使用莱迪思光片显微镜可视化表面 T-Cell 受体动力学四维

摘要

该协议的目的是演示如何使用莱迪思光片显微镜对活细胞中的四维可视化表面受体动力学进行可视化。这里显示了^CD4+初级T细胞上的T细胞受体。

摘要

细胞的信号和功能由其表面受体的动态结构和相互作用决定。为了真正了解这些受体在原位的结构-功能关系，我们需要在具有足够时空分辨率的活细胞表面可视化和跟踪它们。在这里，我们展示如何使用最近开发的莱迪思光片显微镜（LLSM）在活细胞膜上以四维（4D、空间和时间）成像T细胞受体（TDR）。T细胞是自适应免疫系统的主要效应细胞之一，在这里，我们以T细胞为例，表明这些细胞的信号和功能是由TDR的动态和相互作用驱动的。LLSM 允许以前所未有的时空分辨率进行 4D 成像。因此，这种显微镜技术通常可以应用于生物学中不同细胞的多种表面或细胞内分子。

引言

分子在三维细胞表面实时贩运和扩散的精确动力学是一个需要解决的难题。显微镜一直是速度、灵敏度和分辨率的平衡;如果任何一个或两个最大化，第三个最小化。因此，由于表面受体移动的体积小、速度极快，跟踪其动力学仍然是细胞生物学领域的一项重大技术挑战。例如，许多研究都是使用总内部反射荧光（TIRF）显微镜^1，2，3，具有高时间分辨率，但只能成像T细胞膜（+100nm）的非常薄的切片，因此错过了在细胞更远发生的事件。这些 TIRF 图像也只显示细胞的二维部分。相比之下，超分辨率技术，如随机光学重建显微镜^{（STORM）4、}光活化定位显微镜（PALM）5和刺激发射损耗显微镜（STED）6，可以克服Abbe衍射光极限。这些技术具有高空间分辨率（+20 nm分辨率）4，5，6，7，但它们通常需要几分钟才能获得完整的二维（2D）或三维（3D）图像，因此时间分辨率会丢失。此外，像STORM和PALM这样的依赖闪烁信号的技术在计数^8、9中可能有不准确之处。电子显微镜具有迄今为止最高的分辨率（高达50pm分辨率^）10;它甚至可以进行三维与聚焦的电束扫描电子显微镜（FIB-SEM），导致高达3纳米XY和500纳米Z分辨率^11。然而，任何形式的电子显微镜都需要严酷的样品制备，只能用固定细胞或组织进行，从而消除了随时间而成像活样本的可能性。

获得识别活细胞中表面和细胞内分子动力学所需的高时空分辨率的技术，在真正的生理三维性质中，最近才得到开发。其中一种技术是莱迪思光片显微镜（LLSM）12，它利用结构化的光片来大大降低光漂白。由诺贝尔奖获得者Eric Betzig于2014年开发，高轴向分辨率，低光漂白和背景噪声，并能同时成像数百平面每个视场，使LLS显微镜优于宽场，TIRF和共聚焦显微镜12，13，14，15，16，17，18，19。这种四维（x、y、z 和时间）成像技术虽然仍然衍射受限（±200 nm XYZ 分辨率），但具有令人难以置信的时间分辨率（我们实现了约 100 fps 的帧速率，从而为 3D 空间采集构建了 0.85 秒的 3D 重建单元图像）。

LLSM通常用于跟踪单分子和单细胞水平下任何细胞内任何分子的实时动态，尤其是高活动细胞（如免疫细胞）中的分子。例如，我们在这里演示如何使用 LLSM 来可视化 T 细胞受体 （TCR） 动力学。T细胞是适应性免疫系统的效应细胞。TDR 负责识别抗原呈现细胞 （APC） 表面显示的肽-MHC （pMHC） 配体，它确定 T 细胞的选择、发育、分化、命运和功能。这种识别发生在T细胞和APC之间的接口，导致局部受体聚类形成所谓的免疫突触。虽然众所周知，免疫突触中的 TCR 对于 T 细胞效应器功能至关重要，但仍然未知实时 TCR 贩运到突触的基本机制。LLSM 使我们能够通过产生的 pMHC-TCR 交互作用实时可视化 TDR 在贩运到突触之前和之后的动态（图 1）。因此，LLSM可用于解决TDR形成动力学的当前问题，并提供见解，以了解细胞如何区分自身和外来抗原。

研究方案

5C.C7 TCR-转基因RAG2敲除小鼠在B10。根据芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准的协议，在这项研究中使用了背景。

1. 收获和激活T细胞

注: 协议的这一部分基于以前的协议。有关更多详情^20，21， 请参阅引文。

1. 安乐死一个10-12周老的5C。C7 转基因小鼠的两个性别 （+20-25 g） 根据批准的 IACUC 协议 （即 CO₂室后跟宫颈脱位）。
2. 用70%乙醇彻底喷洒小鼠尸体，将毛皮浸泡，并放入BSL-2安全柜中。
3. 将鼠标转向其右侧，用手术剪刀在体腔中进行小切口。使用手术钳切除脾脏。用手术剪刀切掉结缔组织。
4. 将脾脏放入 70 μm-孔网细胞滤网中，然后与 1 mL 注射器柱塞的背面混合。用完整的 RPMI 彻底清洗滤网（RPMI 与 10% 胎儿牛血清 [FBS]、2 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素、50 μM 2-甲氨酰胺）。
5. 将单细胞悬浮液悬浮在300 x g下5分钟，丢弃上清液。
   注:此时的颗粒为红色。
6. 在 5 mL RBC 解液缓冲液中重新悬浮塞浦细胞。孵育5分钟，然后用5 mL的完整RPMI淬火。
7. 将单细胞悬浮液悬浮在300 x g下5分钟，丢弃上清液。
   注:此时的颗粒应为白色，而不是红色。
8. 将颗粒重新悬浮在 5 mL 的完整 RPMI 中。
9. 转移到T-25烧瓶，并添加10μM月牙细胞色素-C（MCC，序列ANERADLIYLKQATK）。将细胞置于细胞培养箱中，温度为37°C，CO2为5%。
10. 第二天，将重组小鼠IL-2添加到100 U/mL的最终浓度中。
11. 观察接下来的几天，在当前介质变为黄色时添加新的媒体。T细胞如果留在黄色介质中超过48小时，就会死亡。

2. 准备细胞

1. 用0.1%的多L-Lysin孵育5毫米圆盖唇10分钟。吸气关闭，自然干燥。
2. 使用密度梯度试剂（见材料表）分离死细胞，并分别获得1 x 10⁶ T细胞和1 x 10⁶ APC（CH27细胞^21，22转导与细胞体mCherry）。
   注:使用血细胞计计算细胞。
   1. 将3 mL的密度梯度试剂加入15 mL锥形管中，并小心地将细胞滴到管的边缘。请勿混合。在930 x g下在4°C下离心10分钟;使用加速/减速:慢/慢。小心地去除完整介质和密度梯度试剂之间的薄中间层细胞，将每种细胞类型放入单独的锥形管中。
      注:需要制备比成像所需的更多的细胞，因为我们发现在此过程中平均损失50%。用于该过程的细胞越多，就越容易从密度梯度中采集它们。我们使用两种细胞类型的4-8 mL来确保多余细胞。如果需要，可以在此步骤之前对单元格进行计数，以确保所需的体积。任何额外的细胞被放回各自的瓶中。
   2. 用 5 mL 完全 RPMI（300 x g为 5 分钟）清洗 T 细胞和 CH27 细胞的两管三次。每次洗涤时都丢弃上清液。将每根管子重新悬浮在1 mL完整的RPMI中，用血细胞计计算细胞。
3. 在 500 μL 完整 RPMI 中重新悬浮 1 x 10⁶ APC 并添加 10 μM MCC。在37°C下孵育3小时，CO₂孵育5%。用 500 μL 完整 RPMI（300 x g 5 分钟）清洗细胞三次。丢弃上生物。
4. 在 500 μL 完整 RPMI 中重新悬浮 1 x 10⁶ T 细胞。将2μg抗TCR®Alexa488标记的Fab（克隆H57）加入500μL的细胞中。在37°C下孵育30分钟，CO₂为5%。用 500 μL 的完整 RPMI（300 x g 5 分钟）清洗细胞三次。每次洗涤后丢弃上清液。
   注:二价抗TCR抗体被切割成单价Fab使用Fab制备试剂盒（见材料表），以避免交错T细胞受体的二价抗体（此步骤是可选的）。
5. 在500μL的成像培养基中重新悬浮两种细胞类型（不含苯酚红的莱博维茨的L-15培养基，10%FBS，1%青霉素/链霉素，2 mM L-谷氨酰胺）。

3. 进行 LLSM 每日对齐

注:（重要）此对齐协议基于所使用的 LLSM 仪器（参见材料表）。每个 LLSM 可能不同，需要不同的对齐策略，特别是那些自建的策略。执行适当的常规校准，并继续执行第 4 节。

1. 向 LLSM 浴（±10 mL 体积）添加 10 mL 的水加上 30 μL 荧光剂（1 mg/mL 库存），按图像（首页）将目标移动到图像位置，并查看单个 Bessel 激光束模式。使用导板和预设的感兴趣区域 （ROI） 对齐激光束，使光束在所有方向上保持薄型平衡。
   1. 光束还应在查找器相机中聚焦。使用两个镜面倾斜调节器、顶部千分尺、对焦和排放目标环进行调整。有关正确对齐的光束，请参阅图 2A、B。
2. 用至少200 mL的水清洗浴缸和镜点，以完全去除荧光。
3. 成像介质中的图像标准荧光珠（通过将珠子粘附在5毫米盖玻片上，用聚L-赖因，参见材料表;这可以预先准备和重复使用），用于成像介质的物理点传播功能（PSF）。
   注: 视图中只能有一个珠子供以后处理，因此请尝试在查看器中查找自身或可以轻松裁剪以获得单个珠子的珠子。
   1. 在"X Galvo 范围"框中设置为 3 打开分头。按"实时"查看当前字段。沿 Z 方向移动以查找盖滑和珠子。沿着 Z 移动找到珠子的中心，按停止以暂停激光。检查3D，新闻中心，然后按执行。这将收集数据。
   2. 手动调整倾斜镜、目标环和对焦千分尺以达到最高的灰色值，然后根据需要进行调整，以获得目标扫描、z galvo、z_objective（totPSF）和样本扫描（samplePSF）捕获模式的正确模式。有关正确调整的最大强度投影 （MiPs），请参见图 2C-F。
      注: 各种捕获模式（目标扫描、z galvo、z_物和样品扫描）改变了光片在样品中移动的方式。所有扫描模式都应用于对齐。
   3. 示例扫描显示在实验期间如何收集数据。在样品扫描模式下按"执行"以进行桌面旋转和反卷积，从而收集 PSF 样本（参见第 5 节）。将激光更改为三种颜色模式 （488、560、647），然后再次按"执行"。
      注:由于 LLSM 图像以一定角度 （57.2°），因此以"样本扫描"模式捕获的图像以此角度收集，因此会"倾斜"。去倾斜是校正此角度并将图像"重新对齐"到真实 z 堆栈的过程。这些数据必须在成像介质和实验期间进行成像的所有通道中收集。如果未正确收集，数据将无法正确取消偏斜。同样，确保介质已加热到 37°C（或所需的实验温度）。

4. 使用 LLSM 设置单元格

1. 将步骤 2.5 中 100，000 APC （50 μL） 添加到步骤 2.1 的 5 mm 直径圆形盖玻片中，并允许它们沉淀 10 分钟。
2. 润滑样品支架，然后将盖玻片单元侧向上添加到样品架上。在盖玻片背面添加一滴成像介质，以避免在放入浴缸之前出现气泡。将样品架拧到压电上，然后按图像（首页）。
3. 找到要映像的 APC 以确保 LLSM 和成像软件（参见材料表）正常工作。
   注: 我们以 0.4 μm 步长大小成像，两种颜色的分时设置为 3，两种颜色的曝光为 10 毫秒，每帧 3D 图像的分辨率为 ±200 nm XY 和 400 nm Z 分辨率，为 1.54 s。这些设置可能需要根据所使用的荧光标记技术的细胞大小、所需的 z 分辨率和信号强度进行调整。激光功率的使用也会因使用的荧光标记技术而异。
   1. 按"实时"查看当前图像。沿 Z 移动以查找盖滑和单元格。
   2. 通过朝 Z 方向移动找到 APC 的中心，然后按"停止"以暂停激光。检查3D并输入所需的设置（请参阅步骤 4.3.1），按"中心"，然后按"执行"。这将收集数据。
4. 降低阶段以加载位置，并在成像介质中添加 50 μL 的 T 细胞（从步骤 2.5 起，从步骤 2.5 开始，直接滴落在盖玻片上）。最好让滴在移液器尖端的末端，然后将尖端接触到沐浴液中。通过单击"图像（返回）"将舞台抬起。
5. 开始成像。请务必设置所需的堆栈大小和时间间隔长度。例如，以 0.4 μm 步长大小为图像 60 z 堆栈并输入 500 个时间帧。（通常）在达到 500 帧之前停止录制，以避免光漂白。使用实时模式搜索单元格对，当输入了就绪和所需的设置时，按"执行"收集数据。有关示例，请参阅影片 1和图 1。

5. 跟踪曲面动力学

1. 从成像软件导出数据（参见材料表）。这将为每个颜色的每个时间点创建 z 堆栈 TIF 文件。
2. 首先对数据进行偏斜和去向。
   注:我们使用由HHMI的Janelia研究园区¹⁸许可的LLSpy管道，但桌面和去卷积也可用于多个成像软件（见材料表）。
3. 去漂白数据。
   注: 我们使用斐济的去漂白功能与直方图匹配（斐济路径:图像 |调整 |漂白剂校正 |直方图匹配 |"确定"
4. 导入跟踪软件（参见材料表）。根据软件规范跟踪群集。有关示例，请参阅影片 2。
   注:跟踪结果将取决于所使用的跟踪软件、选择的算法、选择的所需输出参数等。例如，在我们使用的跟踪软件（参见材料表）中，我们选择允许软件跟踪不规则的形状，而不是为每个特征分配一个点，因为TCR集群没有组织成完美的球体。此外，我们选择收集 35 个参数，包括速度、方向、体积、强度、面积、位置和跟踪持续时间信息。但是，不同的方法或参数将有助于回答不同的问题。
   1. 如果不需要跟踪，请使用斐济的 ClearVolume 插件从超堆栈数据可视化和创建影片。

结果

在这里，我们描述了主鼠标5C的隔离、制备和成像。C7 T细胞使用晶格光片显微镜。在第 3 节中，必须正确对齐显微镜，并每天收集 PSF，以便收集后对数据进行分批。在图2中，我们显示了校准显微镜时将看到的正确对齐图像。图 2A和图 2B显示了在荧光中成像时分别正确的光束路径和光束对齐。目标扫描应?...

讨论

针对从5C分离的CD4⁺ T细胞的使用，对所呈现的协议进行了优化。C7转基因小鼠在LLSM仪器上使用，因此其他细胞系统和LLSM可能需要以不同的方式优化。然而，该协议显示了4D成像的力量，因为它可以用来量化整个细胞表面受体的动态，在生理条件中失真最小。因此，这种技术有许多可能的未来应用。

关键步骤是允许细胞以适当的浓度沉降。如果太多的 APC 在盖玻上安顿?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659	For T cell harvest
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	For T cell culture
5 mm round coverslips	World Precision Instruments	502040	For Imaging
70um Sterile Cell Strainer	Corning	7201431	For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody	BioLegend	109215	For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)	X&Y Cell Culture	FBS-500	For T cell culture
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	F6377	For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres	Thermo Fisher Scientific	F8810	For microscope alignment
Imaris	Bitplane	N/A	Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope	3i	N/A	Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	21083027	For Imaging
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-081	For T cell culture
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Custom Synthesis	For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin	Life Technologies	15140122_3683884612	For T cell culture
Poly-L-Lysine	Phenix Research Products	P8920-100ML	For Imaging
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54	For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	For T cell culture
RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	For T cell culture
Slidebook	3i	N/A	LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools	Nova-Tech International	DSET10	For T cell harvest
T-25 Flasks	Eppendorf	2231710126	For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits	Thermo Fisher Scientific	44685	For preparing Fab