대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

요약

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

초록

새로운 멤브레인 수송기를 기능적으로 특성화하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 폴리 아민은 모든 유기체에서 유비쿼터스이지만 식물의 폴리 아민 교환기는 확인되지 않았습니다. 여기서, 우리는 대장균 세포의 용해로부터 생성된 막 소포를 이용하여 폴리아민 항균제를 이종적으로 발현하는 식물 항균제를 특성화하는 방법을 간략하게 설명한다. 첫째, 우리는 이질적으로 폴리아민 및 아르기닌 교환 수송기결핍된 대장균 균주에서 AtBAT1을 표현하였다. 소포는 프랑스 프레스를 사용하여 제조되었고, 초원심분리에 의해 정제되고, 수송기의 기질 특이성을 입증하기 위해 표지된 기판의 멤브레인 여과 분석에서 활용하였다. 이 검역은 AtBAT1이 아르기닌, γ-아미노부티르산(GABA), 푸레신 및 스페르미딘의 양성자 매개 수송기임을 입증했습니다. AtBAT1의 분석을 위해 개발된 돌연변이 균주는 식물 및 동물 폴리아민 교환기의 다른 패밀리의 기능 분석에 유용할 수 있다. 우리는 또한 이 단백질이 세균성 세포막에서 표현될 수 있는 한, 이 접근이 antiporters의 많은 그밖 모형을 특성화하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 가설합니다. 대장균은 토착 수송기를 돌연변이시키는 데 사용할 수 있는 여러 가지 방법이 있기 때문에 새로운 운송업자의 특성화에 좋은 시스템입니다.

서문

대사 산물의 인신 매매에 관여하는 단백질은 생리적 조절의 필수적인 수준을 구성하지만, 식물 막 수송자의 대부분은 아직 기능적으로 특성화되지 않았습니다. 새로운 수송 단백질을 특성화하기 위해 몇 가지 전략이 구현되었습니다. 대장균 및 효모, 제노푸스 난소, 포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포와 같은 모델 유기체에서의 이종 발현은 모두 그들의 수송 활성을 결정하는 데 사용되어 왔다^1. 진핵 세포는 진핵 단백질의 발현을 위해 선호되는데, 왜냐하면 기본 세포 조성, 신호 변환 경로, 전사 및 번역 기계는 기본 조건과 호환되기 때문이다.

효모는 식물에서 새로운 수송 단백질의 특성화를 위한 중요한 모델 유기체였습니다. 효모(Saccharomyces pombe)에서성공적으로 발현된 최초의 식물 수송 단백질은 클로렐라^2에서헥소스 수송기 HUP1이었다. 그 이후, 많은 식물 수송 단백질은 효모 발현 시스템을 사용하여 기능적으로 특징지어졌다. 여기에는 식물 성 당 수송기 (SUC1 및 SUC2^3,VfSUT1 및 VfSTP1⁴⁾및 보조 수송기 (AUX1 및 PIN^5)가포함됩니다. 효모를 식물 성 단백질을 발현하기 위해 활용하는 단점은 효모가 이 소기관이 부족하기 때문에 석고 국소화 단백질의 활성이 손상될 수 있으며, 잘못^접힌응집체의 형성 및 막 단백질의 과발현으로 인한 효모의 응집력 의 활성화^7,8,9.

제노푸스 난모세포에서 의 수송 단백질의 이종발현은^{수송기(10)의}전기생리학적 특성화에 널리 사용되어 왔다. 제노푸스 난소에서 이종발현을 이용한 제1 식물 수송 단백질은 애기장대 칼륨 채널 KAT1¹⁰ 및 애기장대 헥소스 수송기 STP1^11이었다. 그 이후, 제노푸스 난모세포는 혈장막 수송기^12,공병수크로오스 수송기 SUT4¹³ 및 백공말레이 수송기 ALMT9^14와같은 많은 식물 수송 단백질을 특성화하기 위해 사용되어 왔다. 수송 측정을 위한 제노푸스 난모세포의 중요한 제한은 세포내 대사산물의 농도가 조작될 수 없다는 것입니다^1. 더욱이, 제노푸스 난모세포를 준비하기 위해서는 전문적인 지식이 필요하며, 난모세포 배치의 가변성은 제어하기 어렵다.

모델 유기체 인 대장균에서의 이종 발현은 새로운 식물 수송 단백질의 특성화 측면에서 이상적인 시스템입니다. 완전히 서열화된 게놈^15를사용하면 대장균의 분자 및 생리학적 특성이 잘 알려져 있다. 분자 도구와 기술은 잘 설립¹⁶. 또한, 상이한 발현 벡터, 비병원성 균주 및 돌연변이체는^17,18,19. 또한, 대장균은 높은 성장속도를 가지고 있으며 실험실 조건하에서 쉽게 재배할 수 있습니다. 많은 단백질은 대장균^9에서다량으로 쉽게 발현 및 정제될 수 있다. 세포 시스템에서 단백질을 직접 분석할 수 없을 때, 단백질을 리포솜으로 재구성하는 것은 또한 성공적이었습니다, 정제된 막 단백질의 특성화를 위한 도전적인 혁신이기는 하지만. 대두, 옥수수, 쌀 및 애기장대의 인산수송기, 디카르복실레이트-트리카르복실레이트 캐리어 등의 용질 수송기를 포함하는 식물 미토콘드리아 수송 단백질의 기능적 특성은 이 모델 시스템^20,21을사용하여 달성되었다. 그러나, 토마토 단백질 SICAT9의 재조합 단백질은 재구성 실험에서 비기능성 인 것으로 나타났으며, CAT 수송기 패밀리의 다른 구성원은 제노푸스 난모세포 검소^22에서비기능성인 것으로 나타났다. 따라서 멤브레인 수송기의 특성화를 위해 추가적인 분자 도구가 필요합니다.

5 개의 폴리 아민 수송 시스템은 대장균^23에서발견된다. 그들은 정자와 퍼트린의 섭취를 중재 두 ABC 수송을 포함, 퍼트린 / 오르니틴 교환기, 시체 / 리신 교환기, 정자 수출 및 퍼트린 수입. 상기 푸트르신 교환기 PotE는 원래 소포 분석을 사용하여 특징지어졌으며, 여기서 내부 소포는 프랑스 프레스로 세포를 포하하고 오르니틴^24에대한 대가로 소포내로 방사성 발염된 푸트르신의 섭취를 측정함으로써 제조되었다. 소포 분석또한 양성자 구배^25에응하여 칼슘의 수송을 중재한 칼슘 수송기를 특성화하기 위하여 이용되었습니다. 이 실험은 우리가 다른 폴리 아민 교환기의 특성화를위한 전략을 개발하도록 자극했다. 우리는 먼저 PotE 및 CadB 교환기에서 대장균 결핍의 변형을 만들었습니다. 여기서, 우리는 변형된 대장균 균주에서 이질적인 발현에 의한 식물 폴리아민 항균제의 기능적 특성화, 프랑스 프레스를 이용한 막 소포의 생성, 및 방사성 표지된 세포사이다.

프로토콜

1. P1 전이로 돌연변이를 두 배로 노크하는 대장균의 생성

1. 대장균 단일 녹아웃 돌연변이 균주 인 대장균 유전 스톡 센터(http://cgsc.biology.yale.edu)로부터 ΔPotE 및 ΔCadB를 획득합니다.
   참고: ΔPotE 균주는 카나마이신 내성^26이고 ΔCadB 균주는 테트라사이클린 내성^27입니다.
2. P1 변환^{프로토콜(28)을}사용하여 PotE/CadB 이중 녹아웃(DKO) 변형을 구성합니다.
   1. 리세이트 준비
      1. 신선한 LB (1:100)에 ΔPotE의 하룻밤 배양을 10-25 mM MgCl_2,5 mM CaCl_2,및 0.1-0.2 % 포도당으로 보충하였다.
      2. 1-2 시간 동안 37 °C에서 자랍니다.
      3. 40 μL의 P1 파지 를 배양에 첨가하고, 37°C에서 계속 성장한다. 문화가 용해 될 때까지 1-3 시간 동안 모니터
         참고 : 문화가 lysed 되면, 세포 파편은 튜브에서 볼 수 있으며, 배양은 탁도의 상당한 손실을 해야합니다.
      4. 용해염과 소용돌이에 클로로폼 (50-100 μL)을 여러 방울 떨어뜨립니다. 12,000 x g의 원심분리기를 2분 간 사용하여 세포 이물질을 제거하고 상급물질을 신선한 튜브로 옮긴다.
   2. 변환
      1. LB 배지에서 하룻밤 동안 ΔCadB 변형을 성장시다.
      2. 4,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리하여 세포를 수확하고 1/5-1/3에서 수확 된 배양량을 100 mM MgSO₄ 및 5 mM CaCl_2로보충하여 신선한 LB에서 다시 중단합니다.
      3. 1.2.1.4 단계에서 파지와 함께 튜브에 ΔCadB 셀 현탁액을 추가하고 빠르게 혼합하십시오.
      4. 1 M Na-감산염(pH5.5)의 200 μL을 추가한 다음, 항생제 내성 마커의 발현을 허용하기 위해 37°C에서 37°C에서 인큐베이트1 mL을 첨가한다.
      5. 4000 x g에서 5 분 동안 세포를 돌루.
      6. 100 μL LB에서 100 mM Na-Citrate (pH 5.5)와 와류를 잘 사용하여 세포를 분산시다.
      7. LB 한천 플레이트에서 50 μg/mL 카나마이신 및 10 μg/mL 테트라사이클린이 있는 재조합 균주를 선택한 다음, 적절한 프라이머^26,27로폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 확인합니다.
      8. 시퀀싱을 통해 PCR 조각을 확인합니다.

2. 대장균 돌연변이의 표적 유전자 (AtBAT1)의 발현

1. PCR에 의해 표적 유전자의 전체 길이 서열을 증폭하고 게이트웨이 엔트리 벡터 pENTR/D-TOPO^29에삽입합니다.
   참고: 이 경우 ATBAT1.1은 전진 프라이머 5'CGGCGATATCAATTGTT 및 역프라이머 5'GCTAGAATGTGGAGATGG를 사용하여 증폭되었다, 98°C에서 2분 동안 초기 변성 및 0.1분 동안 98°C에서 30사이클의 변성, 0.3분 동안 59°C에서 어닐링, 72°C에서 0.40분, 72°C에서 10분 동안 최종 연장. PCR 제품은 분광계를 사용하여 정량화된 PCR 정리 키트를 사용하여 정제되었습니다. 게이트웨이 벡터에 PCR 제품을 삽입한 후 제조자 지시에 따라 수행하였다.
   1. 열 충격에 의해 유능한 Top10 대장균 세포로 입력 벡터를 변환하고 표준 분자 클로닝 프로토콜^30에따라 50 μg / mL 카나마이신으로 LB 미디어에서 성공적인 재조합제를 선택하십시오.
   2. 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 제조사의 지시에 따라, 그리고 서열로 정확한 삽입을 확인한다.
2. 표적 유전자를 E. coli 대상 벡터로 전송하여, pBAD-DEST49에 의해 게이트웨이 LR 클로닝에 의해 발현^{벡터(29)를}생성한다.
   1. 발현 벡터를 30초 동안 히트쇼크로 유능한 Top10 E. 대장균 세포로 변환하고 100 μg/mL ampicillin^30으로LB 미디어에서 성공적인 재조합제를 선택한다.
   2. 플라스미드^DNA(30)를 추출하고 서열은 정확한 삽입을 확인한다.
3. 식 벡터를 대장균 ΔpotE740(del):kan, ΔcadB2231::Tn10으로 변환하고 암피실린, 카나마이신 및 테트라사이클린^30이있는 LB 플레이트에서 선택합니다.
4. 유도를 위한 아라비노스의 최적 농도를 결정하기 위해, 설명된 바와 같이 아라비노스의 그라데이션 농도를 LB 매체에서 아라바드 프로모터의 제어하에 표적 유전자를^{발현한다.}
5. 세포 펠릿을 수집하고 제품 매뉴얼^29에기재된 바와 같이 SDS-PAGE 및 단백질 밴드의 시각화에 의한 단백질 발현을 평가한다.
   참고: 대장균 ΔpotE740(del):kan, ΔcadB2231:Tn10은 BAT1 발현 없이 대조군 샘플로 사용하였다. E.coli 이중 녹아웃 돌연변이 세포를 빈 pBAD-DEST49 벡터로 녹아웃하는 벡터 내의 ccdB 유전자의 존재로 인해 대조군으로 사용되지 않았다.

3. 인사이드 아웃 멤브레인 소포 생성

1. 대장균 돌연변이 세포를 배양하여 단일 콜로니를 밤새 5 mL의 폴리아민 무염배지(글리세롤 2%,_K2HPO 4g,_KH2PO_4,NaCl 0.5 g) 3g에서 하룻밤 동안 성장시킴으로써 표적 단백질을 배양하고, NH₄Cl, 티아민 50 mg, 0.79 g 효모 완전 합성 배지 아데닌 헤미술페이트 (10 mg/L), L-아르기닌 (50 mg/L), L-아스파르트산 (80 mg/L), L-히스티딘 하이드로 염화물 모노 하이드레이트 (20 mg / L), L-류신 (100 mg / L), L-리신 염산염 (50 mg / L), L-메티오닌 (20 mg / L), L-페닐알라닌 (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-트립토판 (50 mg/L), L-티로신 (50 mg/L), L-발 린 (140 mg/L), 우라실 (20 mg/L)). 이 배양을 0.0002% 아라비노스로 보충한 폴리아민 프리 배지의 500 mL로 옮기고 세포 배양이 0.6-0.8의 OD_600에 도달할 때까지 성장한다(보통~5시간).
2. 4°C에서 15분 동안 2,000 x g에서 원심분리에 의해 세포 펠릿을 수집합니다. 펠릿을 다시 일시 중단하고 0.1 M 칼륨 인산완충액, pH 6.6, 10 mM EDTA (Buffer 1)를 함유하여 세 번 세척한다. 세 번째 스핀 후 버퍼 1의 셀의 최종 부피는 10 mL이어야 합니다.
3. 35 mL 프렌치 압력 셀을 사용하여 손상되지 않은 세포의 프렌치 프레스 처리 (10,000 p.s.i.)에 의해 내부 아웃 막 소포를 생성합니다.
4. 샘플을 표준 프렌치 압력 셀에 로딩하기 전에 피스톤과 O-링을 윤활하여 셀에 쉽게 삽입할 수 있도록 합니다.
   참고:이 지침은 표준 압력 셀의 사용에 따라 다릅니다.³¹.
   1. 셀의 아래쪽 끝에 클로저 플러그를 조심스럽게 나사로 조입니다. 셀의 측면에 있는 글자위에 따라 셀이 오른쪽 위로 올라오도록 합니다. 피스톤을 셀에 삽입하고 피스톤의 최대 충진 선이 피스톤 의 상단에 도달할 때까지 셀로 이동합니다. 장치를 뒤집고 제공된 스탠드에 세 개의 기둥 사이에 놓습니다.
   2. 셀 현탁액을 세포의 몸에 붓습니다.
      참고: 우리는 단지 10 mL를 사용하고 있다, 그래서 35 mL의 용량을 가진 프랑스 압력 셀 챔버에 남아있는 충분한 공간이있을 것입니다.
   3. 표준 압력 셀을 프랑스 압력 셀 장치에 장착합니다.
      1. 먼저 전원이 꺼져 있는지 확인합니다. 패널의 왼쪽에는 비율 선택기 스위치가 있습니다. 그것은 세 가지 위치가 있습니다 : 실행의 끝에 아래로, 더 작은 압력 셀을 사용하기위한 낮은, 표준 프랑스어 압력 셀과 함께 사용하기 위해 높음. 프랑스 프레스가 이전에 더 작은 셀과 함께 사용된 경우 피스톤은 완전히 후퇴되지 않을 수 있습니다. 이 스위치를 아래로 설정합니다.
   4. 장치 뒷면의 RHS 스위치를 사용하여 기기를 켜고 일시 중지 실행 스위치를 실행 위치로 돌립니다. 이렇게 하면 피스톤이 완전히 후퇴됩니다. 스위치를 일시 중지로다시 이동하고 기기를 끕지 로 끕을 끕지 입니다.
   5. 엄지 나사를 풀고 스테인리스 스틸 컬럼 두 개에 이르는 안전 클램프를 옆으로 이동합니다. 그것은 오른쪽으로 스윙합니다. 한 손으로 클로저 플러그의 베이스를 제자리에 놓고 양손으로 프랑스 압력 셀을 선택하고 180 °로 회전하면 피스톤이 똑바로 서 있습니다. 플랫폼에 놓고 안전 클램프를 제자리에 다시 이동하여 이 클램프가 프랑스 압력 셀을 제자리에 고정하도록 합니다.
   6. 밸브를 자유롭게 돌수 있도록 클로저 플러그의 흐름 밸브 어셈블리를 작동기및 위치에 두어야 합니다. 시계 반대 방향으로 몇 번 회전하여 유량 밸브 어셈블리를 엽니다. 피스톤의 팔을 2시 방향과 8시 위치에서 향하도록 배치합니다. 표준 압력 셀이 제자리에 고정되도록 엄지 나사를 조입니다.
   7. 샘플 콘센트 튜브를 클로저 플러그에 삽입하고 유연한 튜브의 짧은 조각을 연결하여 깨진 셀 파편을 매 튜브에서 수집 할 수 있습니다. 우리는 보통 300 mL 의 얼음으로 채워진 비커를 사용하여 팔콘 튜브를 똑바로 잡고 세포 파편을 차갑게 유지합니다.
   8. 일시 중지 실행 스위치가 일시 중지로설정되어 있고 밸브 어셈블리가 열린 위치에있는지 확인합니다. 기기를 다시 켜고 비율 선택기 스위치를 높음으로바꿔 서 전면 패널의 압력 증가 밸브를 반 회전쯤 오른쪽으로 돌립니다.
   9. 피스톤은 챔버의 공기를 대체하기 위해 기지에서 상승하기 시작합니다. 샘플 출구 튜브에 부착된 타이곤 튜브에서 나오는 공기를 비커의 튜브로 직접 연결합니다.
   10. 액체의 첫 번째 방울이 나올 때 시계 방향으로 돌려 흐름 밸브 어셈블리를 닫습니다. 이것은 압력 셀과 함께 금속 밀봉에 금속을 생성하므로 과도하게 조이지 마십시오.
   11. 프랑스 프레스의 전면은 압력 셀 내부의 생물학적 세포에 적절한 압력을 생성하는 전면 패널에 차트가 있습니다. 이 경우 게이지가 640 psi에 도달할 때까지 압력 증가 밸브를 시계 방향으로 돌려 압력을 높입니다. 이것은 10,000 psi의 내부 압력을 만들 것입니다.
   12. 셀이 목표 압력에 도달하면 시계 반대 방향으로 회전하여 유량 밸브 어셈블리를 약간 엽니다. 밸브의 개구부를 조정하여 분당 약 10방울의 유량을 허용합니다.
   13. 피스톤 본체의 정지선이 유동 셀의 상단에 도달하면. 일시 중지 실행 스위치를 일시 중지로전환합니다. 이는 피스톤을 셀에 더 멀리 삽입하면 장치가 손상될 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 유량 밸브 어셈블리를 열고 나머지 방울을 수집합니다.
   14. 비율 선택기를 아래로전환한 다음 일시 중지 실행 스위치를 실행으로설정합니다. 바닥 판이 완전히 리트랙팅되면 실행 스위치를 일시 중지로설정하고 기기를 끕니다.
   15. 프렌치 프레스에서 프렌치 압력 셀을 제거하고 청소를 위해 분해합니다. 글리세롤의 가벼운 덮개로 모든 부품을 건조 보관하십시오. 개스킷이나 씰을 제거하고 마모 징후로 교체하십시오.
5. 4 °C에서 15 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리에 의해 프랑스 프레스 용리액의 끊어지지 않은 세포 및 세포 파편을 제거하십시오. 펠릿을 버리고 초원심분리관으로 상급체를 옮김시 옮김을 옮김시 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 버린다.
6. 펠릿 멤브레인 소포는 4°C에서 1시간 동안 150,000 g의 초원심분리에 의해 생성된 상급체로부터의 소포를 생성한다.
7. 1mMM 트리스-말레산염, pH 5.2에서 0.14 M KCl, 2 mM2-메르카페탄올 및 10% 글리세롤을 함유하고, Dounce 조직 분쇄기를 사용하여 동일한 완충제(Buffer^2)에서 재중단하여 멤브레인 소포를 재서스펜션 없이 한 번 세척한다. 전형적으로 배양500 mL로부터의 막 분획은 5 mL의 완충액에서 현탁될 것이고, 바이오친산^{분석(32)을}이용하여 막 단백질/mL의 5-10 mg의 농도이다.
8. 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 -80°C에서 멤브레인 제제의 100 μL aliquots를 저장합니다.

4. 서부 블롯 과 수송 분석의 방향

1. 30 mM Tris pH 7.8 + 0.1 mM CoCl_2에서3.7 단계에서 소포를 세척하고 다시 일시 중단하십시오.
2. 100 μL 샘플에 0.1 M NaCl, 30 mM Tris, 0.2 mM CoCl₂ pH 7.8에 2 mg/mL 카르복시펩티다아제 A 1 μL을 추가합니다.
3. 20°C에서 20분 간 인큐포밍합니다. 0.5 M NaEDTA, 0.5 M 2-메르카포에탄올 pH 7.5의 5 μL을 첨가하여 소화를 중지합니다.
4. 효소를 완전히 비활성화하려면 실온에서 1 시간 동안 용액을 배양하십시오.
   참고: catboxypeptidase A 처리가 없는 소포는 대조군으로 사용되었습니다.
5. 리튬 도데실 황산염이 있는 경우 전기 영동에 의한 시료를 분석합니다. 5-10 μL의 150 mg/mL 리튬 도데실 황산염, 450 mg/mL 글리세롤, 0.1 mg/mL 브로모페놀 블루, 0.4 M Tris pH 7.5 ~ 100 μL의 시료를 추가합니다.
6. 폴리아크릴아미드 겔상에 25 mM 나트륨-수소 인산염 pH 7.5로 적신 니트로셀룰로오스 필터를 놓음으로써 면역블롯을 수행한다. 두 개의 축축한 셀룰로오스 필터 사이에 이 필터를 놓고 마지막으로 두 개의 축축한 플라스틱 수세미 사이에 놓습니다. 25 mM 나트륨-수소 인산염 pH 7.5를 함유하는 챔버의 전극 사이에 2-4°C에 이 조립체를 놓는다.
7. 단백질의 전기 전달이 20 V 및 2-3 A에서 3 시간 동안 진행되도록 하십시오.
8. 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 및 0.5 mg/mL 트웬 20^33의차단 완충액에서 2°C에서 밤새 니트로셀룰로오스 멤브레인을 차단한다.
9. 니트로셀룰로오스 필터를 2시간 동안 인큐베이션하여 안티-히(C 단말)-HRP 항체를 차단 완충제(20 mL)에서 1:5000 희석하고 총 60분 동안 50 mL의 완충제로 2회 세척한다.
10. 면역 블롯을 시각화하려면 변성 알코올 20 mL에 4 클로로-1-나프톨 6 mg을 용해시키고 15 mM Tris pH 7.5 및 30 % H₂O_2의80 mL을 추가하십시오. 20 분 동안 기판 용액에 여과지를 목욕. 시약은 니트로셀룰로오스 막상에 청색 침전제를 형성하기 위해 항체와 반응할 것이다. 충분한 색상이 발생하면 멤브레인을 물로 헹구고 건조시키십시오.

5. 교통 분석

1. 12°C에서 막 소포의 100 μL aliquots를 5분 동안 배양한다.
2. 50 μM의 최종 농도에서 막 소포에 방사성 라벨폴리아민을 첨가하여 수송을 시작합니다 (달리 명시되지 않는 한). 10 mM Tris-HCl, 10 mM MM 칼륨 인산염, pH 8.0 및 0.14 M KCl²³ (버퍼 3)으로 구성된 분석 버퍼에서 ³개의 H 기판 (스페르미딘 또는 퍼크레시네) 용액을 분석에 따라 변형합니다.
3. 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브에서 12 °C에서 1 분 동안 수송 검정을 실시하십시오.
4. 1분 후, 반응 혼합물을 여과 매니폴드로 옮기고 0.45 μm 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 통해 여과한다.
   1. 라벨이 지정되지 않은 폴리아민의 10배 높은 농도를 함유하는 얼음-차가운 분석 버퍼 3 mL를 추가하고 폴리아민없이 3 mL의 분석 버퍼를 추가하여 비특이적 결합을 줄입니다.
   2. 세척된 필터를 10 mL의 송신액을 함유하는 일회용 송광 바이알로 옮기고 액체 침전 카운터를 사용하여 방사능을 결정합니다. 진미 카운터는 샘플의 방사능을 측정하고 분당 붕괴 (dpm)로보고합니다.
5. 순 폴리아민 섭취량을 12°C에서 배양한 소포에 의해 1분에서 의 섭취량과 얼음 에 배양된 소포에 의해 0분에서 의 한 반차의 차이로 계산한다.
   참고: 소포내로 수입되는 기판의 질량은 다음과 같이 계산된다. 마이크로퍼지 튜브내의 시료 부피가 0.2 μL이고 기판의 시작 농도가 100 μM이면, 마이크로퍼지 튜브내의 기판의 총 질량은 20 x^10-12 M이다. 상업적으로 표지된 기판의 매우 높은 특이적 활성(종종 2.22 x 10⁹ dpm/mM)으로 인해 추가된 동위원소의 질량은 계산에서 무시될 수 있다. 따라서 마이크로퍼지튜브에 첨가된 동위원소의 총량이 100 x 10⁶ dpm이고 소포가 1,000 dpm의 순 섭취량을 가졌다면, 소포에 의해 채택된 기판의 총 질량은 기판의 총 두더지 수의 1% 또는 2 x^10-13 M이었다.
   1. 표적 단백질을 발현하는 소포내로 10, 25, 50, 250 및 500 μM의 기판을 측정하여 기판에 대한 K_m을 결정한다. 통계소프트웨어^{패키지(34)의}마이클리스 멘톤 모델을 이용한 비선형 회귀 방법을 사용하여 마이클리스-멘텐 역학을 계산한다.
6. 경쟁 실험을 위해, 12°C에서 소포100 μL을 함유하는 1.5 mL 마이크로센트리퓨지 튜브에 분석 버퍼로 만든 100 μM, 500 μM, 1mMMM, 1.5 mMM 또는 2 mMM 비라벨경쟁기판을 첨가한다.
   1. 방사성 표지폴리아민(50 μM)을 미세원심지 튜브에 동시에 추가합니다.
   2. 5단계부터 5.4.2단계까지 반복하여 위에서 언급한 소포 내부에 갇힌 방사능을 측정합니다.
   3. 100 μM 이상의 비표지 기판이 있는 경우 10, 25, 50, 250 및 500 μM의 전파표지 폴리아민의 섭취량을 측정하고 비선형 회귀 방법을 사용하여 곡선을 플롯하여 경쟁기판에 대해 명백한 _{Km(K m,app)을}결정한다.

결과

이 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에그림으로 요약되어 있습니다. 간략하게, 대장균 세포는 모든 폴리아민 교환기에서 결핍되고 AtBAT1을 발현하여 배양되고, 원심분리되고, 완충액으로 세척하고, 프랑스 프레스를 사용하여 세포 용해를 행하였다. 용해는 주로 내부 아웃소포를 생성하고 세포 외부의 버퍼를 트랩하는 경향이있다. 세포 파...

토론

본 연구에서, 우리는 먼저 대장균에서 단백질을 발현한 다음 막 소포를 생성하여 항균제의 특성화를 위한 방법을 개략적으로 설명하여 이종발 단백질을 무세포 시스템에서 분석할 수 있도록 한다. 대부분의 분자 생물학 실험실에서 발견되는 장비 이외에, 이 전략은 프랑스 언론, 초원심분리기 및 방사성 동위 원소 검소를 실시하는 시설에 대한 액세스를 필요로합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
3H-putrescine	PerkinElmer	NET185001MC
3H-spermidine	PerkinElmer	NET522001MC
4-chloro-1-naphthol	Sigma-Aldrich	C8890
14C arginine	Moravek Inc.	MC137
Arginine	Sigma-Aldrich	A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody	ThermoFisher	R931-25	Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl group for detection
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
BCA protein assay kit	ThermoFisher	23227	Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue	Bio-Rad	161-0404
Carboxypeptidase B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Centrifuge	Sorvall		SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	scintillation cocktail
EDTA	Sigma-Aldrich
Filtration manifold	Hoefer	FH225V
French Pressure Cell	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Glutamate	Sigma-Aldrich	G6904
Glycerol
GraphPad Prism software			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide	KROGER
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Liquid scintillation counter	Beckman	LS-6500
Maleate	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters	Merck Millipore	hawp02500	0.45 µM
PCR clean up kit	Genscript		QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic	ThermoFisher	P290-500
putrescine	fluka	32810
Potassium Phosphate monobasic	J.T.Baker	4008
Spermidine	Sigma-aldrich	S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10	This manuscript	Available upon request.	Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
Ultracentrifuge	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes	ThermoFisher	45237	Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49	ThermoFisher		Gateway expression vector for E. coli