דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

Jillian Rosenberg; Jun Huang

doi:10.3791/59914

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4⁺ תאי t הראשי מוצגים.

Abstract

האיתות והתפקוד של תא מוכתבים על-ידי מבנים דינאמיים ואינטראקציות של קולטני פני השטח שלה. כדי באמת להבין את היחסים מבנה פונקציה של קולטנים אלה באתרו, אנחנו צריכים להמחיש ולעקוב אחריהם על פני השטח התא לחיות עם רזולוציה מספקת הזמן הזמני. כאן אנו מראים כיצד להשתמש לאחרונה פיתח רשת מיקרוסקופית גיליון אור (LLSM) לתמונה קולטני T-cell (TCRs) ארבע-מימדי (4D, מרחב וזמן) בקרום התא החי. תאי T הם אחד התאים העיקרי של האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית, וכאן השתמשנו בתאי T כדוגמה כדי להראות כי האיתות והפונקציה של תאים אלה מונעים על ידי הדינמיקה ואינטראקציות של TCRs. LLSM מאפשר הדמיה 4D עם רזולוציה חסרת תקדים הזמני. טכניקה זו מיקרוסקופית ולכן ניתן להחיל בדרך כלל על מגוון רחב של מולקולות משטח או תאיים של תאים שונים בביולוגיה.

Introduction

הדינמיקה המדויקת של הסחר במולקולות והפצת המשטחים התלת-ממדיים בזמן אמת הייתה תעלומה לפתרון. מיקרוסקופ תמיד היה איזון של מהירות, רגישות, ורזולוציה; אם אחד או שניים מהם מוגדלים, השליש ממוזער. לכן, בשל גודל קטן ומהירות עצומה עם אילו קולטני פני השטח לנוע, מעקב אחר הדינמיקה שלהם נשאר אתגר טכנולוגי גדול לתחום של ביולוגיה התא. לדוגמה, מחקרים רבים נערכו באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (tirf)¹^,²^,³, אשר יש ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה, אבל יכול רק תמונה פרוסה דקה מאוד של קרום T-cell (~ 100 nm), ולכן מחמיץ אירועים קורה רחוק יותר בתא. אלה תמונות TIRF גם מראה קטע דו מימדי של התא. לעומת זאת, טכניקות ברזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סטורם)⁴, מיקרוסקופ לוקליזציה פוטומופעל (PALM)⁵, ו מיקרוסקופית פליטה מגורה (ההיסטד)⁶, יכול להתגבר על מגבלת מגביל של אבה של האור. טכניקות אלה יש רזולוציה מרחבית גבוהה (~ 20 החלטה nm)⁴^,⁵^,⁶^,⁷, אבל לעתים קרובות הם לוקחים הרבה דקות כדי לרכוש מלא דו-ממדי (2d) או תלת מימדי (3d) התמונה, ולכן הרזולוציה הטמפורלית אובד. בנוסף, טכניקות כגון הסערה והדקל המסתמכים על אותות מהבהבים עשויים להיות אי-דיוקים בספירת⁸^,⁹. מיקרוסקופ אלקטרוני יש הרזולוציה הגבוהה ביותר (עד 50 pm החלטה)¹⁰; זה יכול אפילו להתבצע תלת מימדי עם קרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ (פרפור-SEM), וכתוצאה מכך 3 ננומטר XY ו 500 nm Z החלטה¹¹. עם זאת, כל צורה של אלקטרון מיקרוסקופ דורש הכנה לדוגמה קשה יכול להתבצע רק עם תאים קבועים או רקמות, ביטול האפשרות של הדמיה לחיות דגימות לאורך זמן.

טכניקות כדי להשיג את הרזולוציה גבוהה זמן זמן הדרוש כדי לזהות את הדינמיקה של פני השטח מולקולות תאיים בתאים חיים בטבע הפיזיולוגי האמיתי שלהם 3d הוא רק לאחרונה פיתח. אחת הטכניקות הללו היא מיקרוסקופ גיליון האור של סריג (LLSM)¹², אשר מנצל גיליון אור מובנה כדי להקטין באופן דרסטי הלבנה. פותח בשנת 2014 על ידי חתן פרס נובל אריק ביאזיג, הרזולוציה הגבוהה בציר, הלבנה נמוכה ורעש הרקע, ואת היכולת לדמות בו מאות מטוסים לשדה התצוגה להפוך מיקרוסקופים מעולה לשדה שטח, tirf ו^{קונפוקלית יקרוסקופים}¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. זה 4-מימדי (x, y, z ו-time) הדמיה טכניקה, בעוד עקיפה מוגבלת (~ 200 ננומטר החלטה XYZ), יש ברזולוציה הטמפורלית מדהים (השגנו שיעור מסגרת של כ 100 fps, וכתוצאה מכך תמונת תא 3D שוחזר עם 0.85 שניות לכל מסגרת) עבור רכישה מרחבית תלת-ממדית.

Llsm ניתן להשתמש בדרך כלל כדי לעקוב אחר הדינמיקה בזמן אמת של כל המולקולות בתוך תא כלשהו ברמת מולקולה אחת וברמה תא יחיד, במיוחד אלה בתאי נעים מאוד כגון תאים חיסוניים. לדוגמה, אנו מראים כאן כיצד להשתמש ב-LLSM כדי להמחיש דינאמיקה של קולטן T-cell (TCR). תאי T הם התאים האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית. TCRs אחראים לזיהוי פפטיד-MHC (pMHC) ליגנדס הציג על פני השטח של תאים המציגים אנטיגן (APC), אשר קובע את הבחירה, פיתוח, בידול, גורל, ותפקוד של תא T. הכרה זו מתרחשת בממשק שבין תאי T ו-APCs, וכתוצאה מכך, באשכולות הקולטן מקומי כדי ליצור את מה שנקרא סינפולוגית. אמנם ידוע כי TCRs ב סינפולוגית החיסונית הם הכרחי לפונקציה T-cell אפקטור, עדיין לא ידוע הם המנגנונים הבסיסיים של סחר TCR בזמן אמת הסינפסה. LLSM אפשרה לנו לדמיין בזמן אמת את הדינמיקה של TCRs לפני ואחרי הסחר בסינפסה עם האינטראקציה הנובעת pMHC-TCR (איור 1). LLSM ניתן להשתמש לפיכך כדי לפתור את השאלות הנוכחיות של הדינמיקה המעצבים של TCRs ולספק תובנות כדי להבין כיצד תא מבדיל בין אנטיגנים עצמאיים וזרים.

Protocol

5C. C7 TCR-transgenic RAG2 עכברים בB10. הרקע שימש במחקר זה על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו.

1. קציר והפעל תאי T

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוסס על פרוטוקולים קודמים. ראה אזכורים לפרטים נוספים²⁰^,²¹.

המתת חסד a 10-12 שבוע בן 5 ג. העכבר C7 טרנסגניים של שני מין (~ 20-25 g) על פי פרוטוקול IACUC מאושר (כלומר, חדר CO₂ ואחריו פריקה צוואר הרחם).
ספריי גווייה העכבר ביסודיות עם 70% אתנול לספוג את הפרווה ולהביא לארון בטיחות BSL-2.
להפוך את העכבר על הצד הימני שלו ולעשות חתך קטן בחלל הגוף עם מספריים כירורגית. להסיר את הטחול באמצעות מלקחיים כירורגי. חותכים את רקמת החיבור כנדרש עם מספריים כירורגיים.
מניחים את הטחול ב 70 μm-הנקבוביות תא מסננת ומחית עם הגב של מזרק 1 mL. לשטוף דרך מסננת ביסודיות עם RPMI מלאה (RPMI עם 10% סרום של שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 50 μM 2-mercaptoethanol).
צנטריפוגה את התא הבולם היחיד של הטחול ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
הערה: הגלולה בנקודה זו תהיה אדומה.
השהה מחדש את הטחול במאגר של 5 מ ל לפירוק. דגירה עבור 5 דקות, ואז להרוות עם 5 מ ל של RPMI השלם.
צנטריפוגה את התא הבולם היחיד של הטחול ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
הערה: הגלולה בנקודה זו צריכה להיות לבנה, לא אדומה.
השהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל להשלמת RPMI.
העבר לבקבוקון T-25 והוסף 10 μM עש ציטוכרום-C (מק, רצף אנארדיליאיקטק). הניחו את התאים בחממה לתרבות התא ב-37 ° c, 5% CO₂ לילה.
ביום למחרת, להוסיף רקומביננטי עכבר IL-2 לריכוז הסופי של 100 U/mL.
צפו בימים הבאים, הוספת מדיה טרייה כאשר המדיה הנוכחית הופכת לצהובה. תאי T ימותו אם שמאל במדיה צהוב ללא השגחה עבור מעל 48 h. תאים מוכנים להשתמש 6-10 ימים לאחר הקציר.

2. הכן תאים

מודטה 5 מילימטר שמיכות עגול עם 0.1% פולי-L-ליזין עבור 10 דקות.. ולתת להתייבש באופן טבעי
השתמש מגיב הדרגתי צפיפות (לראות את הטבלה של חומרים) כדי להפריד תאים מתים להשיג 1 x 10⁶ תאים T ו-1 x 10⁶ apcs (CH27 תאים²¹^{, 22 התמרה} באמצעות ציטוסולג mcherry) בנפרד.
הערה: תאים נספרים באמצעות הומוציטוטומטר.
1. הוסף 3 מ ל של צפיפות מעבר הצבע מגיב ל 15 מ"ל צינור חרוט ולהוסיף תאים dropwise לקצה הצינור בזהירות. אל תערבב. צנטריפוגה ב 930 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c; השתמש בהאצת/האטה: איטית/איטית. הסר את שכבת התאים האמצעית הדקה בין המדיה המלאה ומעבר הצבע המגיב בקפידה, תוך הצבת כל סוג תא בצינורות חרוטיים נפרדים.
  הערה: יש צורך להכין יותר תאים מהדרוש להדמיה, כפי שאנו מוצאים כי 50% אובד בממוצע במהלך התהליך. יותר תאים המשמשים את התהליך, קל יותר לקצור אותם מעבר הדרגתי צפיפות. אנו משתמשים 4-8 mL של שני סוגי התא כדי להבטיח תאים עודפים. במקרה הצורך, ניתן לספור תאים לפני שלב זה כדי להבטיח את נפח האחסון הדרוש. כל התאים הנוספים הם בחזרה לתוך מבחנות בהתאמה שלהם.
2. לשטוף את שתי הצינורות של תאים T ו CH27 תאים שלוש פעמים עם 5 mL להשלים RPMI (300 x g עבור 5 דקות). התעלם מהסופרנטנט בכל פעם בזמן השטיפה. השהה מחדש כל צינור ב-1 mL להשלים RPMI ולספור תאים על ידי הומוציטומטר.
השעיה מחדש 1 x 10⁶ apcs ב 500 μl להשלים RPMI ולהוסיף 10 ΜM mcc. דגירה עבור 3 h ב 37 ° צ', 5% CO₂. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL RPMI להשלים (300 x g עבור 5 דקות). . להיפטר מהסופרנטנמלים
השהה מחדש 1 x 10⁶ תאים T ב 500 μl השלם RPMI. להוסיף 2 μg של anti-TCRβ Alexa488 התווית Fab (שיבוט H57) כדי 500 μL של תאים. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c, 5% CO₂. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של RPMI השלם (300 x g עבור 5 דקות). מחק את הסופרנטאנט לאחר כל כביסה.
הערה: הנוגדן האנטי-ממדי שנחתך באמצעות ערכת הכנה מסוג Fab (ראה את שולחן החומרים) כדי למנוע התחברות של קולטני התא T על-ידי הנוגדן הדינטי (שלב זה הוא אופציונלי).
השהה מחדש את שני סוגי התאים ב-500 μL של מדיית דימות (פנול-free-15 בינוני של לייבוביץ עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין).

3. הנהלת המערך היומי של LLSM

הערה: (חשוב) פרוטוקול יישור זה מבוסס על כלי ה-LLSM המשמש (ראה את טבלת החומרים). כל LLSM עשוי להיות שונה ודורשים אסטרטגיות יישור שונות, במיוחד אלה שנבנו בבית. בצע את היישור השגרתי המתאים והמשך לסעיף 4.

הוסף 10 מ ל של מים פלוס 30 μL fluorescein (1 מ"ג/mL מלאי) אל האמבטיה LLSM (~ 10 mL נפח), לחץ על תמונה (Home) כדי להעביר את המטרה למיקום התמונה, ולהסתכל על תבנית יחידה לייזר בסל. יישר את קרן הלייזר בעזרת המדריכים והאזור שנקבע מראש של ריבית (ROI) כדי להפוך את הקרן לתבנית דקה בכל הכיוונים.
1. הקרן צריך גם להופיע ממוקד מצלמת מאתר. השתמש שתי מראה להטות משקף, מיקרומטר העליון, פוקוס, וצווארון אובייקטיבי המטרה כדי לכוונן. ראה איור 2א, B עבור קרן מיושרת כהלכה.
לשטוף את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 mL של מים כדי להסיר לחלוטין fluorescein.
התמונה חרוזים בתקן פלורסנט במדיה הדמיה (מוכן על ידי שמירה חרוזים 5 מ"מ coverslip עם פולי-L-ליזין, לראות את הטבלה של חומרים; זה יכול להיות מראש מוכן מחדש) עבור פונקציה התפשטות נקודה פיזית (psf) במדיה הדמיה.
הערה: יכול להיות רק חרוז אחד בתצוגה לעיבוד מאוחר יותר, כך לנסות למצוא חרוז כי הוא על ידי עצמו בצופה או יכול בקלות להיחתך כדי לקבל חרוז אחד.
1. הפעל מיזוג צבעים על-ידי הגדרה ל-3 בתיבה ' X galvo range '. הקש על Live כדי להציג את השדה הנוכחי. לנוע לאורך כיוון Z כדי למצוא את שובר הכיסוי ואת החרוזים. מצא את המרכז של חרוז על ידי נע לאורך Z, לחץ על הפסק כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת -ממד, הקש מרכז ולאחר מכן לחץ על בצע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.
2. באופן ידני להתאים את המראה הטיה, הצווארון האובייקטיבי, מיקרומטר מיקוד הערכים האפורים הגבוהים ביותר, ולאחר מכן להתאים לפי הצורך כדי להשיג דפוסים הנכון עבור סריקה אובייקטיבית, z galvo, z + מטרה (תוצרת מדומה), ו לדוגמה לסרוק (סמלפימית) ללכוד מצבי. ראה איור 2C-F עבור הקרנות מרביות בעוצמה מקסימלית (mips).
  הערה: מצבי לכידות שונים (סריקה אובייקטיבית, z galvo, z + אובייקטיבי, וסריקה לדוגמה) לשנות את האופן שבו גיליון האור נע דרך המדגם. יש להשתמש בכל מצבי הסריקה לצורך יישור.
3. הסריקה לדוגמה מראה כיצד הנתונים ייאספו במהלך הניסוי. לאסוף את PSF לדוגמה על ידי לחיצה על לבצע במצב סריקה לדוגמה עבור deskewing ופירוק (ראה סעיף 5). לשנות לייזרים למצב צבע שלושה (488, 560, 647) ולחץ לבצע שוב.
  הערה: מאז תמונות LLSM בזווית (57.2 °), תמונות שנתפסו במצב "לסרוק את המדגם" נאספים בזווית זו, ולכן הם "מוטה". De-skewing הוא תהליך של תיקון עבור זווית זו ו "יישור מחדש" את התמונה למחסנית z אמיתי. יש לאסוף נתונים אלה במדיית הדמיה ובכל הערוצים שיהיו בתמונה במהלך הניסוי. אם הדבר לא נאסף כראוי, הנתונים לא יהיו מכווננים כהלכה. כמו כן, ודא שהמדיה הייתה מתחממת ל-37 ° צ' (או לטמפרטורה הניסיונית הרצויה).

4. הגדרת תאים עם LLSM

הוסף 100,000 APCs (50 μL) משלב 2.5 עד 5 מ"מ בקוטר שמיכות מעגלית משלב 2.1 ולאפשר להם להתפשר על 10 דקות.
משמן את מחזיק המדגם ולאחר מכן להוסיף את התא coverslip בצד עד זה. הוסף טיפה של מדיית הדמיה לחלק האחורי של שמיכות כדי למנוע בועות לפני הצבת באמבטיה. לעזאזל עם מחזיק המדגם על piezo, ולחץ על התמונה (Home).
מצא APC לתמונה כדי להבטיח את התוכנה LLSM והדמיה (ראה טבלת חומרים) מתפקד כראוי.
הערה: אנו התמונה בגודל השלב 0.4 יקרומטר עם 60 z-שלבים ו 10 ms חשיפה לשני צבעים עם מיזוג להגדיר 3, אשר תוצאות 1.54 s לכל מסגרת של תמונה תלת-ממדית עם ~ 200 nm ו-400 הרזולוציה ננומטר z. ייתכן שיהיה צורך לכוונן הגדרות אלה על בסיס גודל התא, הרזולוציה הרצויה של z, וכוח האות משיטת תיוג הפלורסנט המשמשת. השימוש בכוח לייזר יהיה גם משתנה בהתבסס על הטכניקה תיוג פלורסנט בשימוש.
1. הקש על Live כדי להציג את התמונה הנוכחית. הזז לאורך Z כדי למצוא את שובר הכיסוי והתאים.
2. מצא את מרכז APC על ידי הזזת כיוון Z, ולאחר מכן לחץ על הפסק כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת -ממד והקלט את ההגדרות הרצויות (ראה שלב 4.3.1), הקש Center ולאחר מכן לחץ על בצע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.
הנמך את השלב כדי לטעון מיקום ולהוסיף 50 μl של תאים T במדיית הדמיה (100,000 תאים, משלב 2.5) dropwise ישירות מעל coverslip. מומלץ לתת טופס טיפה על קצה הפיפטה ולאחר מכן לגעת בקצה לנוזל האמבט. להעלות את השלב בחזרה על ידי לחיצה על "תמונה (לחזור)".
. התחילו בהדמיה הקפד להגדיר את גודל המחסנית הרצוי באורך זמן הקפיצה. לדוגמה, התמונה 60 z-ערימות בגודל 0.4 יקרומטר שלב וקלט 500 מסגרות הזמן. (בדרך כלל) להפסיק את ההקלטה לפני 500 מסגרות מגיעים כדי להימנע photobleaching לבנה. השתמש במצב Live כדי לחפש זוגות תאים וכאשר הגדרות מוכנות ורצויות הוזנו, לחץ על הפעל כדי לאסוף נתונים. ראה סרט 1 ואיור 1 לדוגמה.

5. מעקב אחר דינמיקה של פני השטח

יצא את הנתונים מתוכנת הדימות (עיין בטבלת החומרים). זה ייצור z-מחסנית TIF קבצים עבור כל נקודת זמן בכל צבע.
. קודם כל, ולפרק את המידע
הערה: אנו משתמשים בצינור הנפט LLSpy תחת רישיון על ידי מחקר בקמפוס Janelia של המחקר¹⁸, אבל deskewing ופירוק זמינים גם בתוך תוכנות דימות מרובות (ראה טבלת חומרים).
. לדבליץ את הנתונים
הערה: אנו משתמשים בתכונת הדבליץ של פיג'י עם התאמת היסטוגרמה (מסלול פיג'י: תמונה | כוונן | תיקון אקונומיקה | התאמת היסטוגרמה | בסדר).
יבא לתוך תוכנת המעקב (עיין בטבלת החומרים). עקוב אחר אשכולות לפי מפרטי התוכנה. ראה סרט 2 לדוגמה.
הערה: תוצאות המעקב יהיו תלויות בתוכנת המעקב שבשימוש, באלגוריתם שנבחר, בפרמטרים הרצויים של הפלט שנבחרו, וכו '. לדוגמה, בתוכנת המעקב שלנו (ראה את טבלת החומרים), בחרנו לאפשר לתוכנה לעקוב אחר צורות חריגות, במקום להקצות לכל תכונה נקודה אחת, מאחר שאשכולות tcr אינם מאורגנים לתחומים מושלמים. בנוסף, בחרנו לאסוף 35 פרמטרים, כולל מהירות, כיוון, נפח, עוצמה, אזור, מיקום ומעקב אחר מידע משך. עם זאת, שיטות או פרמטרים שונים יהיו מועילים לענות על שאלות שונות.
1. אם לא רצוי לבצע מעקב, השתמש בתוסף הקול לקבלת המחשה ויצירת סרטים מנתוני היפרמחסנית.

תוצאות

כאן, אנו מתארים את הבידוד, ההכנה, והדמיה של העכבר הראשי 5C. התאים C7 T באמצעות סריג במיקרוסקופ האור. במהלך סעיף 3, זה הכרחי ליישר את המיקרוסקופ כראוי, ולאסוף PSF היומי שבו כדי לפרק את הנתונים לאחר האוסף. באיור 2, אנו מציגים את התמונות יישור הנכון שיראו בעת יישור המיקרוסקופ.

Discussion

הפרוטוקול המוצג היה אופטימיזציה לשימוש של CD4⁺ T תאים מבודדים מ 5c. בשימוש בכלי ה-LLSM משתמשים, ולכן מערכות תאים אחרות ו-Llsm עשויים להיות ממוטבים באופן שונה. עם זאת, פרוטוקול זה מראה את העוצמה של הדמיה 4D, כפי שניתן להשתמש בו כדי לכמת את הדינמיקה של קולטן פני השטח על תא שלם עם עיוות הפחות בתנאי?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

ברצוני להכיר בעצות ובהדרכה של ד ר וייז בינדוקאס באוניברסיטת שיקגו. אנו מודים למתקן הליבה של מיקרוסקופ אור משולב באוניברסיטת שיקגו לתמיכה ולשמירה על מיקרוסקופ האור הסריג. עבודה זו נתמכת על ידי NIH חדש המייצרת פרס 1DP2AI144245 ו NSF קריירה פרס 1653782 (כדי J.H.). התוכנית למלגות בוגרת NSF מקיימת בתמיכת ג'יי. פי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659	For T cell harvest
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	For T cell culture
5 mm round coverslips	World Precision Instruments	502040	For Imaging
70um Sterile Cell Strainer	Corning	7201431	For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody	BioLegend	109215	For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)	X&Y Cell Culture	FBS-500	For T cell culture
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	F6377	For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres	Thermo Fisher Scientific	F8810	For microscope alignment
Imaris	Bitplane	N/A	Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope	3i	N/A	Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	21083027	For Imaging
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-081	For T cell culture
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Custom Synthesis	For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin	Life Technologies	15140122_3683884612	For T cell culture
Poly-L-Lysine	Phenix Research Products	P8920-100ML	For Imaging
RBC Lysis Buffer	eBioscience	00-4300-54	For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	For T cell culture
RPMI 1640 Medium	Corning	MT10040CV	For T cell culture
Slidebook	3i	N/A	LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools	Nova-Tech International	DSET10	For T cell harvest
T-25 Flasks	Eppendorf	2231710126	For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits	Thermo Fisher Scientific	44685	For preparing Fab

References

Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 T cell

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: