mM Tris, pH 7,5 en chauffant les perles à 65 oC pour 2 à 3 min.
   10. Mélanger 300 l d'échantillons élifiés (ARNm plafonné et non plafonné) avec 300 l de phénol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1; disponible dans le commerce) (stocké à 4 oC). Bien mélanger en inversant et laisser reposer environ 10 min puis mélanger à nouveau délicatement.
   11. Centrifugeuse à 18 928 x g pendant 2 min et soigneusement pipette la couche supérieure au tube frais et jeter la couche inférieure.
   12. Ajouter 300 ll de phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1; stocké à 4 oC) aux échantillons. Bien mélanger en inversant puis en centrifugeuse à 18 928 x g pendant 1 min. Soigneusement, pipette la couche supérieure à un tube frais et jeter la couche inférieure.
   13. Ajouter 300 oL de 2 porpanol et 30 l d'acétate de sodium de 3 M (pH 5,2) à l'ARN plafonné et non plafonné. Inverser l'échantillon à quelques reprises et le mettre à -20 oC pendant 20 h.
   14. Maintenant, centrifuger les échantillons à 18 928 x g pendant 10 min à 4 oC. Retirez soigneusement le supernatant et ajoutez 500 L d'éthanol à 70 %.
   15. Centrifugeuse à nouveau à 18 928 x g pendant 10 min à 4 oC. Jetez soigneusement le supernatant et séchez la pastille à RT pendant moins de 5 min. Resuspendre la pastille dans de l'eau sans nucléaris.
7. Mesurer la pureté et la concentration du rendement de l'ARN à l'un spectrophotomètre. Le ratio 260/280 devrait être de l'ordre de 1,90 à 2,00, et le ratio 260/230 de l'ordre de 2,00 à 2,20 pour tous les échantillons d'ARN.

4. Essai de confirmation pour évaluer la réponse de la souris TE^certainement modèle à la mort cellulaire médiée FasL

1. Nombre égal de graines (30 000 cellules) de cellules de mélanome de souris traitées par flavopiridol B16/F10 et cellules de mélanome de souris B16/F10 parentales dans une plaque de culture de 96 puits dans leur milieu correspondant (DMEM), et incuber pendant la nuit dans un 37 oC, 5 % CO₂ humidifié couveuse.
2. Traiter les cellules dans une hotte de culture avec différentes concentrations de h_son6FasL (0.1-1000 ng/mL) en présence de 10 'g/mL anti-His anticorps et incuber pendant 24 h à 37 oC, 5% CO₂ incubateur humidifié.
3. Enlever les cellules mortes en les lavant avec un tampon PBS 1x. Fixez les cellules attachées dans 4 % de paraformaldéhyde pendant 20 min à RT. Jetez le paraformaldéhyde de 4 % (pas besoin de se laver) et tachez-les avec une solution violette cristalline (20 % de méthanol, 0,5 % de violette cristalline en 1x PBS) pendant 30 min.
4. Enlever l'excès de taches en rinçant doucement les assiettes dans l'eau du robinet. Gardez les assiettes à sécher à RT.
5. Redissoudrez la violette cristalline en 100 oL de surfactant nonionique 1x dissous en 1x PBS, et mesurez la densité cellulaire en mesurant l'absorption à 570 nm dans un lecteur de microplaques.

5. Analyse exploratoire pour évaluer la réponse de la souris TE^certainement modèle à l'attaque cytotoxique spécifique d'antigène de cellule T

1. Isolement et activation de l'attaque à cellule T cytotoxique OT-I CD8MD (CTL)
   1. Purifez les cellules CD8MD à partir de la rate des souris OT-I TCR Tg RAG-1MD par séparation des cellules magnétiques à l'aide d'un kit d'isolement cellulaire T CD8 de souris comme suit :
      1. Récoltez deux rates de deux souris OT-I TCR Tg RAG-1MD/MD dans des milieux COMPLETs de RPMI.
      2. Écraser les rates dans un filtre de 70 m conservé sur un tube de 50 ml rempli de 20 ml de RPMI, en utilisant le dos d'une seringue jusqu'à ce que seule la graisse reste dans le filtre.
      3. Centrifuger le flux à travers à 220 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
      4. Ajouter 1 ml de tampon de lyse des globules rouges (RBC) à la granule de rate de l'étape de centrifugation précédente et pipette le mélange pendant 1 min.
      5. Neutraliser la solution en ajoutant jusqu'à 10 ml de RPMI.
      6. Centrifugeuse à 220 x g pendant 5 min à 4 oC. Jeter le supernatant et le suspendre dans 10 ml de RPMI.
      7. Prenez un petit aliquot pour le comptage. Centrifuger le reste à 220 x g pendant 5 min à 4 oC.
      8. Pour chaque million de cellules comptées, resuspendre le granule dans 1 ml de tampon de système de séparation magnétique disponible dans le commerce (tampon Mojo ou tampon similaire).
      9. Préparer un cocktail d'anticorps de volume 100 l pour chaque 1 ml de cellules granulées à l'étape 5.1.1.8. Le cocktail d'anticorps comprend : biotine anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR MD/MD et CD44.
      10. Ajouter ce cocktail aux cellules granulées de 1 ml et conserver sur la glace pendant 15 min.
      11. Ajouter 100 l de perles magnétiques (streptavidine) à chaque 100 l du cocktail d'anticorps ajoutés aux cellules de rate à granulés resuspensionnés de 1 ml. Garder sur la glace pendant 15 min.
      12. Ajouter 7 mL de tampon de système de séparation magnétique disponible dans le commerce. Maintenant, aliquot environ 3 -4 ml du mélange à un tube frais. Bien mélanger et le fixer à l'aimant pendant 5 min.
      13. Décantlez le liquide (contient des cellules CD8MD) dans un tube frais sur la glace. Maintenant, aliquot les 3-4 ml restants de mélange de l'étape 5.1.1.12 au tube et le fixer à l'aimant pendant 5 min. Decant le liquide (deuxième lot de cellules CD8 'isolés) au même tube contenant le premier lot de cellules CD8 'conservés sur la glace.
   2. Seed aisté le fibroblaste adhérent APC-(MEC. Le B7. SigOVA) ligne pour exprimer une ovalbumine spécifique (OVA) dérivée, H-2Kb-restricted peptide epitope OVA257-264 (SIINFEKL), avec la molécule co-stimulatoire B7.1, à 75 000 cellules par puits dans des plaques de 24 puits, à 37 oC, 5% CO_2ified incubateur humide.
      REMARQUE : Le fibroblaste adhérent utilisé est un cadeau du laboratoire du Dr Edith Janssen au CCHMC. La ligne a été créée à l'origine dans le laboratoire du Dr Stephen P. Schoenberger à la Jolla Institute for Allergy and Immunology⁶.
   3. Après 24 h, lavez la monocouche d'APC une fois avec le milieu modifié de Dulbecco (IMDM) modifié d'Iscove disponible dans le commerce avec le tampon HEPES, le pyruvate de sodium, la L-glutamine et le glucose élevé), et ajoutez 0,5 x 10⁶ cellules naïves ot-I CD8MD (à partir de l'étape 5.1.1.13) dans 2 mL d'IMDM complété par 50 mM-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-glutamine et HEPES et 10% FBS.
   4. Après 20 h, récoltez délicatement les cellules OT-I non adhérentes (en recueillant les supports dans le plat de culture avec des cellules OT-I flottantes et en pelletant les cellules à 191 x g pendant 2 min; comptez les cellules OT-I viables) et transférez-les pour la co-culture.
2. Co-culture des cellules CD8MD avec des cellules B16/F10-OVA
   1. Seed OT-I-derived CD8 MD cellules à un rapport de 1:1 (300 000 cellules chacune) dans une co-culture avec B16/F10 (manquant d'ovalbumine antigène), B16/F10-OVA non traitée, et cellules B16/F10-OVA prétraitées avec flavopiridol (25 nM) pendant 1 semaine, dans des plats de 6 puits avec DME complet médias pendant 20 h à 37 oC dans un incubateur humidifié CO₂ de 5 %.
   2. Après 20 h, retirez les cellules CD8D dérivées de l'OT-I (en recueillant les médias dans le plat de culture avec des cellules CD8 MD d'OT-I flottantes). Laver les cellules adhérentes B16/F10-OVA en 1x PBS.
   3. Trypsiniser les trois groupes de cellules B16/F10-OVA jointes dans 0,05% EDTA contenant de la trypsine pendant 5 min. Pellet les cellules trypsinisées à 191 x g pendant 5 min.
   4. Tainr les cellules B16/F10-OVA récoltées en les incubant dans du PBS froid (contenant 0,5 % de FBS et 0,05 % d'azide de sodium) avec un colorant de viabilité et des anticorps étiquetés pertinents (colorant de viabilité réparable e780, souris conjuguées AF647 CD8 et souris vBV421-conjuguées CD45 ).
   5. Analyser la viabilité des trois groupes de cellules B16/F10-OVA par cytométrie de flux.

Résultats

Ici, nous fournissons un schéma détaillé (Figure 1) pour établir un modèle TE^{définitivement} cellulaire obtenu par le traitement sous-étalon-léjon chronique (figure 2) avec flavopiridol à 25 nM. Dans la figure 3, sur 3 jours de traitement avec flavopiridol, B16 ova cellules montrent des caractéristiques partielles de TE^{certainement,} mais après une semaine de traitement...

Discussion

Le contrôle de l'allongement de l'ARN Pol II est apparu comme un levier décisif pour réguler l'expression des gènes sensibles au stimulus au profit des cellules malignes^5,7,8. Surmonter promoteur-proximal pause à l'allongement et la production d'ARNm ultérieure nécessite l'activité kinase de P-TEFb^9,10,11. Notre modèle utilise ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
hhis6FasL	Cell Signaling	5452
10X TBS	Bio-Rad	170-6435
12 well plates	Falcon	353043
20% methanol	Fisher Chemical	A412-4
24-well plates	Falcon	351147
4–18% SDS polyacrylamide gel	Bio-Rad	4561086
4% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
5% dry milk	Bio-Rad	170-6404
7-Methylguanosine antibody	BioVision	6655-30T
96-well plates	Cellstar	655180
AF647-conjugated mouse CD8	Biolegend	100727
antibiotic and antimycotic	Gibco	15240-062
anti-His antibody	Cell Signaling	2366 P
Anti-Rabit	Cell Signaling	7074	Dilution 1:5000
Anti-Rat	Cell Signaling	7077S	Dilution 1:5000
Bradford assay Kit	Bio-Rad	5000121
BSA	ACROS Organics	24040-0100
BV421-conjugated mouse CD45	Biolegend	109831
crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	Gibco	11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25	Ambion	61002
FBS	Gibco	45015
Fixable Live/Dead staining dye e780	eBioscience	65-0865-14
Flavopiridol	Selleckchem	S1230
H3k36me3	Abcam	ab9050	Dilution 1:2000
IFN-α	R&D systems	12100-1
IFN-γ	R&D systems	485-MI-100
IMDM	Gibco	12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007
NF-κB	Cell Signaling	8242s	Dilution 1:1000
PBS	Gibco	14190-144
p-NF-κB	Cell Signaling	3033s	Dilution 1:1000
p-Ser2-RNAPII	Active Motif	61083	Dilution 1:500
p-Ser5-RNAPII	Active Motif	61085	Dilution 1:1000
p-STAT1	Cell Signaling	7649s	Dilution 1:1000
RiboMinu Eukaryote Kit	Ambion	A10837-08
RIPA buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948
RNAPII	Active Motif	61667	Dilution 1:1000
STAT1	Cell Signaling	9175s	Dilution 1:1000
TNF-α	R&D systems	410-MT-010
total H3	Cell Signaling	4499	Dilution 1:2000
Tri reagent	Sigma	T9424
Triton	Sigma	T8787-50ML
Tween 20	AA Hoefer	9005-64-5
β-Actin	Cell Signaling	12620S	Dilution 1:5000
β-ME	G Biosciences	BC98