JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Descrevemos um método para a caracterização de transportadores de membrana sufrágio movidos a prótons em preparações de vesículas de membrana produzidas pela expressão heterologous em E. coli e lise de células usando uma imprensa francesa.

Resumo

Vários métodos foram desenvolvidos para caracterizar funcionalmente novos transportadores de membrana. Poliaminas são onipresentes em todos os organismos, mas trocadores de poliamina em plantas não foram identificados. Aqui, descrevemos um método para caracterizar anticarregadores de poliamina usando vesículas de membrana geradaa a partir da lise das células escherichia coli expressando heterologously um antiporter vegetal. Primeiro, nós heterologously expressou AtBAT1 em uma cepa E. coli deficiente em poliamina e transportadores de câmbio arginina. Vesículas foram produzidas usando uma imprensa francesa, purificada pela ultracentrífugae e utilizadas em um ensaio de filtragem de membrana de substratos rotulados para demonstrar a especificidade do substrato do transportador. Estes ensaios demonstraram que atbat1 é um transportador proton-mediado de arginina, γ-aminobutírico ácido (GABA), putrescine e espermidina. A cepa mutante que foi desenvolvida para o ensaio do AtBAT1 pode ser útil para a análise funcional de outras famílias de trocadores de poliamina vegetal e animal. Nós também supor que esta abordagem pode ser usada para caracterizar muitos outros tipos de antiporters, desde que essas proteínas podem ser expressas na membrana celular bacteriana. E. coli é um bom sistema para a caracterização de novos transportadores, uma vez que existem vários métodos que podem ser empregados para mutgenizar os transportadores nativos.

Introdução

As proteínas envolvidas no tráfico de metabólitos constituem um nível essencial de regulação fisiológica, mas a grande maioria dos transportadores de membranas vegetais ainda não foi funcionalmente caracterizada. Várias estratégias foram implementadas para caracterizar novas proteínas de transporte. Expressão heterologous em organismos modelo como E. coli e células eucarióticas, como levedura, oócitos xenopus, células de mamíferos, células de insetos e células vegetais têm sido usados para determinar sua atividade de transporte1. As células eucarióticas são favorecidas pela expressão de proteínas eucarióticas, pois a composição celular básica, as vias de transdução de sinal, transcrição e máquinas de tradução são compatíveis com as condições nativas.

O fermento tem sido um organismo modelo importante para a caracterização de novas proteínas de transporte em plantas. A primeira proteína de transporte vegetal que foi expressa com sucesso em levedura(Saccharomyces pombe)foi o transportador hexose HUP1 de Chlorella2. Desde então, muitas proteínas de transporte de plantas têm sido funcionalmente caracterizadas usando um sistema de expressão de levedura. Estes incluem, transportadores de açúcar de plantas (SUC1 e SUC23,VfSUT1 e VfSTP14)e os transportadores de auxina (AUX1 e PIN5). As desvantagens de utilizar levedura para expressar proteínas vegetais podem incluir atividade prejudicada de proteínas localizadas com plastide, pois o fermento não tem essa organela, a segmentação inativa6,e a formação de agregados mal dobrados e a ativação de respostas ao estresse em levedura devido à superexpressão das proteínas da membrana7,8,9.

A expressão heterologous de proteínas do transporte em oocytes de Xenopus foi amplamente utilizada para a caracterização electrophysiological dos transportadores10. As primeiras proteínas de transporte de plantas caracterizadas usando expressão heterologous em oócitos Xenopus foram o canal Arabidopsis potassium KAT110 e o transportador de hexose Arabidopsis STP111. Desde então, os oócitos Xenopus têm sido empregados para caracterizar muitas proteínas de transporte de plantas, como transportadores de membrana plasmática12,transporte de surose vacuolar SUT413 e transportador de malado vacuolar ALMT914. Uma importante limitação dos oócitos Xenopus para ensaios de transporte é que a concentração de metabólitos intracelulares não pode ser manipulada1. Além disso, o conhecimento profissional é necessário para preparar os oócitos Xenopus e a variabilidade dos lotes de oócito é difícil de controlar.

A expressão heterologous no organismo modelo E. coli é um sistema ideal nos termos da caracterização de proteínas novas do transporte da planta. Com um genoma totalmente sequenciado15,as características moleculares e fisiológicas de E. coli são bem conhecidas. Ferramentas e técnicas moleculares estão bem estabelecidas16. Além disso, vetores de expressão diferentes, cepas não patogênicas e mutantes estão disponíveis17,18,19. Além disso, E. coli tem uma alta taxa de crescimento e pode ser facilmente cultivada em condições de laboratório. Muitas proteínas podem ser facilmente expressas e purificadas em quantidades elevadas em E. coli9. Quando as proteínas não podem ser amenizadas diretamente nos sistemas celulares, a reconstituição de proteínas em lipossomos também tem sido uma inovação bem sucedida, embora desafiadora, para a caracterização de proteínas de membrana purificadas. Caracterização funcional das proteínas de transporte mitocondrial de plantas, incluindo transportadores solute, como transportadores de fosfato em soja, milho, arroz e arabidopsia, portador de dicarboxil-tricarboxilato em Arabidopsis foram realizadas usando este sistema modelo20,21. No entanto, proteínas recombinantes da proteína de tomate SICAT9 foram encontradas não funcionais em experimentos de reconstituição, e outros membros da família cat transportador foram encontrados para ser não funcional em xenopus oocyte ensaios22. Assim, são necessárias ferramentas moleculares adicionais para a caracterização dos transportadores de membrana.

Cinco sistemas de transporte de poliamina são encontrados em E. coli23. Eles incluem dois transportadores ABC mediando a captação de espermidina e putrescine, um trocador putrescine/ornithine, um trocador de cadaverina/lysine, um exportador de espermidina e um importador putrescine. O trocador de putrescine PotE foi originalmente caracterizado usando um ensaio vesícula, onde de dentro para fora vesículas foram preparadas por células de lise com uma imprensa francesa e medindo a captação de putrescina radiografada nas vesículas em troca de orníntes24. Os ensaios da vesícula também foram usados para caracterizar um transportador de cálcio, que mediava o transporte de cálcio em resposta a um gradiente de prótons25. Esses experimentos nos levaram a desenvolver uma estratégia para a caracterização de outros trocadores de poliamina. Primeiro criamos uma cepa de e. coli deficiente em trocadores de PotE e CadB. Aqui, demonstramos a caracterização funcional de um antiporter de poliamina vegetal por expressão heterlogous na cepa e. coli modificada, geração de vesículas de membrana usando uma imprensa francesa e ensaios radiografados.

Protocolo

1. Geração do E. coli Double Knock Out Mutant com Transdução P1

  1. Obter o E. coli single-knockout mutantes cepas ΔPotE e ΔCadB do E. coli Genetic Stock Center(http://cgsc.biology.yale.edu).
    Nota: A cepa ΔPotE é resistente à kanamicina26 e a cepa ΔCadB é resistente à tetraciclina27.
  2. Construa a cepa de nocaute duplo PotE/CadB (DKO) usando o protocolo de transdução P128.
    1. Preparação de lysate
      1. Diluir uma cultura durante a noite de ΔPotE em LB fresco (1:100) complementada com 10-25 mM MgCl2,5 mM CaCl2, e 0,1-0,2% de glicose.
      2. Crescer a 37 °C para 1-2 h.
      3. Adicione 40 μL de lysate de fago P1 à cultura e continue crescendo a 37 °C. Monitorpara 1-3 h até que a cultura tenha lysed
        NOTA: Quando a cultura é lysed, detritos celulares serão visíveis no tubo e a cultura terá uma perda significativa de turbidez.
      4. Adicione várias gotas de clorofórmio (50-100 μL) ao lysate e vórtice. Centrífuga a 12.000 x g para 2 min para remover detritos celulares e transferir o supernatant para um tubo fresco.
    2. Transdução
      1. Crescer cepa ΔCadB durante a noite no meio LB.
      2. Colher as células por centrífuga a 4.000 x g para 2 min e resuspender em 1/5-1/3 o volume de cultura colhida em LB fresco complementado com 100 mM MgSO4 e 5 mM CaCl2.
      3. Adicione a suspensão celular ΔCadB ao tubo com fago do passo 1.2.1.4 e misture rapidamente.
      4. Adicione 200 μL de 1 M Na-Citrate (pH5.5), em seguida, adicione 1 mL de LB. Incubate em 37 °C para 1 h para permitir a expressão do marcador resistente aos antibióticos.
      5. Células de rotação a 4000 x g por 5 min.
      6. Resuspenda em 100 μL LB supplemeted com 100 mM Na-Citrate (pH 5.5) e vórtice bem para dispersar as células.
      7. Selecione as cepas recombinantes em placas de ágar LB com 50 μg/mL kanamicinina e 10 μg/mL tetraciclina e, em seguida, confirmar por Polymerase Reação Em Cadeia (PCR) com primers apropriados26,27.
      8. Verifique os fragmentos de PCR por sequenciamento.

2. Expressão do Gene alvo (AtBAT1) em E. coli Mutant

  1. Amplificar a sequência completa do gene alvo por PCR e inserir no vetor de entrada Gateway pENTR/D-TOPO29.
    Nota: Neste caso, atbat1.1 foi amplificado usando primer para a frente 5'CGGCGATCAATTTTGTT e primer reverso 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG, uma desnaturação inicial a 98 °C por 2 min e, em seguida, 30 ciclos de desnaturação a 98 °C por 0,1 min, annealing em 59 °C por 0,3 min, extensão de 72 °C por 0,40 min e extensão final em 72 °C por 10 min. O produto PCR foi purificado usando um kit de limpeza PCR, quantificado usando um espectrômetro. A inserção do produto PCR no vetor Gateway foi feita seguindo as instruções dos manufactrurers.
    1. Transforme o vetor de entrada em células Top10 E. coli competentes por heatshock e selecione para recombinantes bem-sucedidos na mídia LB com 50 μg/mL kanamicinseguindo protocolos de clonagem molecular padrão30.
    2. Extraia dna de plasmídeo usando um kit de extração de plasmídeos, seguindo as instruções do fabricante, e seqüência para confirmar a inserção correta.
  2. Transfira o gene alvo para o vetor de destino E. coli, pBAD-DEST49 pela clonagem Gateway LR para criar um vetor de expressão29.
    1. Transforme o vetor de expressão em células Top10 E. coli competentes por heatshock para 30 s e selecione recombinantes bem-sucedidos na mídia LB com 100 μg/mL ampicilina30.
    2. Extraia dna plasmid30 e seqüência para confirmar a inserção correta.
  3. Transforme o vetor de expressão em E. coli ΔpotE740 (del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 e selecione em placas LB com ampicilina, kanamicina e tetraciclina30.
  4. A fim de determinar a concentração ideal de arabinose para a indução, expressar o gene alvo o controle do promotor araBAD na mídia LB com concentrações de gradiente de arabinose como descrito29.
  5. Coletar as pelotas celulares e avaliar a expressão de proteína por SDS-PAGE e visualização de bandas de proteína, conforme descrito no manual do produto29.
    Nota: O E. coli ΔpotE740 (del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 foi usado como a amostra de controle sem expressão BAT1. E.coli dupla derrubar células mutantes com o vetor pBAD-DEST49 vazio não foi usado como um controle devido à presença do gene ccdB no vetor.

3. Geração de vesículas de membrana de dentro para fora

  1. Cultura as células mutantes E. coli expressando a proteína alvo, crescendo uma única colônia durante a noite em 5 mL de mídia livre de poliamina (2% glicerol, 6 g de K2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, NH4Cl, 50 mg de tiamina, 0,79 g de fermento completa mídia sintética adenina hemisulfate (10 mg/L), L-Arginine (50 mg/L), L-Aspartic ácido (80 mg/L), L-Histi Monohidrato de cloridrato de águaimorda (20 mg/L), L-Leucine (100 mg/L), cloridrato de L-Lysine (50 mg/L), L-Methionine (20 mg/L), L-Fenilalanina (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-Tryptophan (50 mg/L), L-Tyrosine (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Transfira esta cultura para 500 mL de mídia livre de poliamina complementada com 0,0002% arabinose e crescer até que a cultura celular atinja um OD600 de 0,6-0,8 (geralmente ~ 5 h).
  2. Colete a pelota celular por centrífuga a 2.000 x g por 15 min a 4 °C. Resuspenda a pelota e lave três vezes com 0,1 M tampão de fosfato de potássio, pH 6.6, contendo 10 mM EDTA (Buffer 1). O volume final de células em Buffer 1 após a terceira rotação deve ser de 10 mL.
  3. Gerar vesículas de membrana de dentro para fora pelo tratamento da imprensa francesa (10.000 p.s.i.) das células intactas usando uma célula de pressão francesa de 35 mL.
  4. Antes de carregar a amostra na célula de pressão francesa padrão, lubrifique o pistão e os anéis O para facilitar a inserção na célula.
    Nota:Estas instruções são específicas para o uso da célula de pressão padrão31.
    1. Cuidadosamente parafuso o plug de encerramento na extremidade inferior da célula. Certifique-se de que a célula está do lado direito para cima com base nas letras do lado da célula. Insira o pistão na célula e mova-o para a célula, até que a linha máxima de preenchimento no pistão atinja o topo do pistão. Vire a unidade e coloque no estande fornecido entre os três postes.
    2. Despeje a suspensão celular no corpo da célula.
      Nota: Temos vindo a utilizar apenas 10 mL, por isso haverá muito espaço deixado na câmara de células de pressão francesa, que tem uma capacidade de 35 mL.
    3. Monte a célula de pressão padrão na unidade de células de pressão francesa.
      1. Primeiro verifique se a energia está desligada. No lado esquerdo do painel está o interruptor do seletor da relação. Tem três posições: Para baixo no fim do funcionamento, baixo para usar uma pilha menor da pressão, e elevado para o uso com a pilha francesa padrão da pressão. Se a imprensa francesa foi usada previamente com a pilha menor o pistão não pode inteiramente ser retraído. Definir este interruptor para baixo.
    4. Ligue a máquina com o interruptor no RHS na parte de trás da unidade e ligue o interruptor Pause-Run para a posição de corrida. Isso resultará no pistão sendo totalmente retraído. Mova o interruptor de volta para pausa,e desligue a máquina.
    5. Solte os parafusos do polegar e mova a braçadeira de segurança que se estende para duas colunas de aço inoxidável para o lado. Ele vai balançar para a direita. Com uma mão segurando a base do plugue de fechamento no lugar, pegar a célula de pressão francesa com as duas mãos, e girá-lo 180 °, de modo que o pistão está agora na posição vertical. Coloque-o na plataforma, e mover a segurança de volta no lugar para que esta braçadeira mantém a célula de pressão francesa na posição.
    6. Observe que a montagem da Válvula flow no plugue de fechamento precisa ser acessível ao operador e posicionada para que a válvula possa ser girada livremente. Abra a montagem da válvula de fluxo com algumas voltas no sentido horário. Posicione os braços do pistão para que eles sejam orientados em uma posição de duas horas e oito horas. Aperte os parafusos polegares para que a célula de pressão padrão é realizada no lugar.
    7. Insira o tubo de saída da amostra no plugue de fechamento e conecte um pequeno pedaço de tubulação flexível para que os detritos celulares quebrados possam ser coletados em um tubo de falcão. Costumamos usar um copo cheio de gelo de 300 mL para segurar o tubo de falcão na posição vertical, e para manter os detritos da célula refrigerados.
    8. Certifique-se de que o interruptor Pause-Run está definido para pausar,e a montagem da válvula está em posição aberta. Ligue a máquina de volta para, adust o interruptor Ratio Selector para alta,e vire a válvula de aumento de pressão no painel frontal para a direita cerca de meia volta.
    9. O pistão começará a subir a partir da base para deslocar o ar na câmara. Dirijar o ar que sai da tubulação Tygon ligado ao tubo de saída de amostra para o tubo no copo.
    10. Quando as primeiras gotas de líquido saem, feche a montagem da válvula de fluxo, transformando-o no sentido horário. Isso cria um selo de metal para metal, com a célula de pressão, por isso não apertar demais.
    11. A frente da imprensa francesa tem um gráfico no painel frontal para gerar a pressão adequada sobre as células biológicas dentro da célula de pressão. Neste caso, aumentar a pressão, transformando a válvula de aumento de pressão no sentido horário, até que o calibre atinge 640 psi. Isso criará uma pressão interna de 10.000 psi.
    12. Uma vez que a célula atingiu a pressão alvo abrir a montagem da válvula de fluxo ligeiramente, transformando-o no sentido horário. Ajuste a abertura da válvula para permitir uma taxa de fluxo de apenas cerca de 10 gotas por minuto.
    13. Quando a linha de parada no corpo pistão atinge o topo da célula de fluxo. Mude o interruptor pausado para pausar. Isso é fundamental porque ter o pistão inserido mais longe na célula irá danificar a unidade. Abra a montagem da válvula de fluxo e recolher as quedas restantes.
    14. Ligue o seletor de proporção para baixoe, em seguida, defina o interruptor pause run para executar. Quando a placa inferior estiver totalmente retraída, defina o interruptor run para pausare desligue a máquina.
    15. Retire a célula de pressão francesa da imprensa francesa, e desmontar para a limpeza. Armazenar todas as partes secas com uma leve cobertura de glicerol. Retire e substitua quaisquer juntas ou selos com sinais de desgaste.
  5. Remover células ininterruptas e detritos celulares da imprensa francesa eluent por centrífuga a 10.000 x g para 15 min a 4 °C. Descarte a pelota e transfira tubos supernatant para tubos ultracentrífugas.
  6. Vesículas de membrana de pelota do supernatant resultante por ultracentrífugationat 150,000 g para 1 h a 4 °C.
  7. Lave as vesículas de membrana uma vez, sem resuspensão, em 1 mM Tris-maleate, pH 5.2 contendo 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoethanol e 10% glicerol e resuspender no mesmo buffer (Buffer 2)23 usando um moedor de tecido Dounce. Normalmente, a fração de membrana de 500 mL de cultura seria suspensa em 5 mL de buffer, e uma concentração de 5-10 mg de proteína de membrana / mL usando o ensaio ácido biochinic32.
  8. Armazenar 100 μL alíquotas de preparação de membrana em -80 °C em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.

4. Blot ocidental e orientação do ensaio do transportador

  1. Lave e resuspenda vesículas do passo 3.7 em 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl2.
  2. Para 100 amostras μL, adicionar 1 μL de 2 mg/mL carboxypeptidase A em 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.
  3. Inscular por 20 min a 20 °C. Pare a digestão adicionando 5 μL de 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoethanol pH 7.5.
  4. Para inativar totalmente a enzima, incubar a solução para 1 h à temperatura ambiente.
    Nota: Vesículas sem o tratamento catboxypeptidase A foram utilizados como controle.
  5. Analise amostras por eletroforese na presença de sulfato dodócia de lítio. Adicionar 5-10 μL de 150 mg/mL de lítio dodecyl sulfato, 450 mg/mL glicerol, 0,1 mg/mL bromehenol azul, 0,4 M Tris pH 7,5 a 100 μL de amostra.
  6. Realize imunobofinos colocando um filtro nitrocelulose umedecido com 25 mM de sódio-hidrogênio fosfato pSH 7.5 sobre o gel de poliacrilamida. Coloque estes entre dois filtros de celulose umedecido e, finalmente, entre duas almofadas de lavagem de plástico umedecido. Coloque esta montagem entre os eletrodos de uma câmara contendo 25 mM de sódio-hidrogênio fosfato pS7.5 a 2-4 °C.
  7. Permitir que a eletrotransferência de proteínas prossiga para 3 h a 20 V e 2-3 A.
  8. Bloqueie a membrana nitrocelulose durante a noite a 2 °C em um buffer de bloqueio de 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 e 0,5 mg/mL Tween 2033.
  9. Incubar o filtro nitrocelulose por 2 h com uma diluição de 1:5000 de anticorpo anti-seu (terminal C)-HRP no tampão de bloqueio (20 mL) e lave duas vezes com 50 mL de buffer para um total de 60 min.
  10. Para visualizar a imunoblota, dissolva 6 mg de 4-cloro-1-naphthol em 20 mL de álcool desnaturado e adicione 80 mL de 15 mM Tris pH 7,5 e 50 μL de 30% H2O2. Banhe o papel de filtro na solução de substrato por 20 min. O reagente reagirá com o anticorpo para formar um precipitado azul na membrana nitrocelulose. Quando a cor suficiente se desenvolveu, lave a membrana com água, e deixe secar.

5. Ensaio de transporte

  1. Incubar 100 μL alíquotas de vesículas de membrana a 12 °C por 5 min.
  2. Inicie o transporte adicionando poliaminas radioetiquetadas às vesículas da membrana em uma concentração final de 50 μM (salvo indicação de outra maneira). Faça 3soluções de substrato H (espermidina ou putrescine) em um amortecedor de ensaio consistindo de 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosfato de potássio, pH 8.0 e 0,14 M KCl23 (Buffer 3) com modificações dependendo do ensaio.
  3. Realizar ensaios de transporte para 1 min a 12 °C em tubos de microfúgios de 1,5 mL.
  4. Após 1 min, transfira as misturas de reação para filtragem de filtragem e filtre através de um filtro de membrana nitrocelulose de 0,45 μm.
    1. Adicione 3 mL de buffer de ensaio gelado contendo uma concentração 10 vezes maior de poliaminas não rotuladas, seguida por 3 mL de amortecedor de ensaio sem as poliaminas para reduzir a ligação inespecífica.
    2. Transfira os filtros lavados para frascos de cintilação descartáveis de 20 mL contendo 10 mL de líquido de cintilação e determine a radioatividade usando um contador de cintilação líquida. O contador de cintilação mede a radioatividade na amostra e relata-a como desintegrações por min (dpm).
  5. Calcule a captação líquida de poliamina como a diferença entre a captação de 1 min por vesículas incubadas a 12 °C e captação de 0 min por vesículas incubadas no gelo.
    Nota: A massa de substrato importado para as vesículas é calculada da seguinte forma. Se o volume da amostra no tubo de microfúgio é de 0,2 μL e a concentração inicial de substrato é de 100 μM, então a massa total de substrato no tubo de microfúgio é de 20 x 10-12 M. Devido à atividade específica muito alta de substratos rotulados comercialmente (muitas vezes 2,22 x 109 dpm/mM) a massa do isótopo adicionado pode ser ignorada no cálculo. Então, se a quantidade total de isótopoque foi adicionado ao tubo de microfúgio foi de 100 x 106 dpm e as vesículas tiveram uma captação líquida de 1.000 dpm, então a massa total de substrato supérfluo foi de 1% do número total de toupeiras de substrato ou 2 x 10-13 M.
    1. Determine Km para o substrato medindo a captação de 10, 25, 50, 250 e 500 μM substrato radioetiquetado em vesículas expressando a proteína alvo. Calcule a cinética Michaelis-Menten usando um método de regressão não linear usando o modelo Michaelis Menton do pacote de software estatístico34.
  6. Para os experimentos de competição, adicione 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM ou 2 mM substrato competitivo não rotulado feito no buffer de ensaio para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 100 μL de vesículas a 12 °C.
    1. Adicione poliamina com rótulo de rádio (50 μM) ao tubo de microcentrífuga simultaneamente.
    2. Medir a radioatividade presa dentro das vesículas, como mencionado acima, repetindo passos 5 a 5,4,2.
    3. Determine a aparente Km (Km,app)para os substratos competitivos medindo a captação de 10, 25, 50, 250 e 500 μM poliaminas radiorotuladas na presença de 100 μM ou substratos não rotulados superiores e usando um método de regressão não linear para traçar a curva.

Resultados

Os principais passos neste protocolo são resumidos pictoally na Figura 1. Resumidamente, as células De E. coli deficientes em todos os trocadores de poliamina e expressando AtBAT1 são cultivadas, centrífugas, lavadas com um tampão e submetidas a lise celular usando uma imprensa francesa. Lise tende a produzir vesículas que são na sua maioria de dentro para fora e prender o tampão fora das células. Os detritos celulares são removido...

Discussão

No presente estudo, descrevemos um método para a caracterização de um antiporter, primeiro expressando a proteína em E. coli e, em seguida, gerando vesículas de membrana, de modo que a proteína expressa heterologously pode ser amenizado em um sistema livre de células. Além de equipamentos encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular, esta estratégia requer o uso de uma imprensa francesa, uma ultracentrífuga e acesso a uma instalação para realizar ensaios de radioisótopos.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O suporte para este projeto veio da FACULDADE de Pós-Graduação BGSU e do Escritório de Programas e Pesquisapatrocinados da BGSU.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3H-putrescinePerkinElmerNET185001MC
3H-spermidinePerkinElmerNET522001MC
4-chloro-1-naphtholSigma-AldrichC8890
14C arginineMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibodyThermoFisherR931-25Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
ArabinoseSigma-AldrichA3256
BCA protein assay kitThermoFisher23227Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blueBio-Rad161-0404
Carboxypeptidase BSigma-AldrichC9584-1mg
CentrifugeSorvallSS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinderLabGenome7777-7Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275scintillation cocktail
EDTASigma-Aldrich
Filtration manifoldHoeferFH225V
French Pressure CellGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
GlutamateSigma-AldrichG6904
Glycerol
GraphPad Prism softwarehttp://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxideKROGER
Potassium ChlorideJ.T. Baker3040-01
Liquid scintillation counterBeckmanLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
Nitrocellulose membrane filtersMerck Milliporehawp025000.45 µM
PCR clean up kitGenscriptQuickClean II
Potassium Phosphate dibasicThermoFisherP290-500
putrescinefluka32810
Potassium Phosphate monobasicJ.T.Baker4008
SpermidineSigma-aldrichS2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10This manuscriptAvailable upon request.Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-baseResearch ProductsT60040-1000
UltracentrifugeSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubesThermoFisher45237Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway expression vector for E. coli

Referências

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. . P1vir phage transduction Available from: https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011)
  29. . pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010)
  30. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a laboratory Manual. , (2012).
  31. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  32. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  33. . GaphPad Software Available from: https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019)
  34. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  35. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  36. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  37. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  38. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  39. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  40. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  41. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  42. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Bioqu micaEdi o 154Transportador de membranaantiportertransporte de poliaminatrocador de poliaminaves culas de membranaimprensa francesaan lise cin ticaensaios de transporte de radiois toposGABA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados