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요약

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

초록

세포의 신호 및 기능은 표면 수용체의 동적 구조와 상호 작용에 의해 결정됩니다. 진정으로 이 수용체의 구조 기능 관계를 이해하기 위하여는, 우리는 충분한 주분체 해결책을 가진 살아있는 세포 표면에 그(것)들을 구상하고 추적할 필요가 있습니다. 여기에서 우리는 살아있는 세포막에 있는 T 세포 수용체 (TCRs) 4 차원 (4D, 공간 및 시간)를 심상하기 위하여 최근에 개발한 격자 빛 시트 현미경 검사법 (LLSM)를 사용하는 방법을 보여줍니다. T 세포는 적응형 면역 계통의 주요 이펙터 세포 중 하나이며, 여기서 우리는 이러한 세포의 신호및 기능이 TCRs의 역학 및 상호작용에 의해 구동된다는 것을 보여주기 위해 T 세포를 예로사용하였다. LLSM은 전례 없는 시공간 해상도로 4D 이미징을 가능하게 합니다. 이 현미경 기술은 그러므로 생물학에 있는 다른 세포의 표면 또는 세포내 분자의 넓은 배열에 일반적으로 적용될 수 있습니다.

서문

3차원 세포 표면에서 실시간으로 트래피킹하고 확산되는 분자의 정확한 역학은 해결해야 할 수수께끼였습니다. 현미경 검사법은 항상 속도, 감도 및 해상도의 균형이었습니다. 하나 또는 두 개가 최대화되면 세 번째가 최소화됩니다. 따라서 표면 수용체가 이동하는 작은 크기와 엄청난 속도로 인해 역학을 추적하는 것은 세포 생물학 분야의 주요 기술적 과제로 남아 있습니다. 예를 들어, 많은 연구는 전체 내부 반사 형광을 사용하여 실시되었습니다 (TIRF) 현미경 검사법1,2,3,이는 높은 측두력을 가지고 있지만, T 세포 막의 매우 얇은 조각을 이미지 할 수 있습니다 (~ 100 nm), 따라서 세포에서 멀리 일어나는 이벤트를 놓친다. 이러한 TIRF 이미지는 또한 세포의 2차원 섹션만을 보여준다. 이와 대조적으로, 경질 광학 재건 현미경 검사법(STORM)4,광활성화 국소화 현미경(PALM)5및 자극방출 고갈 현미경(STED)6,빛의 절제 한계를 극복할 수 있는 초고해상도 기술. 이러한 기술은 높은 공간 해상도 (~ 20 nm 해상도)4,5,6,7,그러나 그들은 종종 전체 2 차원 (2D) 또는 3 차원 (3D) 이미지를 취득하는 데 많은 시간이 소요되므로 시간 해상도가 손실됩니다. 또한 깜박이는 신호에 의존하는 STORM 및 PALM과 같은 기술은8,9를계산하는 데 부정확할 수 있습니다. 전자 현미경 검사법은 지금까지 가장 높은 해상도 (최대 50 오후 해상도)10; 그것은 심지어 최대 3 nm XY 및 500 nm Z 해상도11의결과로 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사법 (FIB-SEM)으로 3 차원으로 수행 될 수 있습니다. 그러나, 전자 현미경 검사법의 어떤 양식든지 가혹한 견본 준비를 요구하고 고정형 세포 또는 조직으로만, 시간이 지남에 따라 화상 진찰 살아있는 견본의 가능성을 제거하.

그들의 진정한 생리학적 3D 성질에서 살아있는 세포에서 표면 및 세포내 분자의 역학을 식별하는 데 필요한 높은 시공간적 분해능을 얻는 기술은 최근에 개발되고 있다. 이러한 기술 중 하나는 격자 빛 시트 현미경 검사법 (LLSM)12,이는 크게 광 표백을 낮추기 위해 구조화 된 빛 시트를 활용. 2014년 노벨상 수상자 에릭 베치그(Eric Betzig)가 개발한 높은 축 해상도, 낮은 광표백 및 배경 잡음, 그리고 시야당 수백 개의 평면을 동시에 이미지화할 수 있는 능력은 LLS 현미경을 광시야, TIRF 및 공초점 현미경12,13,14,15,16,18,18, 19보다우수하게 만듭니다. 이 4차원(x, y, z 및 시간) 이미징 기술은 여전히 회절 제한(~200 nm XYZ 해상도)을 유지하면서 놀라운 시간 해상도(약 100fps의 프레임 속도를 달성하여 프레임당 0.85초로 3D 재구성셀 이미지를 생성함)를 가지고 있습니다.

LLSM은 일반적으로 단일 분자 및 단일 세포 수준에서 임의의 세포 내의 임의의 분자의 실시간 역학을 추적하는 데 사용될 수 있으며, 특히 면역 세포와 같은 매우 운동성 세포에서 그. 예를 들어, 우리는 T 세포 수용체 (TCR) 역학을 시각화하기 위해 LLSM을 사용하는 방법을 여기에 보여줍니다. T 세포는 적응형 면역 계통의 이펙터 세포이다. TRS는 T 세포의 선택, 발달, 분화, 운명 및 기능을 결정하는 항원 제시 세포(APC)의 표면에 표시되는 펩티드-MHC(pMHC) 리간드를 인식하는 책임이 있다. 이 인식은 T 세포와 APC 사이의 인터페이스에서 발생, 면역 시냅스라고 불리는 것을 형성하기 위해 국지적 인 수용체 클러스터링의 결과. 면역 학적 시냅스에서 TCR이 T 세포 이펙터 기능에 필수적이라고 알려져 있지만, 아직 알려지지 않은 시냅스로 실시간 TCR 인신 매매의 기본 메커니즘은 알 수 없습니다. LLSM은 결과 pMHC-TCR 상호 작용으로 시냅스로 인신 매매 전후의 TCR의 역학을 실시간으로 시각화할 수 있게 해 주었으며(그림1). 따라서 LLSM은 TCRs의 조형 역학에 대한 현재의 질문을 해결하고 세포가 자기 항원과 외국 항원을 구별하는 방법을 이해하는 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

5C. B10에서 C7 TCR 형질전환 RAG2 녹아웃 마우스. 배경은 시카고 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라이 연구에서 사용되었다.

1. 수확 및 T 세포 활성화

참고: 프로토콜의 이 부분은 이전 프로토콜을 기반으로 합니다. 자세한 내용은 인용을 참조하십시오20,21.

  1. 10-12 주 된 5C를 안락사. 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 어느 성별(~20-25 g)의 C7 형질전환 마우스(즉,CO2 챔버 뒤에 자궁 경부 탈구).
  2. 70% 에탄올로 마우스 시체를 철저히 스프레이하여 모피를 흡수하고 BSL-2 안전 캐비닛에 넣습니다.
  3. 마우스를 오른쪽으로 돌리고 수술용 가위로 신체 구멍에 작은 절개를 합니다. 수술 집게를 사용하여 비장을 제거합니다. 수술 가위로 필요에 따라 결합 조직을 잘라냅니다.
  4. 비장을 70 μm-모공 메쉬 셀 스트레이너에 넣고 1 mL 주사기 플런저 뒷면으로 으깬다. 완전한 RPMI (RPMI와 10 % 태아 소 혈청 [FBS], 2 mM L-글루타민, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 50 μM 2-메르카포에탄올)로 여과기를 철저히 씻어.
  5. 비장의 단일 세포 현탁액을 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리.
    참고: 이 시점에서 펠릿은 빨간색으로 표시됩니다.
  6. 5 mL RBC 포염 버퍼에서 비장 세포를 다시 중단하십시오. 5 분 동안 인큐베이션 한 다음 완전한 RPMI 5 mL로 담금질하십시오.
  7. 비장의 단일 세포 현탁액을 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리.
    참고: 이 시점에서 펠릿은 빨간색이 아닌 흰색이어야 합니다.
  8. 완전한 RPMI의 5 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
  9. T-25 플라스크로 옮기고 10 μM 나방 시토크롬-C(MCC, 서열 ANERADLIAYLKQATK)를 추가한다. 세포를 37°C, 5%CO2에서 밤새 세포 배양 인큐베이터에 넣는다.
  10. 다음날, 재조합 마우스 IL-2를 최종 농도 100 U/mL에 추가합니다.
  11. 다음 날을 관찰하면서 현재 미디어가 노란색으로 변할 때 새 미디어를 추가합니다. T 세포는 48 시간 이상 동안 방치된 노란색 매체에 방치하면 죽을 것입니다.

2. 세포 준비

  1. 10 분 동안 0.1 % 폴리 - L-리신으로 5mm 둥근 커버립을 인큐베이트.
  2. 밀도 구배 시약(재료 표참조)을 사용하여 죽은 세포를 분리하고 1 x 106 T 셀과 1 x 106 APC(CH27 셀21,22시 순환 성 mCherry로 변환)를 별도로 얻습니다.
    참고 : 세포는 혈세포계를 사용하여 계산됩니다.
    1. 15 mL 원엽 튜브에 밀도 그라데이션 시약 3 mL를 추가하고 튜브 가장자리에 셀을 조심스럽게 추가합니다. 혼합하지 마십시오. 원심분리기930 x g에서 4°C에서 10분 동안; 가속/감속: SLOW/SLOW를 사용합니다. 전체 매체와 밀도 그라데이션 시약 사이의 얇은 중간 층을 조심스럽게 제거하여 각 세포 유형을 별도의 원엽 튜브에 넣습니다.
      참고 : 우리는 50 %가 프로세스 동안 평균적으로 손실되는 것을 발견으로, 이미징에 필요한 것보다 더 많은 세포를 준비 할 필요가있다. 공정에 사용되는 셀이 많을수록 밀도 구배에서 쉽게 수확할 수 있습니다. 우리는 과잉 세포를 지키기 위하여 두 세포 모형의 4-8 mL를 이용합니다. 원하는 경우 이 단계 전에 셀을 계산하여 필요한 볼륨을 보장할 수 있습니다. 여분의 세포는 각각의 플라스크에 다시 넣습니다.
    2. 5 mL 완전한 RPMI (5 분 동안 300 x g)로 T 세포와 CH27 세포의 두 튜브를 세 번 씻으십시오. 세척 하는 동안 매번 상급을 버리십시오. 1 mL 완전한 RPMI에 있는 각 관을 다시 중단하고 혈세포계에 의하여 세포를 계수하십시오.
  3. 500 μL 완료 RPMI에서 1 x 106 APC를 다시 중단하고 10 μM MCC를 추가합니다. 37 °C에서 3 시간 동안 배양, 5 %CO2. 500 μL 완전한 RPMI로 세포를 세 번 세척하십시오 (5 분 동안 300 x g). 상급자를 버리십시오.
  4. 500 μL 완전 RPMI에서 1 x 106 T 세포를 다시 중단하십시오. 세포의 500 μL에 안티 TCRβ Alexa488-표지 된 팹 (클론 H57)의 2 μg를 추가합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양, 5 %CO2. 전체 RPMI 500 μL로 세포를 세 번 세척하십시오 (5 분 동안 300 x g). 씻을 때마다 상급제를 버리십시오.
    참고: Divalent 항-TCR 항체는 Divalent 항체에 의해 T 세포 수용체를 가교하는 것을 피하기 위해 Fab 제제 키트(재료표참조)를 사용하여 단원파로 절단하였다(이 단계는 선택사항).
  5. 이미징 배지 500 μL에서 두 세포 유형을 다시 중단하십시오 (페놀 무첨가 라이보비츠의 L-15 배지와 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민).

3. LLSM 일일 정렬 수행

참고: (중요) 이 정렬 프로토콜은 사용된 LLSM 계측기를 기반으로 합니다(재료 표참조). 각 LLSM은 다를 수 있으며 다른 정렬 전략이 필요합니다, 특히 집에서 지어진 전략. 적절한 루틴 정렬을 수행하고 섹션 4를 계속합니다.

  1. LLSM 욕조(~10mL 부피)에 10mL의 물과 30μl 플루오레세인(1mg/mL 스톡)을 추가하고 이미지(Home)를 눌러 이미지를 이미지 위치로 이동하고 단일 Bessel 레이저 빔 패턴을 살펴봅니다. 가이드와 미리 설정된 관심 영역(ROI)을 사용하여 레이저 빔을 정렬하여 빔이 모든 방향으로 균형 잡힌 얇은 패턴을 만듭니다.
    1. 빔은 파인더 카메라에도 초점을 맞추어 야 합니다. 두 개의 미러 틸트 조절기, 상단 마이크로미터, 초점 및 방출 목표 칼라를 사용하여 조정합니다. 올바르게 정렬된 빔은 그림 2A, B를 참조하십시오.
  2. 적어도 200 mL의 물로 목욕과 목표를 씻어 불소를 완전히 제거하십시오.
  3. 이미징 미디어의 이미지 표준 형광 비드(폴리-L-리신이 있는 5mm 커버슬립에 구슬을 고수하여 제조됨, 재료 표참조; 이것은 이미징 미디어에서 물리적 포인트 확산 기능(PSF)에 대해 미리 준비되고 재사용될 수 있다.
    참고: 나중에 처리하기 위해 보기에 하나의 비드만 있을 수 있으므로 뷰어에서 단독으로 사용하거나 쉽게 잘라서 단일 비드를 얻을 수 있는 비드를 찾아보십시오.
    1. 'X 갈보 범위' 상자에서 3으로 설정하여 디더를 켭니다. 라이브를 눌러 현재 필드를 봅니다. Z 방향을 따라 이동하여 커버 슬립과 구슬을 찾습니다. Z를 따라 이동하여 비드의 중심을 찾아, 레이저를 일시 중지 중지 를 누릅니다. 3D,프레스 센터를 확인한 다음 실행을누릅니다. 이렇게 하면 데이터가 수집됩니다.
    2. 틸트 미러, 대물 칼라 및 초점 마이크로미터를 가장 높은 회색 값으로 수동으로 조정한 다음 필요에 따라 조정하여 목표 스캔, z galvo, z+목표(totPSF) 및 샘플 스캔(samplePSF) 캡처 모드에 적합한 패턴을 얻습니다. 적절하게 조정된 최대 강도 투영(MiMP)은 그림 2C-F를 참조하십시오.
      참고: 다양한 캡처 모드(대물 스캔, z galvo, z+대물, 샘플 스캔)는 라이트 시트가 샘플을 통과하는 방식을 변경합니다. 모든 스캔 모드는 정렬에 사용해야 합니다.
    3. 샘플 검색은 실험 중에 데이터가 수집되는 방법을 보여 주며, 샘플 스캔 모드에서 실행을 눌러 샘플 PSF를 수집하여 디스칭 및 데선볼루션을 수행합니다(섹션 5 참조). 레이저를 세 가지 색상 모드(488, 560, 647)로 변경하고 실행을 다시 누릅니다.
      참고: LLSM 이미지가 각도(57.2°)이기 때문에 "샘플 스캔" 모드에서 캡처된 이미지는 이 각도로 수집되므로 "기울어지며" 됩니다. 비뚤어지는 것은 이 각도를 보정하고 이미지를 실제 z 스택에 "다시 정렬"하는 프로세스입니다. 이러한 데이터는 이미징 미디어및 실험 중에 이미지화될 모든 채널에서 수집되어야 합니다. 제대로 수집되지 않으면 데이터가 제대로 왜곡되지 않습니다. 마찬가지로, 매체가 37°C(또는 원하는 실험 온도)로 따뜻해졌는지 확인하십시오.

4. LLSM으로 셀 설정

  1. 2.5단계에서 2.5단계에서 5mm 직경의 원형 커버슬립에 100,000APC(50 μL)를 추가하고 10분 동안 정착할 수 있도록 합니다.
  2. 샘플 홀더에 기름을 바르고 커버슬립 셀을 옆으로 위로 추가합니다. 욕조에 놓기 전에 거품을 피하기 위해 커버 슬립 뒷면에 이미징 용지 한 방울을 추가합니다. 샘플 홀더를 압전선에 끼고 이미지(홈)를누릅니다.
  3. LLSM 및 이미징 소프트웨어(재료 표참조)가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 이미지에 대한 APC를 찾습니다.
    참고: 60z-steps 및 10 ms 노출로 0.4 μm 스텝 크기로 2가지 색상으로 촬영한 경우 디더가 3으로 설정되어 있어 3D 이미지 프레임당 1.54초,~200nm XY 및 400 nm Z 해상도로 처리됩니다. 이러한 설정은 사용된 형광 라벨링 기술의 셀 크기, 원하는 z 분해능 및 신호 강도에 따라 조정해야 할 수 있습니다. 레이저 전력 사용량은 사용되는 형광 라벨링 기술에 따라 달라집니다.
    1. 라이브를 눌러 현재 이미지를 봅니다. Z를 따라 이동하여 커버 슬립과 셀을 찾습니다.
    2. Z 방향으로 이동하여 APC의 중심을 찾은 다음 중지를 눌러 레이저를 일시 중지합니다. 3D를 확인하고 원하는 설정(4.3.1 단계 참조)을 입력한 다음 센터를 누릅니다. 이렇게 하면 데이터가 수집됩니다.
  4. 스테이지를 낮추고 이미징 미디어(2.5단계에서 100,000셀)에 50 μL의 T 셀을 커버슬립 위에 직접 놓습니다. 파이펫 팁 끝에 드롭 폼을 한 다음 욕조 액체에 팁을 터치하는 것이 가장 좋습니다. "이미지(리턴)"를클릭하여 스테이지를 다시 올립니다.
  5. 이미징을 시작합니다. 원하는 스택 크기와 시간 경과 길이를 설정해야 합니다. 예를 들어, 0.4 μm 스텝 크기와 입력 500시간 프레임에서 이미지 60 z-스택. (일반적으로) 광표백을 피하기 위해 500 프레임에 도달하기 전에 녹화를 중지합니다. 라이브 모드를 사용하여 셀 쌍을 검색하고 준비 및 원하는 설정이 입력되면 실행을 눌러 데이터를 수집합니다. 예제는 동영상 1 및 그림 1을 참조하십시오.

5. 트랙 표면 역학

  1. 이미징 소프트웨어에서 데이터를 내보냅니다(재료 표참조). 이렇게 하면 각 색상의 모든 시간 지점에 대해 z-스택 TIF 파일이 생성됩니다.
  2. 먼저 데이터를 삭제하고 데선볼을 합니다.
    참고: HHMI의 Janelia Research Campus18의라이선스하에 LLSpy 파이프라인을 사용하지만, 여러 이미징 소프트웨어 내에서도 비뚤어지고 감소할 수 있습니다(자료 표참조).
  3. 데이터를 표백합니다.
    참고 : 우리는 히스토그램 일치와 피지의 표백 기능을 사용 (피지 통로 : 이미지 | 조정 | 표백 보정 | 히스토그램 매칭 | 확인)을참조하십시오.
  4. 추적 소프트웨어로 가져옵니다(재질 표참조). 소프트웨어 사양에 따라 클러스터를 추적합니다. 예제는 동영상 2를 참조하십시오.
    참고 : 추적 결과는 사용되는 추적 소프트웨어, 선택한 알고리즘, 선택한 원하는 출력 매개 변수 등에 따라 달라집니다. 예를 들어, 우리가 활용한 추적 소프트웨어(재료 표참조)에서는 TCR 클러스터가 완벽한 구체로 구성되지 않기 때문에 각 피처를 단일 지점으로 할당하는 대신 소프트웨어가 불규칙한 모양을 추적할 수 있도록 허용하기로 결정했습니다. 또한 속도, 방향, 볼륨, 강도, 면적, 위치 및 트랙 지속 시간 정보를 포함한 35개의 매개변수를 수집하기로 결정했습니다. 그러나 다른 방법이나 매개 변수는 다른 질문에 대답하는 데 도움이 될 것입니다.
    1. 추적을 원하지 않는 경우 하이퍼스택 데이터에서 동영상을 시각화하고 만들기 위해 피지용 ClearVolume 플러그인을 사용하십시오.

결과

여기서, 우리는 1차 마우스 5C의 분리, 준비 및 이미징에 대해 설명한다. 격자 광 시트 현미경을 사용하여 C7 T 세포. 섹션 3 동안, 현미경을 올바르게 정렬하고 수집 후 데이터를 디선볼로 하는 매일 PSF를 수집하는 것이 필수적입니다. 그림 2에서는현미경을 정렬할 때 볼 수 있는 올바른 정렬 이미지를 보여 준다. 그림 2A 및 도 ...

토론

제시된 프로토콜은 5C로부터 단리된CD4+ T 세포의 사용을 위해 최적화되었다. LLSM 계측기상 C7 형질전환 마우스가 사용되고, 따라서 다른 세포 시스템 및 LLSM은 다르게 최적화되어야 할 수도 있다. 그러나, 이 프로토콜은 생리적 조건에서 최소한의 왜곡으로 전체 세포에 표면 수용체의 역학을 정량화하는 데 사용될 수 있기 때문에 4D 이미징의 힘을 보여줍니다. 따라서 이 기술의 향후 응용 프...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

우리는 시카고 대학의 비타스 빈도카 박사의 조언과 지도를 인정하고 싶습니다. 우리는 격자 광 시트 현미경을 지원하고 유지에 대한 시카고 대학의 통합 빛 현미경 코어 시설에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 뉴 이노베이터 어워드 1DP2AI14245 및 NSF 커리어 어워드 1653782(J.H.)에 의해 지원되었습니다. J.R.은 NSF 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SyringeBD309659For T cell harvest
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148-25MLFor T cell culture
5 mm round coverslipsWorld Precision Instruments502040For Imaging
70um Sterile Cell StrainerCorning7201431For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain AntibodyBioLegend109215For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)X&Y Cell CultureFBS-500For T cell culture
FicollGE Healthcare17-1440-02Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium saltSigma-AldrichF6377For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified MicrospheresThermo Fisher ScientificF8810For microscope alignment
ImarisBitplaneN/ATracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope3iN/AMicroscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Fisher Scientific21083027For Imaging
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030-081For T cell culture
LLSpyJanelia Research CampusN/ALLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATKElimbioCustom SynthesisFor T cell harvest
Penacillin/StreptamycinLife Technologies15140122_3683884612For T cell culture
Poly-L-LysinePhenix Research ProductsP8920-100MLFor Imaging
RBC Lysis BuffereBioscience00-4300-54For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2Sigma-AldrichI0523For T cell culture
RPMI 1640 MediumCorningMT10040CVFor T cell culture
Slidebook3iN/ALLSM imaging software
Surgical Dissection ToolsNova-Tech InternationalDSET10For T cell harvest
T-25 FlasksEppendorf2231710126For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation KitsThermo Fisher Scientific44685For preparing Fab

참고문헌

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