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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet per visualizzare in modo quadridimensionale le dinamiche del recettore superficiale nelle cellule vive. Qui vengono mostrati i recettori delle cellule T su CD4- cellule T primarie.

Abstract

La segnalazione e la funzione di una cellula sono dettate dalle strutture dinamiche e dalle interazioni dei suoi recettori superficiali. Per comprendere veramente la relazione struttura-funzione di questi recettori in situ, dobbiamo visualizzarli e tracciarli sulla superficie della cellula viva con una risoluzione spatiotemporale sufficiente. Qui mostriamo come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet (LLSM) recentemente sviluppata per immagini di recettori delle cellule T (TCR) in quarta dimensione (4D, spazio e tempo) alla membrana cellulare attiva. Le cellule T sono una delle principali cellule efcomeotrici del sistema immunitario adattivo, e qui abbiamo usato le cellule T come esempio per dimostrare che la segnalazione e la funzione di queste cellule sono guidate dalle dinamiche e dalle interazioni dei TCR. LLSM consente l'imaging 4D con una risoluzione spatiotemporale senza precedenti. Questa tecnica di microscopia può quindi essere generalmente applicata a una vasta gamma di molecole superficiali o intracellulari di cellule diverse in biologia.

Introduzione

La dinamica precisa del traffico e della diffazione delle molecole sulla superficie cellulare tridimensionale in tempo reale è stata un enigma da risolvere. La microscopia è sempre stata un equilibrio di velocità, sensibilità e risoluzione; se uno o due sono ingranditi, il terzo viene ridotto a icona. Pertanto, a causa delle piccole dimensioni e dell'immensa velocità con cui i recettori di superficie si muovono, il monitoraggio delle loro dinamiche è rimasto una grande sfida tecnologica per il campo della biologia cellulare. Ad esempio, molti studi sono stati condotti utilizzando la microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF)1,2,3, che ha un'alta risoluzione temporale, ma può solo immaginare una fetta molto sottile della membrana a T-cell (100 nm), e quindi manca eventi che accadono più lontano nella cella. Queste immagini TIRF mostrano anche solo una sezione bidimensionale della cella. Al contrario, le tecniche di super-risoluzione, come la microscopia stocastica della ricostruzione ottica (STORM)4, la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)5e la microscopia stimolata all'esaurimento delle emissioni (STED)6,possono superare il limite di diffrazione di Abbe della luce. Queste tecniche hanno un'elevata risoluzione spaziale (risoluzione di 20 nm)4,5,6,7, ma spesso richiedono molti minuti per acquisire un'immagine bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) completa e pertanto la risoluzione temporale viene persa. Inoltre, tecniche come STORM e PALM che si basano su segnali lampeggianti possono avere imprecisioni nel conteggio8,9. La microscopia elettronica ha di gran lunga la risoluzione più alta (fino a risoluzione fino alle 17)10; può anche essere condotta tridimensionalmente con la microscopia elettronica a scansione del fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), con conseguente fino a 3 nm XY e 500 nm - risoluzione11. Tuttavia, qualsiasi forma di microscopia elettronica richiede una dura preparazione dei campioni e può essere condotta solo con cellule o tessuti fissi, eliminando la possibilità di imaging di campioni vivi nel tempo.

Le tecniche per ottenere l'alta risoluzione spatiotemporale necessaria per identificare la dinamica delle molecole superficiali e intracellulari nelle cellule vive nella loro vera natura 3D fisiologica sono state sviluppate solo di recente. Una di queste tecniche è Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, che utilizza un foglio luminoso strutturato per ridurre drasticamente il fotobleaching. Sviluppato nel 2014 dal premio Nobel Eric Betzig, l'alta risoluzione assiale, il basso fotosbiancamento e il rumore di fondo, e la capacità di visualizzare contemporaneamente centinaia di piani per campo visivo rendono i microscopi LLS superiori ai microscopi widefield, TIRF e confocal e confocal e confocal12,13,14,15,16,17,18. Questa tecnica di imaging quadridimensionale (x, y, z e time), mentre ancora la diffrazione limitata (risoluzione XYz da 200 nm) ha un'incredibile risoluzione temporale (abbiamo raggiunto una frequenza fotogrammi di circa 100 fps, con un'immagine cellulare ricostruita 3D con 0,85 secondi per fotogramma) per l'acquisizione spaziale 3D.

Il LLSM può essere generalmente utilizzato per monitorare la dinamica in tempo reale di qualsiasi molecola all'interno di qualsiasi cellula a livello di singola molecola e singola cellula, in particolare quelle nelle cellule altamente motili come le cellule immunitarie. Ad esempio, qui mostriamo come utilizzare LLSM per visualizzare le dinamiche del recettore delle cellule T (TCR). Le cellule T sono le cellule efsiate del sistema immunitario adattivo. I TCR sono responsabili del riconoscimento dei ligandi peptide-MHC (pMHC) visualizzati sulla superficie delle cellule che presentano l'antigene (APC), che determina la selezione, lo sviluppo, la differenziazione, il destino e la funzione di una cellula T. Questo riconoscimento si verifica nell'interfaccia tra le cellule T e gli APC, con conseguente clustering del recettore localizzato per formare quella che viene chiamata sinapsi immunologica. Mentre è noto che i TCR nella sinapsi immunologica sono imperativi per la funzione dell'effettore delle cellule T, ancora sconosciuti sono i meccanismi sottostanti del traffico di TCR in tempo reale verso la sinapsi. LLSM ci ha permesso di visualizzare in tempo reale le dinamiche dei TCR prima e dopo il traffico verso la sinapsi con la conseguente interazione pMHC-TCR (Figura 1). Il LLSM può quindi essere utilizzato per risolvere le attuali questioni delle dinamiche formative delle TCR e fornire informazioni per capire come una cellula distingue tra antigeni auto ed estranei.

Protocollo

5C. C7-transgenico TOpo rag2 knockout in B10. Uno sfondo è stato utilizzato in questo studio secondo un protocollo approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Chicago.

1. Raccogliere e attivare le cellule T

NOTA: questa parte del protocollo si basa su protocolli precedenti. Vedere citazioni per ulteriori dettagli20,21.

  1. Eutanasia un 5C di 10-12 settimane. C7 topo transgenico di entrambi i sessi (20-25 g) secondo il protocollo Approvato IACUC (cioè la camera CO2 seguita dalla lussazione cervicale).
  2. Spruzzare accuratamente la carcassa per mouse con 70% di etanolo per immergere la pelliccia e portare in un armadietto di sicurezza BSL-2.
  3. Girare il mouse sul suo lato destro e fare una piccola incisione nella cavità del corpo con forbici chirurgiche. Rimuovere la milza con le pinze chirurgiche. Tagliare il tessuto connettivo in base alle esigenze con le forbici chirurgiche.
  4. Mettere la milza in un colino a rete di 70 m e schiacciare con la parte posteriore di uno stantuffo di siringa da 1 mL. Lavare accuratamente attraverso il colino con RPMI completo (RPMI con 10% siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamina, 1% penicillina/streptomicina, 50M 2-mercaptoetanolo).
  5. Centrifugare la sospensione a singola cellula di splenociti a 300 x g per 5 min.
    NOTA: il pellet a questo punto sarà rosso.
  6. Risospendere la splenocites nel buffer di lisi RBC da 5 mL. Incubare per 5 min, quindi quench con 5 mL di RPMI completo.
  7. Centrifugare la sospensione a singola cellula di splenociti a 300 x g per 5 min.
    NOTA: Il pellet a questo punto deve essere bianco, non rosso.
  8. Risospendere il pellet in 5 mL di RPMI completo.
  9. Trasferire su un pallone T-25 e aggiungere 10 m di falena citocromatica-C (MCC, sequenza ANERADLIAYLKQATK). Mettere le cellule in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 durante la notte.
  10. Il giorno successivo, aggiungere il mouse ricombinante IL-2 ad una concentrazione finale di 100 U/mL.
  11. Osservare per i giorni successivi, aggiungendo supporti freschi come il supporto corrente diventa giallo. Le cellule T moriranno se lasciate in modalità mediagista incustodita per oltre 48 h. Le cellule sono pronte per essere utilizzate 6-10 giorni dopo il raccolto.

2. Preparare le cellule

  1. Incubare cerchi rotondi rotondi da 5 mm con 0,1% poli-L-lisina per 10 min. Aspirate off e lasciare asciugare naturalmente.
  2. Utilizzare un reagente a gradiente di densità (vedere la tabella dei materiali) per separare le cellule morte e ottenere 1 x 106 cellule T e 1 x 106 APC (cellule CH2721,22 trasdotte con citosolico mCherry) separatamente.
    NOTA: le celle vengono conteggiate utilizzando un emocitometro.
    1. Aggiungere 3 mL di reagente a gradiente di densità a un tubo conico da 15 mL e aggiungere le celle dropwise al bordo del tubo con attenzione. Non mescolare. Centrifuga a 930 x g per 10 min a 4 gradi centigradi; utilizzare l'accelerazione/decelerazione: SLOW/SLOW. Rimuovere attentamente il sottile strato intermedio di celle tra il supporto completo e il gradiente di densità, mettendo ogni tipo di cellula in tubi conici separati.
      NOTA: È necessario preparare più cellule del necessario per l'imaging, poiché troviamo che il 50% è perso in media durante il processo. Più cellule vengono utilizzate per il processo, più facile è raccoglierle dal gradiente di densità. Usiamo 4-8 mL di entrambi i tipi di cellule per garantire cellule in eccesso. Se lo si desidera, le celle possono essere conteggiate prima di questo passaggio per garantire il volume necessario. Eventuali cellule aggiuntive vengono reinserite nei rispettivi flaconi.
    2. Lavare entrambi i tubi di cellule T e ch27 cellule tre volte con 5 mL completa RPMI (300 x g per 5 min). Scartare il supernatante ogni volta durante il lavaggio. Risospendere ogni tubo in RPMI completo di 1 mL e contare le cellule di un emocitometro.
  3. Risospendere 1 x 106 APC in 500 - L completa RPMI e aggiungere 10 M MCC. Incubare per 3 h a 37 , 5% CO2. Lavare le cellule tre volte con 500 RPMI completi (300 x g per 5 min). Scartate i superalatari.
  4. Risospendere 1 x 106 cellule T in 500 RPMI completi. Aggiungere 2 g di Fab (clone H57) con etichetta anti-TCR- Alexa488 a 500 -L di cellule. Incubare per 30 min a 37 , 5% CO2. Lavare le cellule tre volte con 500 - L di RPMI completo (300 x g per 5 min). Scartare supernatante dopo ogni lavaggio.
    NOTA: L'anticorpo anti-TCR divalente è stato tagliato in Fab monovalente utilizzando un kit di preparazione Fab (vedi la tabella dei materiali) per evitare di collegare i recettori delle cellule T dall'anticorpo divalente (questo passaggio è facoltativo).
  5. Risogli entrambi i tipi di cellule in 500 litri di mezzi di imaging (mezzo L-15 di Leibovitz privo di rosso fenolo con 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina, 2 mM L-glutamine).

3. Condurre l'allineamento giornaliero DI LLSM

NOTA: (Importante) Questo protocollo di allineamento si basa sullo strumento LLSM utilizzato (vedere la Tabella dei materiali). Ogni LLSM può essere diverso e richiedono diverse strategie di allineamento, in particolare quelle che sono costruite in casa. Eseguire l'allineamento di routine appropriato e continuare fino alla sezione 4.

  1. Aggiungere 10 mL di acqua più 30 fluoresceina (1 stock di mg/mL) al bagno LLSM (volume di 10 mL), premere Immagine (Home) per spostare l'obiettivo nella posizione dell'immagine e osservare un singolo modello di fascio laser di Bessel. Allineare il raggio laser utilizzando le guide e la regione di interesse (ROI) preimpostata per rendere il fascio un modello sottile bilanciato in tutte le direzioni.
    1. Il fascio dovrebbe anche apparire focalizzato nella fotocamera finder. Utilizzare due regolatori di inclinazione dello specchio, micrometro superiore, messa a fuoco e collare obiettivo di emissione per regolare. Vedere la figura 2A,B per la trave correttamente allineata.
  2. Lavare il bagno e gli obiettivi con almeno 200 mL di acqua per rimuovere completamente la fluoresceina.
  3. Immagine standard perline fluorescenti nel supporto di imaging (preparate aderenti a un coperchio di 5 mm con poli-L-lysina, vedi la Tabella dei Materiali; questo può essere pre-preparato e riutilizzato) per la funzione di diffusione del punto fisico (PSF) nei supporti di imaging.
    NOTA: Ci può essere solo un tallone in vista per l'elaborazione successiva, in modo da cercare di trovare un tallone che è da solo nel visore o può essere facilmente ritagliato per ottenere un singolo tallone.
    1. Attivare il dither impostando su 3 nella casella 'Gamma X Galvo'. Premere Live per visualizzare il campo corrente. Spostarsi lungo la direzione di z per trovare la ricevuta di copertura e perline. Trovare il centro di un tallone muovendosi lungo il tasto , premere Stop per mettere in pausa il laser. Controllare 3D, premere Centro e quindi Premere Esegui. In questo modo i dati verranno raccolti.
    2. Regolare manualmente lo specchio di inclinazione, il collare obiettivo e il micrometro di messa a fuoco per ottenere i valori di grigio più elevati, quindi regolare in base alle esigenze per ottenere modelli appropriati per la scansione oggettiva, z galvo, z-obiettivo (totPSF) e le modalità di scansione campione (samplePSF). Vedere la figura 2C-F per le proiezioni di intensità massima (MIP) regolate correttamente.
      NOTA: le varie modalità di acquisizione (scansione obiettiva, z galvo, z-obiettivo e scansione campione) modificano il modo in cui il foglio luminoso si sposta attraverso il campione. Tutte le modalità di scansione devono essere utilizzate per l'allineamento.
    3. L'analisi di esempio mostra come verranno raccolti i dati durante l'esperimento. Raccogliere il PSF di esempio premendo Esegui in modalità di scansione di esempio per la messa in scrivania e la deconvoluzione (vedere la sezione 5). Cambia laser in modalità a tre colori (488, 560, 647) e premi di nuovo Esegui.
      NOTA: Dal momento che le immagini LLSM ad angolo (57,2 gradi), le immagini catturate in modalità "scansione del campione" vengono raccolte a questo angolo e sono quindi "inclinate". L'inclinazione è il processo di correzione di questo angolo e "riallineamento" dell'immagine in un vero e proprio z-stack. Questi dati devono essere raccolti nei supporti di imaging e in tutti i canali che verranno immagini durante l'esperimento. Se questo non viene raccolto correttamente, i dati non saranno correttamente disfaldati. Allo stesso modo, assicurarsi che i supporti siano stati riscaldati a 37 gradi centigradi (o temperatura sperimentale desiderata).

4. Impostazione delle celle con LLSM

  1. Aggiungere 100.000 APC (50 gradi centigradi) dal passo 2.5 a una vetritta circolare di 5 mm di diametro dal punto 2.1 e lasciare che si accontentino di 10 min.
  2. Ungere il supporto del campione, quindi aggiungervi il lato cella del coperchio. Aggiungere una goccia di supporto di imaging sul retro del coperchio per evitare bolle prima di essere inserita nella vasca da bagno. Avvitare il supporto del campione sul piezo e premere Immagine (Home).
  3. Trovare un APC per l'immagine per assicurarsi che il LLSM e il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) funzionino correttamente.
    NOTA: L'immagine è pari a 0,4 m con una dimensione di 60 z e 10 ms per due colori con dither impostato su 3, che genera 1,54 s per fotogramma di immagine 3D con una risoluzione di 200 nm XY e 400 nm. Queste impostazioni potrebbero dover essere regolate in base alle dimensioni della cella, alla risoluzione z desiderata e alla potenza del segnale dalla tecnica di etichettatura fluorescente utilizzata. L'utilizzo della potenza laser varia anche in base alla tecnica di etichettatura fluorescente utilizzata.
    1. Premere Live per visualizzare l'immagine corrente. Spostarsi lungo il coperchio per trovare lo slittamento di copertura e le celle.
    2. Trova il centro di un APC muovendoti nella direzione z, quindi premi Stop per mettere in pausa il laser. Controllare il 3D e immettere le impostazioni desiderate (vedere il passaggio 4.3.1), premere Center e quindi premere Esegui. In questo modo i dati verranno raccolti.
  4. Abbassare lo stage per caricare la posizione e aggiungere 50 celle T in supporti di imaging (100.000 celle, dal punto 2.5) gocciolante direttamente sopra il coperchio. E 'meglio lasciare una forma di goccia all'estremità della punta pipetta e poi toccare la punta al liquido bagno. Alzare il livello facendo clic su "Immagine (ritorno)".
  5. Iniziare l'imaging. Assicurarsi di impostare la dimensione dello stack e la lunghezza della scadenza del tempo desiderata. Ad esempio, l'immagine 60 z-stacks a una dimensione di passo 0,4 m e l'input di 500 intervalli di tempo. (in genere) interrompere la registrazione prima che vengano raggiunti 500 fotogrammi per evitare il fotosbiancamento. Utilizzare la modalità Live per cercare le coppie di celle e, una volta immesse le impostazioni pronte e desiderate, premere Esegui per raccogliere i dati. Vedere il film a clamore 1 e la figura 1 per un esempio.

5. Tracciare le dinamiche di superficie

  1. Esportare i dati dal software di imaging (vedere la Tabella dei materiali). Questo creerà file TIF z-stack per ogni punto temporale in ogni colore.
  2. Prima deskew e deconvolve i dati.
    NOTA: utilizziamo la pipeline LLSpy su licenza del Janelia Research Campus18 diHHMI, ma la messa a punto e la deconvoluzione sono disponibili anche all'interno di più software di imaging (vedere Tabella dei materiali).
  3. Debleach i dati.
    NOTA: Usiamo la funzione debleach delle Fiji con la corrispondenza dell'istogramma (Percorso fiji: Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Correzione della Candeggina Istogrammi corrispondenti OK).
  4. Importare nel software di tracciamento (vedere la Tabella dei materiali). Tenere traccia dei cluster in base alle specifiche del software. Vedere Filmato 2 per un esempio.
    NOTA: i risultati del monitoraggio dipendono dal software di tracciamento utilizzato, dall'algoritmo scelto, dai parametri di output desiderati selezionati, ecc. Ad esempio, nel software di tracciamento che abbiamo utilizzato (vedi la Tabella dei Materiali),abbiamo scelto di consentire al software di tracciare forme irregolari, piuttosto che assegnare a ogni funzione un unico punto, poiché i cluster TCR non sono organizzati in sfere perfette. Inoltre, abbiamo scelto di raccogliere 35 parametri, tra cui velocità, direzione, volume, intensità, area, posizione e informazioni sulla durata della traccia. Tuttavia, diversi metodi o parametri saranno utili per rispondere a diverse domande.
    1. Se il monitoraggio non è desiderato, utilizzare il plug-in ClearVolume per Fiji per visualizzare e creare filmati da dati hyperstack.

Risultati

Qui, descriviamo l'isolamento, la preparazione e l'imaging del mouse primario 5C. C7 cellule T utilizzando un microscopio a fogli di luce reticolo. Durante la sezione 3, è imperativo allineare correttamente il microscopio e raccogliere PSF ogni giorno con cui deconvolve i dati dopo la raccolta. Nella Figura 2, vengono mostrate le immagini di allineamento corrette che verranno visualizzate durante l'allineamento del microscopio. Figura 2A e

Discussione

Il protocollo presentato è stato ottimizzato per l'utilizzo di cellule CD4- T isolate da 5C. I topi transgenici C7 sullo strumento LLSM utilizzati, e quindi altri sistemi cellulari e LLSM potrebbero dover essere ottimizzati in modo diverso. Tuttavia, questo protocollo mostra la potenza dell'imaging 4D, in quanto può essere utilizzato per quantificare la dinamica di un recettore superficiale su un'intera cellula con la minima distorsione in condizioni fisiologiche. Pertanto, ci sono molte possibili applicazio...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Vorremmo riconoscere i consigli e la guida del Dr. Vytas Bindokas presso l'Università di Chicago. Ringraziamo l'Integrated Light Microscopy Core Facility dell'Università di Chicago per aver sostenuto e mantenuto il microscopio a fogli luminosi a reticolo. Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e dal NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. è supportato dal NSF Graduate Research Fellowships Program.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SyringeBD309659For T cell harvest
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148-25MLFor T cell culture
5 mm round coverslipsWorld Precision Instruments502040For Imaging
70um Sterile Cell StrainerCorning7201431For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain AntibodyBioLegend109215For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS)X&Y Cell CultureFBS-500For T cell culture
FicollGE Healthcare17-1440-02Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium saltSigma-AldrichF6377For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified MicrospheresThermo Fisher ScientificF8810For microscope alignment
ImarisBitplaneN/ATracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope3iN/AMicroscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Fisher Scientific21083027For Imaging
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030-081For T cell culture
LLSpyJanelia Research CampusN/ALLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATKElimbioCustom SynthesisFor T cell harvest
Penacillin/StreptamycinLife Technologies15140122_3683884612For T cell culture
Poly-L-LysinePhenix Research ProductsP8920-100MLFor Imaging
RBC Lysis BuffereBioscience00-4300-54For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2Sigma-AldrichI0523For T cell culture
RPMI 1640 MediumCorningMT10040CVFor T cell culture
Slidebook3iN/ALLSM imaging software
Surgical Dissection ToolsNova-Tech InternationalDSET10For T cell harvest
T-25 FlasksEppendorf2231710126For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation KitsThermo Fisher Scientific44685For preparing Fab

Riferimenti

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