大肠杆菌中异构表达对膜迁移者的特性与膜囊泡的产生

摘要

我们描述了一种在大肠杆菌中的异质表达和利用法国印刷机对细胞进行分理的膜囊泡制剂中质子驱动膜输送剂的表征方法。

摘要

已经开发出几种方法，以在功能上表征新型膜输送机。多胺在所有生物体中普遍存在，但植物中的多胺交换剂尚未确定。在这里，我们概述了一种使用从大肠杆菌细胞的解毒中产生膜囊泡来描述多胺抗结剂的方法，这种细胞异构体表达植物抗结剂。首先，我们在缺乏多胺和精氨酸交换输送机的大肠杆菌菌株中异构地表示AtBAT1。囊泡是使用法国印刷机生产的，通过超离心净化，并用于标记基材的膜过滤测定，以证明输送机的基板特异性。这些测定表明，AtBAT1是精氨酸、β-氨基丁酸（GABA）、普赖辛和精氨酸的质子介导物。为AtBAT1测定而开发的突变菌株可用于其他植物和动物多胺交换器家族的功能分析。我们还假设，只要这些蛋白质可以在细菌细胞膜中表达，这种方法就可以用来描述许多其他类型的抗剂。大肠杆菌是一种对新型运输者进行表征的良好系统，因为有多种方法可用于诱变性原生运输者。

引言

参与代谢物贩运的蛋白质构成生理调节的基本水平，但绝大多数植物膜转运者尚未具有功能特征。已经实施了几种策略来描述新的运输蛋白。大肠杆菌和真核细胞（如酵母、异体卵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞）中的异体表达都被用来确定其迁移活性^1。真核细胞是真核蛋白表达的宠儿，因为基本的细胞组成、信号转导途径、转录和翻译机与原生条件兼容。

酵母是植物中新型运输蛋白表征的重要模型。第一个植物运输蛋白，成功地表达在酵母（糖霉菌）是六氯苯（HUP1）从小球藻^2。自那时以来，许多植物运输蛋白一直使用酵母表达系统进行功能特征化。其中包括植物糖运输机（SUC1和SUC2 3、VfSUT1和VfSTP1^4）和辅助糖运输机（AUX1和^PIN5）。利用酵母表达植物蛋白的缺点包括，由于酵母缺乏这种细胞器，而蛋白原体局部蛋白的活性受损，靶向错误^，以及由于膜蛋白^7、8、9的过度表达而在酵母中形成错误折叠的聚集体和激活应激反应。

异体表达在异体细胞中的运输蛋白已被广泛用于运输器¹⁰的电生理表征。第一个植物运输蛋白，在Xenopus卵母细胞中使用异体表达为特征的是阿拉伯拟钾通道KAT1¹⁰和阿拉伯拟南芥六角体运输机STP1^11。自那时以来，Xenopus卵母细胞已被应用于许多植物运输蛋白的特征，如血浆膜运输器^12，真空蔗糖运输器SUT4¹³和真空麻黄素运输机ALMT9^14。转移性卵母细胞用于运输测定的一个重要限制是细胞内代谢物的浓度不能纵^{1 。}此外，需要专业知识来准备Xenopus卵母细胞，并且卵母细胞批次的变异性难以控制。

模型有机体大肠杆菌中的异构表达是新植物运输蛋白表征的理想系统。大肠杆菌的分子和生理特征是众所周知的。 分子工具和技术已经建立起来^。此外，不同的表达载体，非致病菌株和突变体可用17，18，19。此外，大肠杆菌具有高生长率，在实验室条件下很容易生长。许多蛋白质在大肠杆菌⁹中易于表达和纯化。当蛋白质不能直接在细胞系统中被测定时，将蛋白质重组成脂质体也是一次成功的创新，尽管对于纯化膜蛋白的表征来说也是一项成功的创新。利用该模型系统^20、21，完成了植物线粒体运输蛋白的功能表征，包括大豆、玉米、水稻和阿拉伯兰多普西的磷酸盐输送剂等溶质运输剂，在阿拉伯拟南芥中实现了二甲苯甲酸酯-三甲苯酯载体的功能特征。然而，在重组实验中发现番茄蛋白SICAT9的重组蛋白不起作用，而CAT运输体家族的其他成员在Xenopus卵母细胞测定²²中被发现无功能。因此，需要额外的分子工具来表征膜输送机。

在大肠杆菌²³中发现了5个多胺运输系统。其中包括两名ABC运输商，负责调解精氨酸和普赖辛的摄入，一个放流剂/苯基交换器，一个尸体/赖氨酸交换器，一个精氨酸出口商和一个放流剂进口商。Putrescine交换器PotE最初使用囊泡测定，其中内向外囊泡由裂化细胞与法国印刷机和测量放射性标记putresin到囊泡的吸收，以换取卵泡^24。囊泡测定也用于表征钙输送机，该因子在质子梯度²⁵的响应下调节钙的传递。这些实验促使我们制定了一种对其他多胺交换器进行表征的策略。我们首先在PotE和CadB交换器中制造了大肠杆菌缺乏菌株。在这里，我们演示了植物多胺抗剂的功能表征，通过修饰后的大肠杆菌菌株中的异质表达、使用法国印刷机生成膜囊泡以及放射性标记检测。

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研究方案

1. 生成具有 P1 转导的大肠杆菌双敲出突变剂

1. 从大肠杆菌遗传存量中心（http://cgsc.biology.yale.edu）获得大肠杆菌单敲除突变菌株[PotE和+CadB]
   注:βPotE菌株耐卡那霉素^26，βCadB菌株抗四环素^27。
2. 使用P1转导协议²⁸构建PotE/CadB双挖空（DKO）应变。
   1. 莱沙制剂
      1. 在新鲜LB（1:100）中稀释一夜之间培养的βPotE，辅以10-25 mM MgCl_2、5mM CaCl₂和0.1-0.2%葡萄糖。
      2. 在37°C生长1-2小时。
      3. 在培养基中加入40μL的P1噬菌体莱酸，并在37°C下继续生长。监控 1-3 小时，直到培养部分被处理
         注:当培养物被分片时，细胞碎片将在管中可见，并且该培养物的浊度会显著丧失。
      4. 在莱沙和涡流中加入几滴氯仿（50-100 μL）。在 12，000 x g下离心 2 分钟，以清除细胞碎片并将上清液转移到新管中。
   2. 转 导
      1. 在LB介质中一夜之间生长-CadB菌株。
      2. 在4000 x g下离心2分钟，在1/5-1/3的新鲜LB中重新悬浮收获的培养体积，辅以100mMMgSO₄和5 mM CaCl_2。
      3. 将μCadB细胞悬浮液加入从步骤1.2.1.4的噬菌体到管中，并迅速混合。
      4. 加入200 μL的1M纳-Citrate（pH5.5），然后加入1 mL的LB.在37°C孵育1小时，以允许抗生素耐药标记的表达。
      5. 在 4000 x g下旋转细胞 5 分钟。
      6. 在100μL LB中重新悬浮，用100mM纳-Citrate（pH 5.5）和涡旋井来分散细胞。
      7. 选择LB琼脂板上的重组菌株，50μg/mL卡那霉素和10μg/mL四环素，然后通过聚合酶链反应（PCR）用适当的底漆^26、27进行确认。
      8. 通过排序验证 PCR 片段。

2.大肠杆菌突变体中靶基因（ATBAT1）的表达

1. 通过PCR放大目标基因的全长序列，并插入网关输入载体pENTR/D-TOPO^29。
   注:在这种情况下，ATBAT1.1被放大使用前引5'CGGCGATATATATTTTTTTTTTT和反向引基5'GCAAGaATATTGGGGGGGGGGGGGGG， 在98°C处初始变性2分钟，然后在98°C下30循环变性0.1分钟，在59°C退火0.3分钟，在72°C下延长0.40分钟，在72°C下最后延长10分钟。PCR 产品使用 PCR 清理套件进行纯化，并使用光谱仪进行量化。PCR 产品插入网关矢量是按照制造者的指示进行的。
   1. 通过热休克将进入载体转化为合格的Top10大肠杆菌细胞，并选择在LB介质上按照标准分子克隆方案³⁰成功重组50μg/mL卡纳霉素。
   2. 使用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，按照制造商的指示和顺序确认正确的插入。
2. 将目标基因转移到大肠杆菌目标载体中，pBAD-DEST49通过网关LR克隆创建表达载体^29。
   1. 通过热休克30s将表达载体转化为称量Top10大肠杆菌细胞，并在LB介质上选择100μg/mL阿霉素³⁰成功的重组剂。
   2. 提取质粒^DNA30和序列，以确认正确的插入。
3. 将表达载体转换为大肠杆菌[potE740（德尔）::kan，#cadB2231::Tn10，并在具有阿霉素、卡那霉素和四环素³⁰的LB板上选择。
4. 为了确定阿拉伯诱导的最佳浓度，在LB介质中用阿拉伯基诺梯度浓度的arabBAD启动子控制下表达目标基因，如描述²⁹所述。
5. 收集细胞颗粒，并通过SDS-PAGE评估蛋白质表达，并可视化蛋白质带，如产品手册²⁹所述。
   注:大肠杆菌[potE740（德尔）:kan，_cadB2231::Tn10被用作没有BAT1表达式的控制样本。大肠杆菌双敲出具有空pBAD-DEST49载体的突变细胞，由于载体中存在ccdB基因，因此没有用作对照。

3. 内向膜囊泡的生成

1. 培养大肠杆菌突变细胞，通过在5mL的无聚胺培养基（2%甘油，6克K₂HPO_4，3gKH_4，0.5gNaCl，NH₄Cl，50毫克的聚胺，50毫克的聚氨酯）中生长一个菌群，表达靶蛋白。 0.79 g 酵母完全合成介质腺苷二硫醇 （10 毫克/升）， L-精氨酸 （50 毫克/升）， L-阿斯巴酸 （80 毫克/升）， L-硫丁盐酸单水（20毫克/升）， L-亮氨酸 （100 毫克/升）， L-Lysine 盐酸 （50 毫克/升）， L-Mhehi inine （20 毫克/ 升）L-苯丙氨酸（50毫克/升），L-酪氨酸（100毫克/升），L-色氨酸（50毫克/升），L-酪氨酸（50毫克/升），L-Valine（140毫克/升），乌拉西尔（20毫克/升）。将这种培养被转移到500 mL的无聚胺介质中，辅以0.0002%阿拉伯素，并生长，直到细胞培养达到OD₆₀₀的0.6-0.8（通常±5小时）。
2. 在2000 x g下通过离心收集细胞颗粒，在4°C下15分钟。用0.1M磷酸钾缓冲液（pH 6.6）重新悬浮颗粒并洗涤三次，含有10mM EDTA（缓冲液1）。第三次旋转后缓冲区 1 中细胞的最终体积应为 10 mL。
3. 使用35 mL法国压力细胞，通过法国压力细胞的完好无损细胞的内向外膜囊泡（10，000 p.s.i.）生成。
4. 在将样品装载到标准法国压力单元之前，先润滑活塞和 O 型环，以便更轻松地插入电池。
   注意:这些说明是特定于标准压力单元的使用³¹.
   1. 小心地将封闭塞拧到电池的下端。确保单元格的右侧向上基于单元格侧面的字母。将活塞插入单元并将其移入单元，直到活塞上的最大填充线到达活塞顶部。将装置翻转过来，放在三个柱子之间的提供的支架上。
   2. 将细胞悬浮液倒入细胞体中。
      注:我们一直只使用10 mL，所以在法国压力室中会留出足够的空间，其容量为35 mL。
   3. 将标准压力单元安装在法国压力单元上。
      1. 首先检查电源是否关闭。面板左侧是比率选择器开关。它有三个位置:在运行结束时向下，低用于使用较小的压力单元，高用于标准法国压力单元。如果以前将法国压机与较小的电池一起使用，活塞可能无法完全缩回。将此开关设置为"关闭"。
   4. 打开机器，打开设备背面 RHS 的开关，并将"暂停-运行"开关转到"运行"位置。这将导致活塞完全缩回。将开关移回"暂停"，然后关闭机器。
   5. 松开拇指螺钉，将横跨两个不锈钢柱的安全夹具移到侧面。它会向右摆动。用一只手将封闭塞的底座固定到位，用双手拾起法国压力单元，然后旋转 180°，因此活塞现在处于直立位置。将其设置到平台上，并将安全夹移回原位，使此夹具将法国压力单元固定到位。
   6. 请注意，关闭塞上的流量阀组件需要可接触到操作器并定位，以便阀可以自由转动。用几个逆时针转弯打开流量阀组件。将活塞的臂置于两点钟和八点钟位置。拧紧拇指螺钉，使标准压力单元固定到位。
   7. 将样品出口管插入封闭塞，并连接一小片柔性管，以便将破碎的细胞碎片收集到猎鹰管中。我们通常使用 300 mL 的冰填充烧杯将猎鹰管直立，并保持细胞碎片冷却。
   8. 确保暂停运行开关设置为"暂停"，并且阀组件处于打开位置。将机器重新打开，将比率选择器开关变高，并将前面板上的增压阀向右转动约半圈。
   9. 活塞将开始从底座上升，以取代腔室中的空气。将连接到样品出口管的 Tygon 管中排出的空气引导到烧杯中的管中。
   10. 当第一滴液体流出时，顺时针转动流量阀组件。这会产生金属到金属密封，用压力单元，所以不要过度拧紧。
   11. 法国出版社的正面有一张图表，用于对压力细胞内的生物细胞产生适当的压力。在这种情况下，通过顺时针转动压力增加阀来增加压力，直到仪表达到 640 psi。这将创建 10，000 psi 的内部压力。
   12. 一旦电池达到目标压力，顺时针转动流量阀组件，稍微打开流量阀组件。调整阀门的开口，使流量每分钟仅约 10 滴。
   13. 当活塞体上的停止线到达流量单元的顶部时。将暂停运行开关切换到暂停。这一点至关重要，因为将活塞插入更远的单元将损坏装置。打开流量阀组件并收集剩余的液滴。
   14. "调低比率选择器"切换到"向下"，然后将"暂停运行"开关设置为"运行"。当底板完全缩回时，将运行开关设置为"暂停"，然后关闭机器。
   15. 从法国压榨机中取出法国压力芯，然后拆卸以进行清洁。用甘油的光覆盖物将所有部件晾干。用磨损迹象拆下并更换任何垫片或密封件。
5. 在 4°C 下，在 10，000 x g下离心，清除法国印刷机脱热的未碎细胞和细胞碎片 15 分钟。丢弃颗粒，并将上清液转移到超离心管。
6. 在4°C下，通过超离心在150，000g上1小时从生成的上清液中产生颗粒膜囊泡。
7. 洗膜囊泡一次，不重新悬浮，在1mM Tris-maleate中，pH 5.2含有0.14 M KCl，2 mM 2-汞醇和10%甘油，并使用D-ce组织研磨机在同一缓冲液（缓冲液^2）23中重新悬浮。通常，500 mL培养基的膜分量将悬浮在5 mL的缓冲液中，并使用生物chin酸测定³²将膜蛋白/mL浓度悬浮在5-10mg。
8. 在1.5 mL微离心管中储存100μL等分膜制剂在-80°C下。

4. 西布洛特与运输机的定位

1. 在 30 mM Tris pH 7.8 = 0.1 mM CoCl 2_中，从步骤 3.7 中清洗和重新悬浮囊泡。
2. 至 100 μL 样品中，在 0.1 M NaCl、30 mM Tris、0.2 mM CoCl₂ pH 7.8 中加入 1 μL 的 2 mg/mL 卡博比肽酶 A。
3. 在20°C下堵塞20分钟。加入5 μL的0.5M NaEDTA，0.5M 2-mercaptotofffh pH 7.5，停止消化。
4. 要完全灭活酶，在室温下孵育溶液1小时。
   注:没有卡比肽酶A治疗的囊泡被用作对照。
5. 在硫酸锂存在的情况下，通过电泳分析样品。加入5-10 μL的150毫克/mL硫酸锂，450毫克/mL甘油，0.1毫克/mL溴酚蓝，0.4M Tris pH 7.5至100 μL样品。
6. 在聚丙烯酰胺凝胶上放置一个含有25 mM磷酸钠-氢pH7.5的硝化纤维素过滤器，进行免疫印迹。将这些过滤器放在两个保湿纤维素过滤器之间，最后放在两个湿润塑料钢丝绒垫之间。将此组合置于含有 25 mM 磷酸钠-氢 pH 7.5 的腔室电极之间，温度为 2-4 °C。
7. 允许蛋白质的电转移在20 V和2-3 A下进行3小时。
8. 在0.15 M NaCl、10 mM Tris、pH 7.5 和 0.5 mg/mL 补间 20³³的阻塞缓冲液中，在 2°C 下将硝基纤维素膜块状于 2°C。
9. 在阻塞缓冲液（20 mL）中用1:5000稀释抗His（C端子）-HRP抗体，孵育硝化纤维素过滤器2小时，用50 mL的缓冲液洗涤两次，共60分钟。
10. 要可视化免疫波，在20 mL的变性酒精中溶解6毫克的4-氯-1-纳普醇，并加入80 mL的15 mM Tris pH 7.5和50μL的30% H₂O₂。将滤纸在基材溶液中沐浴20分钟。试剂将与抗体发生反应，在硝基纤维素膜上形成蓝色沉淀物。当有足够的颜色时，用水冲洗膜，并允许干燥。

5. 运输Assay

1. 在12°C下孵育膜囊泡100μL等分5分钟。
2. 在最终浓度为50 μM的膜囊泡中加入放射性标记多胺（除非另有说明），以启动运输。在由 10 mM Tris-HCl、10 mM 磷酸钾、pH 8.0 和 0.14 M KCl^23（缓冲器 3）组成的测定缓冲液中制作^{3 种}H 基质（精氨酸或普赖辛）溶液，并根据测定结果进行修改。
3. 在1.5 mL微熔管的12°C下进行1分钟的运输测定。
4. 1分钟后，将反应混合物转移到过滤歧管，并通过0.45 μm硝化纤维素膜过滤器进行过滤。
   1. 加入3 mL的冰冷的测定缓冲液，含有10倍高浓度的未标记多胺，然后加入3 mL的测定缓冲液，不含多胺胺，以减少非特异性结合。
   2. 将洗涤的过滤器转移到含有10 mL闪烁液体的20 mL一次性闪烁小瓶中，并使用液体闪烁计数器确定放射性。闪烁计数器测量样品中的放射性，并报告为每分钟分解 （dpm）。
5. 计算净多胺摄入量，作为在12°C孵育的囊泡在1分钟内的摄入与0分钟在冰上孵育的囊泡的摄入之间的差值。
   注:导入囊泡的基材质量计算如下。如果微熔管中的样品体积为0.2 μL，基板的起始浓度为100μM，则微熔管中基板的总质量为20 x^10-12 M。由于商业标记基材的极高特定活性（通常为 2.22 x 10⁹ pm/mM），在计算中可以忽略添加的同位素的质量。因此，如果添加到微fuge管的同位素总量为100 x 10⁶ dpm，而囊泡的净摄取量为1，000 dpm，则囊泡所占的基质总质量为基质摩尔总数的1%，或2 x^10-13 M。
   1. 通过测量将10、25、50、250和500 μM放射性标记基板的吸收量测定基质的K_m，以表达靶蛋白的囊泡。使用统计软件包³⁴的MichaelisMenton模型使用非线性回归法计算Michaelis-Menten动力学。
6. 对于竞争实验，在12°C下将100μM、500μM、1mM、1.5 mM或2mM非标签竞争基板添加到含有100μL囊泡的1.5 mL微离心管中。
   1. 同时在微离心管中加入放射性标记的聚胺（50 μM）。
   2. 通过重复步骤 5 到 5.4.2 测量卡泡内滞留的放射性，如上所述。
   3. 通过在100μM或更高非标签基板存在的情况下测量10、25、50、250和500μM放射性标记多胺的吸收，并使用非线性回归方法绘制曲线，确定竞争基板的表观K_m （K_{m， app）。}

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结果

此协议中的主要步骤在图 1中进行了图中的图中概述。简单地说，所有聚胺交换器和表达AtBAT1中缺乏的大肠杆菌细胞被培养、离心、用缓冲液清洗，并使用法国印刷机进行细胞解压。莱西斯倾向于产生囊泡，主要是从内到外，并捕获细胞外的缓冲液。细胞碎片通过离心去除，第二个超离心步骤用于收集膜颗粒。膜颗粒在Tris-Maleate缓冲液pH...

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讨论

在本研究中，我们概述了一种对抗分子进行表征的方法，首先在大肠杆菌中表达蛋白质，然后生成膜囊泡，从而可以在无细胞系统中对异位表达的蛋白质进行测定。除了在大多数分子生物学实验室中发现的设备外，这一策略还要求使用法国压力机、超离心机和进入进行放射性同位素检测的设施。

该技术的一个基本要求是异质蛋白正确定位在大肠杆菌的血浆膜上?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
3H-putrescine	PerkinElmer	NET185001MC
3H-spermidine	PerkinElmer	NET522001MC
4-chloro-1-naphthol	Sigma-Aldrich	C8890
14C arginine	Moravek Inc.	MC137
Arginine	Sigma-Aldrich	A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody	ThermoFisher	R931-25	Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
BCA protein assay kit	ThermoFisher	23227	Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue	Bio-Rad	161-0404
Carboxypeptidase B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Centrifuge	Sorvall		SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	scintillation cocktail
EDTA	Sigma-Aldrich
Filtration manifold	Hoefer	FH225V
French Pressure Cell	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Glutamate	Sigma-Aldrich	G6904
Glycerol
GraphPad Prism software			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide	KROGER
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Liquid scintillation counter	Beckman	LS-6500
Maleate	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters	Merck Millipore	hawp02500	0.45 µM
PCR clean up kit	Genscript		QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic	ThermoFisher	P290-500
putrescine	fluka	32810
Potassium Phosphate monobasic	J.T.Baker	4008
Spermidine	Sigma-aldrich	S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10	This manuscript	Available upon request.	Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
Ultracentrifuge	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes	ThermoFisher	45237	Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49	ThermoFisher		Gateway expression vector for E. coli