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  • Protocolo
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos un método para la caracterización de transportadores de membrana impulsados por protones en preparaciones de vesículas de membrana producidas por la expresión heteróloga en E. coli y lisis de células utilizando una prensa francesa.

Resumen

Se han desarrollado varios métodos para caracterizar funcionalmente a los nuevos transportadores de membranas. Las poliaminas son omnipresentes en todos los organismos, pero no se han identificado intercambiadores de poliamina en las plantas. Aquí, delineamos un método para caracterizar los antiportadores de poliamina utilizando vesículas de membrana generadas a partir de la lisis de Escherichia coli cells hetrólogamente expresando un antiportador vegetal. En primer lugar, expresamos heterologousamente AtBAT1 en una cepa de E. coli deficiente en transportadores de intercambio de poliamina y arginina. Las vesículas se produjeron utilizando una prensa francesa, purificadas por ultracentrifugación y utilizadas en un ensayo de filtración por membrana de sustratos etiquetados para demostrar la especificidad del sustrato del transportador. Estos ensayos demostraron que AtBAT1 es un transportador mediado por protones de arginina, ácido aminobutírico (GABA), putrescina y espermidina. La cepa mutante que se desarrolló para el ensayo de AtBAT1 puede ser útil para el análisis funcional de otras familias de intercambiadores de poliaminas vegetales y animales. También hipotetizamos que este enfoque se puede utilizar para caracterizar muchos otros tipos de antiportadores, siempre y cuando estas proteínas se puedan expresar en la membrana celular bacteriana. E. coli es un buen sistema para la caracterización de nuevos transportadores, ya que hay múltiples métodos que se pueden emplear para mutagenizar a los transportadores nativos.

Introducción

Las proteínas implicadas en el tráfico de metabolitos constituyen un nivel esencial de regulación fisiológica, pero la gran mayoría de los transportadores de membranas vegetales aún no se han caracterizado funcionalmente. Se han implementado varias estrategias para caracterizar las nuevas proteínas de transporte. La expresión hetróloga en organismos modelo como E. coli y células eucariotas como levaduras, ovocitos de Xenopus, células de mamíferos, células de insectos y células vegetales se han utilizado para determinar su actividad de transporte1. Las células eucariotas son favorecidas por la expresión de proteínas eucariotas, ya que la composición celular básica, las vías de transducción de señales, la transcripción y las máquinas de traducción son compatibles con las condiciones nativas.

La levadura ha sido un organismo modelo importante para la caracterización de nuevas proteínas de transporte en las plantas. La primera proteína de transporte vegetal que se expresó con éxito en levadura (Saccharomyces pombe) fue el transportador de hexosa HUP1 de Chlorella2. Desde entonces, muchas proteínas de transporte de plantas se han caracterizado funcionalmente utilizando un sistema de expresión de levadura. Estos incluyen, los transportadores de azúcar vegetal (SUC1 y SUC23, VfSUT1 y VfSTP14) y los transportadores de auxin (AUX1 y PIN5). Las desventajas de utilizar levadura para expresar proteínas vegetales pueden incluir deterioro de la actividad de las proteínas localizadas por plastid porque la levadura carece de este orgánulo, el objetivo erróneo6, y la formación de agregados mal plegados y la activación de respuestas de estrés en la levadura debido a la sobreexpresión de proteínas de membrana7,8,9.

La expresión heteróloga de proteínas de transporte en los ovocitos Xenopus ha sido ampliamente utilizada para la caracterización electrofisiológica de los transportadores10. Las primeras proteínas de transporte vegetal caracterizadas por expresión hetróloga en los ovocitos de Xenopus fueron el canal de potasio Arabidopsis KAT110 y el transportador de hexosa Deabidopsis STP111. Desde entonces, los ovocitos de Xenopus se han empleado para caracterizar muchas proteínas de transporte vegetal como los transportadores de membrana plasmática12, transportador de sacarosa vacuola raquídor SUT413 y transportador de malatovacuo ALMT914. Una limitación importante de los ovocitos de Xenopus para los ensayos de transporte es que la concentración de metabolitos intracelulares no puede ser manipulada1. Además, se requieren conocimientos profesionales para preparar los ovocitos de Xenopus y la variabilidad de los lotes de ovocitos es difícil de controlar.

La expresión heteróloga en el organismo modelo E. coli es un sistema ideal en términos de caracterización de nuevas proteínas de transporte vegetal. Con un genoma15completamente secuenciado, las características moleculares y fisiológicas de E. coli son bien conocidas. Las herramientas y técnicas moleculares están bien establecidas16. Además, diferentes vectores de expresión, cepas no patógenas y mutantes están disponibles17,18,19. Además, E. coli tiene una alta tasa de crecimiento y se puede cultivar fácilmente en condiciones de laboratorio. Muchas proteínas se pueden expresar y purificar fácilmente en grandes cantidades en E. coli9. Cuando las proteínas no se pueden ensayo directamente en los sistemas celulares, la reconstitución de proteínas en liposomas también ha sido una innovación exitosa, aunque desafiante para la caracterización de proteínas de membrana purificadas. La caracterización funcional de las proteínas de transporte mitocondrial vegetal, incluidos los transportadores de solutos como los transportadores de fosfato en soja, maíz, arroz y Arabidopsis, portadorde de dicarboxilato-tricarboxilato en Arabidopsis, se han logrado utilizando este sistema modelo20,21. Sin embargo, se encontró que las proteínas recombinantes de la proteína de tomate SICAT9 no eran funcionales en experimentos de reconstitución, y se encontró que otros miembros de la familia de transportadores CAT no eran funcionales en los ensayos de ovocitos del xenopus 22. Por lo tanto, se necesitan herramientas moleculares adicionales para la caracterización de los transportadores de membranas.

Cinco sistemas de transporte de poliamina se encuentran en E. coli23. Incluyen dos transportadores ABC que median la toma de espermidina y putrescina, un intercambiador de putrescina/ornitina, un intercambiador de cadaverina/lisina, un exportador de espermadina y un importador de putrescina. El intercambiador de putrescina PotE se caracterizó originalmente utilizando un ensayo de vesícula, donde de adentro hacia afuera se preparaban vesículas cortando células con una prensa francesa y midiendo la toma de putrescina radioetiquetada en las vesículas a cambio de ornitina24. Los ensayos de vesículas también se utilizaron para caracterizar a un transportador de calcio, que mediaba en el transporte de calcio en respuesta a un gradiente de protones25. Estos experimentos nos llevaron a desarrollar una estrategia para la caracterización de otros intercambiadores de poliamina. Primero creamos una cepa de E. coli deficiente en intercambiadores PotE y CadB. Aquí, demostramos la caracterización funcional de una planta antiportadora de poliamina por expresión heterlomea en la cepa modificada de E. coli, generación de vesículas de membrana utilizando una prensa francesa y ensayos radiomarcados.

Protocolo

1. Generación del Mutante Doble Knock Out de E. coli con Transducción P1

  1. Obtenga las cepas mutantes de un solo knockout de E. coli, el Centro de Valores Genéticos de E. coli (http://cgsc.biology.yale.edu).
    NOTA: La cepa de la variedad de la variedad de la sr. Es resistente a la kanamicina26 y la cepa de CadB es resistente a la tetraciclina27.
  2. Construir la cepa PotE/CadB de doble knockout (DKO) utilizando el protocolo de transducción P128.
    1. Preparación de lisado
      1. Diluir un cultivo nocturno de la olla en LB fresco (1:100) complementado con 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2y 0.1-0.2% glucosa.
      2. Crecer a 37oC durante 1-2 h.
      3. Añadir 40 s de lisato de fago P1 al cultivo, y seguir creciendo a 37 oC. Monitor durante 1-3 h hasta que la cultura se haya lisado
        NOTA: Cuando el cultivo es lysed, los desechos celulares serán visibles en el tubo y el cultivo tendrá una pérdida significativa de turbidez.
      4. Añadir varias gotas de cloroformo (50-100 l) al lisado y al vórtice. Centrifugar a 12.000 x g durante 2 min para eliminar los residuos celulares y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
    2. Transducción
      1. Cultivar la cepa de CadB durante la noche en medio LB.
      2. Cosecha las células por centrifugación a 4.000 x g durante 2 min y resuspende en 1/5-1/3 el volumen de cultivo cosechado en LB fresco complementado con 100 mM MgSO4 y 5 mM CaCl2.
      3. Agregue la suspensión de la célula cadB al tubo con fago del paso 1.2.1.4 y mezcle rápidamente.
      4. Añadir 200 éL de 1 M de na-citrato (pH5.5), luego añadir 1 mL de LB. Incubar a 37 oC durante 1 h para permitir la expresión del marcador resistente a los antibióticos.
      5. Espíe las células a 4000 x g durante 5 min.
      6. Resuspender en 100 l LB suplémido con 100 mM de na-citrato (pH 5.5) y vórtice bien para dispersar las células.
      7. Seleccione las cepas recombinantes en las placas de agar LB con kanamicina de 50 g/ml y tetraciclina de 10 g/ml y, a continuación, confirme por Radimera reacción en cadena (PCR) con las imprimaciones apropiadas26,27.
      8. Verifique los fragmentos PCR secuenciando.

2. Expresión del gen objetivo (AtBAT1) en E. coli Mutant

  1. Amplifique la secuencia de longitud completa del gen de destino por PCR e insértelo en el vector de entrada de gateway pENTR/D-TOPO29.
    NOTA: En este caso ATBAT1.1 se amplificó utilizando la imprimación directa 5'CGGCGATCAATCCTTTGTT y la imprimación inversa 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG, una desnaturalización inicial a 98oC durante 2 min y luego 30 ciclos de desnaturalización a 98oC durante 0,1 min, recocido a 59oC durante 0,3 min, extensión a 72oC para 0,40 min y extensión final a 72oC durante 10 min. El producto PCR fue purificado utilizando un kit de limpieza de PCR, cuantificado mediante un espectrómetro. La inserción del producto PCR en el vector Gateway se realizó siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
    1. Transforme el vector de entrada en células competentes Top10 E. coli por shock térmico y seleccione para recombinantes exitosos en medios LB con kanamicina de 50 g/ml siguiendo los protocolos de clonación molecular estándar30.
    2. Extraiga el ADN plásmido utilizando un kit de extracción de plásmido, siguiendo las instrucciones del fabricante, y secuencia para confirmar la correcta inserción.
  2. Transfiera el gen de destino al vector de destino E. coli, pBAD-DEST49 por clonación de Gateway LR para crear un vector de expresión29.
    1. Transforme el vector de expresión en células competentes top10 E. coli por choque de calor durante 30 s y seleccione recombinantes exitosos en medios LB con 100 g/ml de ampicilina30.
    2. Extraiga el ADN plásmido30 y la secuencia para confirmar la correcta inserción.
  3. Transforme el vector de expresión en E. coli-potE740(del):kan, ácadB2231::Tn10 y seleccione en placas LB con ampicilina, kanamicina y tetraciclina30.
  4. Con el fin de determinar la concentración óptima de arabinosa para la inducción, expresar el gen diana bajo el control del promotor araBAD en medios LB con concentraciones de gradiente de arabinosa como se describe29.
  5. Recoger los pellets celulares y evaluar la expresión de proteínas por SDS-PAGE y la visualización de bandas proteicas como se describe en el manual del producto29.
    NOTA: El E. colipotE740(del)::kan, el cadB2231::Tn10 se utilizó como muestra de control sin expresión BAT1. Las células mutantes noqueadas dobles de E.coli con el vector pBAD-DEST49 vacío no se utilizaron como control debido a la presencia del gen ccdB en el vector.

3. Generación de vesículas de membrana de interior-salida

  1. Cultivo de las células mutantes de E. coli que expresan la proteína diana mediante el cultivo de una sola colonia durante la noche en 5 ml de medios libres de poliamina (2% glicerol, 6 g de K2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, NH4Cl, 50 mg de tiamina, 0.79 g de levadura completa medios sintéticos adenine hemisulfate (10 mg/L), L-arginina (50 mg/L), ácido L-aspártico (80 mg/L), clorhidrato de L-histidina monohidrato (20 mg/L), L-leucina (100 mg/L), clorhidrato de L-lisina (50 mg/L), L-metionina (20 mg/L), L-fenilalanina (50 mg/L), L-threonina (100 mg/L), L-triptófano (50 mg/L), L-tirosina (50 mg/L), L-valina (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Transfiera este cultivo a 500 ml de medios libres de poliamina complementados con 0.0002% arabinose y crezca hasta que el cultivo celular alcance una DoS600 de 0.6-0.8 (generalmente 5 h).
  2. Recoger el pellet celular por centrifugación a 2.000 x g durante 15 min a 4 oC. Resuspenda el pellet y lávelo tres veces con un tampón de fosfato potásico de 0,1 M, pH 6,6, que contiene 10 mM de EDTA (Buffer 1). El volumen final de celdas en el búfer 1 después del tercer giro debe ser de 10 ml.
  3. Generar vesículas de membrana de adentro hacia afuera mediante el tratamiento de prensa francesa (10.000 p.s.i.) de las células intactas utilizando una célula de presión francesa de 35 ml.
  4. Antes de cargar la muestra en la celda de presión francesa estándar, lubrique el pistón y las juntas tóricas para que sea más fácil de insertar en la celda.
    Nota:Estas instrucciones son específicas para el uso de la célula de presión estándar31.
    1. Atornille cuidadosamente el tapón de cierre en el extremo inferior de la celda. Asegúrese de que la celda esté del lado derecho hacia arriba en función de las letras en el lado de la celda. Inserte el pistón en la celda y muévalo a la celda, hasta que la línea de llenado máxima en el pistón alcance la parte superior del pistón. Voltee la unidad y colóquela en el soporte proporcionado entre los tres postes.
    2. Vierta la suspensión celular en el cuerpo de la célula.
      NOTA: Hemos estado usando sólo 10 mL, por lo que quedará mucho espacio en la cámara de la célula de presión francesa, que tiene una capacidad de 35 ml.
    3. Monte la celda de presión estándar en la unidad de celda de presión francesa.
      1. Primero compruebe que la alimentación está apagada. En el lado izquierdo del panel se encuentra el interruptor Selector de relación. Tiene tres posiciones: Abajo al final de la carrera, Bajo para usar una celda de presión más pequeña, y Alto para su uso con la celda de presión francesa estándar. Si la prensa francesa se utilizó anteriormente con la celda más pequeña, es posible que el pistón no se retraiga por completo. Establezca este interruptor en Abajo.
    4. Encienda la máquina con el interruptor del RHS en la parte posterior de la unidad y gire el interruptor Pause-Run a la posición Ejecutar. Esto dará lugar a que el pistón se retraiga por completo. Mueva el interruptor de nuevo a Pausay apague la máquina.
    5. Afloje los tornillos del pulgar y mueva la abrazadera de seguridad que se extiende a dos columnas de acero inoxidable hacia un lado. Se balanceará a la derecha. Con una mano sosteniendo la base del tapón de cierre en su lugar, recoja la celda de presión francesa con ambas manos y gírela 180o, por lo que el pistón está ahora en posición vertical. Colóquelo en la plataforma y vuelva a colocar la abrazadera de seguridad en su lugar para que esta abrazadera mantenga la celda de presión francesa en su posición.
    6. Tenga en cuenta que el conjunto de la válvula de flujo en el enchufe de cierre debe ser accesible para el operador y colocado para que la válvula se pueda girar libremente. Abra el conjunto de la válvula de flujo con unos giros en sentido contrario a las agujas del reloj. Coloque los brazos del pistón de modo que estén orientados en una posición de dos y ocho. Apriete los tornillos de los pulgares de modo que la celda de presión estándar se mantenga en su lugar.
    7. Inserte el tubo de salida de muestra en el tapón de cierre y conecte una pieza corta de tubo flexible para que los restos de celda rotos puedan recogerse en un tubo de halcón. Usualmente usamos un vaso de 300 ml lleno de hielo para mantener el tubo del halcón en posición vertical, y para mantener los restos de la célula refrigerados.
    8. Asegúrese de que el interruptor Pausar-Ejecutar esté establecido en Pausay que el conjunto de válvulas esté en la posición abierta. Vuelva a encender la máquina, apolvo el selector de relación interruptor a alta, y gire la válvula de aumento de presión en el panel frontal a la derecha alrededor de media vuelta.
    9. El pistón comenzará a levantarse de la base para desplazar el aire en la cámara. Dirija el aire que sale del tubo Tygon unido al tubo de salida de la muestra al tubo del vaso de precipitados.
    10. Cuando salgan las primeras gotas de líquido, cierre el conjunto de la válvula de flujo girándolo en el sentido de las agujas del reloj. Esto crea un sello de metal a metal, con la celda de presión, por lo que no apriete demasiado.
    11. La parte frontal de la Prensa Francesa tiene un gráfico en el panel frontal para generar la presión adecuada sobre las células biológicas dentro de la célula de presión. En este caso, aumente la presión girando la válvula de aumento de presión en el sentido de las agujas del reloj, hasta que el medidor alcance 640 psi. Esto creará una presión interna de 10.000 psi.
    12. Una vez que la célula ha alcanzado la presión objetivo, abra ligeramente el conjunto de la válvula de flujo girándolo en sentido contrario a las agujas del reloj. Ajuste la abertura de la válvula para permitir un caudal de sólo unas 10 gotas por minuto.
    13. Cuando la línea de parada en el cuerpo del pistón alcanza la parte superior de la celda de flujo. Cambie el interruptor Pausar-Ejecutar a Pausa. Esto es fundamental porque tener el pistón insertado más lejos en la célula dañará la unidad. Abra el conjunto de la válvula de flujo y recoja las gotas restantes.
    14. Gire el selector de relación en Abajoy, a continuación, establezca el modificador Pausar ejecución en Ejecutar. Cuando la placa inferior esté completamente retraída, ajuste el interruptor Ejecutar a Pausay apague la máquina.
    15. Retire la celda de presión francesa de la prensa francesa y desmonte para su limpieza. Conservar todas las piezas secas con una cubierta ligera de glicerol. Retire y reemplace las juntas o sellos con signos de desgaste.
  5. Retire las células ininterrumpidas y los restos celulares de la prensa francesa eluyente por centrifugación a 10.000 x g durante 15 min a 4 oC. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a tubos ultracentrífugos.
  6. Vesículas de membrana de pellets del sobrenadante resultante por ultracentrifugationat 150.000 g durante 1 h a 4oC.
  7. Lavar las vesículas de membrana una vez, sin resuspensión, en 1 mM Tris-maleato, pH 5.2 que contiene 0.14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoetanol y 10% glicerol y resuspender en el mismo tampón (Buffer 2)23 usando una amoladora de tejido Dounce. Típicamente la fracción de membrana de 500 ml de cultivo se suspendería en 5 ml de tampón, y una concentración de 5-10 mg de proteína de membrana/ml utilizando el ensayo de ácido biocílico32.
  8. Almacene alícuotas de 100 ml de preparados de membranas a -80 oC en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.

4. Western Blot y orientación del ensayo transportador

  1. Lavar y resuspender vesículas del paso 3.7 en 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2.
  2. A muestras de 100 l, añadir 1 ml de carboxipeptidasa de 2 mg/ml en 0,1 M NaCl, Tris de 30 mM, 0,2 mM de CoCl2 pH 7,8.
  3. Inculque durante 20 min a 20oC. Detenga la digestión añadiendo 5 sL de NaEDTA de 0,5 M, 0,5 M 2-mercaptoetanol pH 7,5.
  4. Para inactivar completamente la enzima, incubar la solución durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Las vesículas sin el tratamiento catboxypeptidase A se utilizaron como control.
  5. Analizar muestras por electroforesis en presencia de sulfato de dodecílico de litio. Añadir 5-10 l de 150 mg/ml de sulfato de dodecilo de litio de 150 mg/ml, 450 mg/ml de glicerol, 0,1 mg/ml de bromofenol azul, 0,4 M Tris pH 7,5 a 100 ml de la muestra.
  6. Realice la inmunoblotación colocando un filtro de nitrocelulosa humedecido con 25 mM de pH de fosfato sódico-hidrógeno 7.5 sobre el gel de poliacrilamida. Colóquelos entre dos filtros de celulosa humedecido y, finalmente, entre dos almohadillas de plástico humedecido. Coloque este conjunto entre los electrodos de una cámara que contenga 25 mM de fosfato sódico-hidrógeno pH 7,5 a 2-4 oC.
  7. Permita que la electrotransferencia de proteínas continúe durante 3 h a 20 V y 2-3 A.
  8. Bloquear la membrana de nitrocelulosa durante la noche a 2 oC en un tampón de bloqueo de 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 y 0,5 mg/mL Tween 2033.
  9. Incubar el filtro de nitrocelulosa durante 2 h con una dilución de 1:5000 de anticuerpo anti-His (terminal C)-HRP en el tampón de bloqueo (20 ml) y lavar dos veces con 50 ml de tampón durante un total de 60 min.
  10. Para visualizar el inmunoblot, disolver 6 mg de 4-cloro-1-naftol en 20 ml de alcohol desnaturalizado y añadir 80 mL de 15 mM Tris pH 7,5 y 50 ml de 30% H2O2. Bañe el papel filtrante en la solución de sustrato durante 20 min. El reactivo reaccionará con el anticuerpo para formar un precipitado azul en la membrana de la nitrocelulosa. Cuando se haya desarrollado suficiente color, enjuague la membrana con agua y deje secar.

5. Ensayo de transporte

  1. Incubar 100 alícuotas de vesículas de membrana a 12 oC durante 5 min.
  2. Inicie el transporte añadiendo poliaminas radioetiquetadas a las vesículas de membrana a una concentración final de 50 m (a menos que se indique lo contrario). Hacer 3soluciones de sustrato H (espermidina o putrescina) en un tampón de ensayo que consta de 10 mM Tris-HCl, 10 mM de fosfato de potasio, pH 8.0 y 0.14 M KCl23 (Buffer 3) con modificaciones dependiendo del ensayo.
  3. Llevar a cabo ensayos de transporte durante 1 min a 12 oC en tubos de microfúgeo de 1,5 ml.
  4. Después de 1 min, transfiera las mezclas de reacción al colector de filtración y filtre a través de un filtro de membrana de nitrocelulosa de 0,45 m.
    1. Añadir 3 ml de tampón de ensayo frío en hielo que contenga una concentración 10 veces mayor de poliaminas sin etiquetar seguida de 3 ml de tampón de ensayo sin las poliaminas para reducir la unión inespecífica.
    2. Transfiera los filtros lavados a viales de centelleo desechables de 20 ml que contengan 10 ml de líquido centelleo y determine la radiactividad utilizando un contador de centelleo líquido. El contador de centelleo mide la radiactividad en la muestra y la notifica como desintegraciones por minuto (dpm).
  5. Calcular la ingesta neta de poliamina como la diferencia entre la toma a 1 min por vesículas incubadas a 12 oC y la toma a 0 min por vesículas incubadas sobre hielo.
    NOTA: La masa de sustrato importada en las vesículas se calcula de la siguiente manera. Si el volumen de la muestra en el tubo de microfúctelo es de 0,2 l y la concentración inicial del sustrato es de 100 m, la masa total de sustrato en el tubo de microfúctil es de 20 x 10-12 M. Debido a la muy alta actividad específica de sustratos etiquetados comercialmente (a menudo 2,22 x 109 dpm/mM) la masa del isótopo añadido puede ser ignorada en el cálculo. Así que si la cantidad total de isótopo que se añadió al tubo de microfúcteo fue 100 x 106 dpm y las vesículas tenían una toma neta de 1.000 dpm, entonces la masa total de sustrato tomada por las vesículas fue del 1% del número total de moles de sustrato o 2 x 10-13 M.
    1. Determinar Km para el sustrato midiendo la absorbación de 10, 25, 50, 250 y 500 m de sustrato radiomarcado en vesículas que expresan la proteína diana. Calcule la cinética de Michaelis-Menten utilizando un método de regresión no lineal utilizando el modelo Michaelis Menton del paquete de software estadístico34.
  6. Para los experimentos de la competencia, añada un sustrato competitivo no etiquetado de 100 m, 500 m, 1 mM o 2 mM de mM fabricado en el tampón de ensayo al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 100 ml de vesículas a 12 oC.
    1. Añadir poliamina radioetiquetada (50 m) al tubo de microcentrífuga simultáneamente.
    2. Mida la radiactividad atrapada dentro de las vesículas como se mencionó anteriormente repitiendo los pasos 5 a 5.4.2.
    3. Determinar km aparente(Km,app) para los sustratos competitivos midiendo la ingesta de 10, 25, 50, 250 y 500 m poliaminas radioetiquetadas en presencia de sustrato no etiquetado de 100 m o superior y utilizando un método de regresión no lineal para trazar la curva.

Resultados

Los pasos principales de este protocolo se resumen pictóricamente en la Figura 1. Brevemente, las células de E. coli deficientes en todos los intercambiadores de poliamina y la expresión de AtBAT1 son cultivadas, centrifugadas, lavadas con un tampón y sometidas a lisis celular utilizando una prensa francesa. La lisis tiende a producir vesículas que son en su mayoría de adentro hacia afuera y atrapan el tampón fuera de las células. Lo...

Discusión

En el presente estudio, delineamos un método para la caracterización de un antiportador expresando primero la proteína en E. coli y luego generando vesículas de membrana, de modo que la proteína expresada heterólogamente puede ser ensayada en un sistema libre de células. Además de los equipos que se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología molecular, esta estrategia requiere el uso de una prensa francesa, una ultracentrífuga y el acceso a una instalación para llevar a cabo ensayos de ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El apoyo a este proyecto vino de la BGSU Graduate College, y la Oficina de Programas Patrocinados e Investigación de BGSU.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3H-putrescinePerkinElmerNET185001MC
3H-spermidinePerkinElmerNET522001MC
4-chloro-1-naphtholSigma-AldrichC8890
14C arginineMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibodyThermoFisherR931-25Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BCA protein assay kitThermoFisher23227Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blueBio-Rad161-0404
Carboxypeptidase BSigma-AldrichC9584-1mg
CentrifugeSorvallSS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinderLabGenome7777-7Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275scintillation cocktail
EDTASigma-Aldrich
Filtration manifoldHoeferFH225V
French Pressure CellGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
GlutamateSigma-AldrichG6904
Glycerol
GraphPad Prism softwarehttp://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxideKROGER
Potassium ChlorideJ.T. Baker3040-01
Liquid scintillation counterBeckmanLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
Nitrocellulose membrane filtersMerck Milliporehawp025000.45 µM
PCR clean up kitGenscriptQuickClean II
Potassium Phosphate dibasicThermoFisherP290-500
putrescinefluka32810
Potassium Phosphate monobasicJ.T.Baker4008
SpermidineSigma-aldrichS2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10This manuscriptAvailable upon request.Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-baseResearch ProductsT60040-1000
UltracentrifugeSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubesThermoFisher45237Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway expression vector for E. coli

Referencias

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
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