通过抗原肽和Fc-III三氧化二甲物的双功能结合阻断靶向抗体

摘要

开发抗原肽和Fc-III仿生（DCAF）的双功能结合物，是消除有害抗体的新颖方法。在这里，我们描述了DCAF1分子合成的详细方案，它可以选择性地阻断4G2抗体，以消除登革热病毒感染期间的抗体依赖增强作用。

摘要

消除生物体的有害抗体是干预与抗体相关的疾病（如登革热出血热和自身免疫性疾病）的宝贵方法。由于数千种不同表位的抗体在血液中循环，除了抗原肽和Fc-III二酰皮（DCAF）的双重功能结合外，没有通用方法被报告针对特定的有害抗体。DCAF分子的发展对靶向治疗的进展做出了重大贡献，这证明它消除了登革热病毒（DENV）感染模型中的抗体依赖增强（ADE）效应，并促进了乙酰胆碱肌无力性模型中的受体活性。在这里，我们描述了DCAF分子（DCAF1）的合成方案，该方案可以选择性地阻断4G2抗体，以在登革热病毒感染期间减弱ADE效应，并通过ELISA测定说明DCAF1与4G2抗体的结合。在我们的方法中，DCAF1通过Fc-III肽的氢化物衍生物和通过原生化学结扎（NCL）与抗原序列表达的长螺旋的重组剂结合合成。该协议已成功应用于DCAF1以及其他DCAF分子，以靶向其共生抗体。

引言

抗体在体液免疫反应中起着重要作用，对致病菌和病毒的中和^作用。然而，一些抗体表现出对生物体的有害影响，如在DENV感染期间ADE效应的交叉反应抗体和肌无力性代谢中的过度反应抗体，这是一种自身免疫性^{疾病2，3。}ADE效应由交叉反应抗体介导，使连接DENV和Fc受体的桥梁呈现^{细胞4，5，}而肌无力性是由攻击乙酰胆碱受体的过度抗体引起的在肌肉^组织6，7的细胞-细胞结之间。虽然已经开发出部分有效的方法来治疗这些^{疾病8，9，}毫无疑问，直接消除这些有害的抗体将取得进展的干预措施。

最近，DCAF分子，具有双功能组，已经开发出靶向抗体^阻断10。DCAF 是一种长肽，由 3 部分组成:1） 一个抗原部分，可以具体识别共体抗体，2） Fc-III 或 Fc-III-4C 标记强结合到抗体的 Fc 区域，以抑制 Fc 受体或补充组分蛋白， 3） 一个长 _-螺旋链接器，结合这两个功能组¹⁰。从Moesin FERM域设计的链接器部分，由Rosseta软件进行优化，以确保DCAF分子中的抗原部分和Fc-III部分可以同时与IgG的Fab和Fc区域结合。合成了4种DCAF分子，靶向4种不同的抗体，其中DCAF1用于消除4G2抗体，这是DENV感染期间的交叉反应抗体，有助于ADE效应;和DACF4被设计用于拯救乙酰胆碱受体通过阻止mab35抗体在肌无力^性10。

在本研究中，以DCAF1为例，我们展示了DCAF分子的合成和DCAF与其共生抗体相互作用的检测方案。DCAF1由NCL方法11、12、13、14半合成，将Fc-III肽的氢化物衍生物和表达的联结剂-抗原部分结合在一起。NCL 方法在 DCAF1 合成中具有与完全化学合成和完全重组表达的显著优势，因为这两种方法都会导致低产量和高成本。目前的方法不仅是获得全长DCAF的最经济有效的方法，而且还可以保持链接器部件的构象，类似于其原生形式。由于不同的DCAF分子除了抗原部分具有相似的序列，我们的DCAF1合成方法和DCAF1和4G2抗体之间的相互作用测定也可以应用于其他DCAF分子，以靶向块状阻滞其共性抗体。

研究方案

1. Fc-III肽氢化物衍生物的化学合成

1. 将 2-Cl-（Trt）-Cl 树脂转换为 2-Cl-（Trt）-NHNH₂树脂
   1. 将625mg的2-Cl-（Trt）-Cl树脂（0.25毫摩尔）重量放入25mL肽合成容器中。
   2. 从容器顶部向树脂中加入 5 mL 的 N、N-二甲基甲酰胺 （DMF），将盖子放回放回，轻轻摇动容器 15 s，然后将其排干。再重复 DMF 洗涤两次。
   3. 向容器中加入 5 mL 的二氯甲烷 （DCM），将盖子放回原位，轻轻摇动容器 15 s，然后将其排干。再重复 DCM 洗涤两次。
   4. 重复步骤 1.1.2 三次。
   5. 使用 6 mL 的 50% （vol/vol） DMF/DCM 使树脂膨胀 30 分钟，然后排空。
   6. 将 6 mL 5%（vol/vol） NH₂NH₂在 DMF 中转移到反应容器，在 120 rpm 下摇动混合物，30°C 摇动 30 分钟，然后通过真空泵排空溶液。
      注: 加入 0.3 mL 的氢化物水合物到 5.7 mL 的 DMF 获得 5% （vol/vol） NH₂NH₂.使用前应新鲜准备 NH₂NH_2。
      注意:水合物是一种危险物质，可能导致癌症。穿实验室外套、手套和口罩。在烟罩中执行实验。
   7. 向容器中加入 5 mL 的 DMF，轻轻摇动 15 s，然后排空。
   8. 重复步骤 1.1.6，然后重复步骤 1.1.2-1.1.4 两次洗涤树脂。
   9. 向容器添加 6 mL 的 5%（vol/vol）MeOH/DMF，轻轻摇动 10 分钟，然后排空。
      注:此步骤对于确保树脂上的未反应部位封顶非常重要。
   10. 通过重复步骤 1.1.2-1.1.4 彻底清洗树脂。
   11. 将 5 mL 的 DCM 添加到树脂中，轻轻摇动 15 s，然后排空以获得 2-Cl-（Trt）-NH_{NH 2}树脂。
       注:当更换成功时，树脂变为黄色或浅绿色。
2. 肽伸长
   1. 将1毫摩尔的Fmoc-Ala-OH（934毫克）和0.95毫摩尔的1-_bis（二甲基氨基）亚甲基*-1H-1，2，3-三聚一郎-[4，5-b]六氧基磷酸三氧化物（HATU）（360毫克）加入含有3 mL DMF的5 mL管中。
      注意:接触HATU可能导致过敏反应。穿实验室外套、手套和口罩。
   2. 在溶解溶液中加入2毫摩尔的N，N-二丙丙乙胺（DIEA）（0.36 mL），涡旋0.5~1分钟。
      注:关键步骤:激活时间不应超过 5 分钟，因为激活的氨基酸从更活跃的 O 型到不太活跃的 N 型。
   3. 将活性Fmoc-Ala-OH添加到含有2-Cl-（Trt）-NHNH₂树脂的反应容器中，该树脂由步骤1.1制备。在 120 rpm 转速下轻轻摇动，在恒温摇床中轻轻摇动 20 分钟，然后通过真空泵排空溶液。
   4. 加入 5 mL 的 DMF 来清洗树脂，轻轻摇动 15 s，然后排空。
   5. 将1毫摩尔的Fmoc-Ala-OH（934毫克）和0.95毫摩尔的2-（6-氯-1H-苯甲酰1-yl）-1，1，3，三-四甲基六氟磷酸（HCTU）（390毫克）加入含有3mLDMF的5 mL管中。
      注意:接触 HCTU 可能会导致过敏反应。穿实验室外套、手套和口罩。
   6. 在管子中加入2毫摩尔（0.36 mL），涡旋0.5~1分钟溶解。
   7. 将激活的 Fmoc-Ala-OH 添加到反应容器中。在 120 rpm 转速下轻轻摇动，在恒温摇床中轻轻摇动 40-60 分钟，然后通过真空泵排空溶液。
   8. 通过重复步骤 1.1.2-1.1.4 来清洗树脂。
   9. 在 DMF 中加入 4 mL 的 20%（vol/vol）烟碱，在室温下轻轻摇动 5 分钟，然后排空溶液。
      注意:硫丹是高度易燃和有毒的。在烟罩中执行实验。
   10. 在 DMF 中再加入 4 mL 的 20%（vol/vol）烟碱，在室温下轻轻摇动 15 分钟，然后排空溶液。
   11. 按照步骤 1.2.1-1.2.10 耦合并保护 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-His-OH 和 Fmoc-Ala-OH。重复步骤 1.2.5-1.2.10 耦合并保护 Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gly-OH 和 Fmoc-Asp-OH。
   12. 重复步骤 1.1.2-1.1.4 彻底清洗树脂。
   13. 重复步骤 1.1.3 洗涤树脂，然后对树脂进行真空干燥 5 分钟。
3. 氢化物衍生的Fc-III粗肽的裂解
   1. 在树脂中加入12 mL的鸡尾酒三氟乙酸（TFA）/2、2+-（乙氧基）二乙二醇（DODT）/三丙丙氨酸（TIPS）/H₂O（92.5/2.5/2.5），然后用恒温摇摇器在200 rpm转速时从树脂中分离肽。37 °C 约 2 小时，将混合物过滤到 50 mL 离心管中。
   2. 在树脂中加入 1 mL 的鸡尾酒，将其洗涤，并将滤液收集到 50 mL 的离心管中。重复两次。
   3. 将混合物在烟气罩中由vaper转子浓缩至2 mL，然后将20 mL的预冷却二乙醚加入管中，以沉淀粗肽。
      注:无水醚应预冷却至0°C，以避免剧烈热释放，这可能导致粗肽的侧反应。
   4. 在-20°C下孵育肽沉淀1-2小时。
   5. 在5000 x g、4°C下离心10分钟，并小心地从离心管中取出溶剂。
   6. 根据步骤1.3.3-1.3.5将20mL的预冷却二乙醚加入管中两次，以洗净降水。将肽产品在观察玻璃中晾干约15分钟，将干燥的粗肽储存在4°C处，以便进一步分析。
4. Fc-III肽的氢化物衍生物的纯化
   1. 使用高性能液相色谱（HPLC）系统以30分钟梯度洗脱（0-1分钟，5%B;1-20分钟，50%B;20-25分钟，85%B;25-30分钟，85%B）的流速，以1mL/min的流速纯化肽。
      注:该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。

2. 链接剂和抗原部分的蛋白质表达和纯化

1. 质粒结构
   1. 合成可以表达SUMO-链接剂抗原的整个基因序列（见材料表）。
   2. 在37°C水浴中使用NcoI和XhoI切割10 ngPET-28a空载体和50 ng合成SUMO-linker-抗原DNA片段3小时。
   3. 通过DNA凝胶提取试剂盒纯化双酶消化载体和DNA片段。
   4. 将5μL的DNA消化DNA片段、5μL的消化载体、1μL的T4DNA联带、2μL的10倍联苯缓冲液和7μL的ddH₂O加入反应管，然后在16°C下孵育过夜。
   5. 将步骤2.1.4的10μL结扎产物混合到100μL的合格细胞（DH5°）中，将其放入冰浴30分钟。将能胜任的细胞放入42°C水浴中90秒，并快速将其转移到冰浴2分钟。加入800 mLLB液体介质（不含抗生素）到管中，在37°C，180rpm1h摇动。 将能胜任的细胞涂在Kanamycin LB板上，使它们均匀分布，并将板放入37°C的培养箱过夜。
   6. 从板中挑选5个单菌落，使用37°C摇床在试管中培养5mLLB培养的细菌。
   7. 使用质粒提取试剂盒从步骤 2.1.6 中采集的细菌中提取质粒。
   8. 发送质粒进行基因测序，选择能表达SUMO-链接剂-抗原融合蛋白的正聚群。按照步骤2.1.5将阳性质粒转化为BL21（DE3）plys的合格细胞。
2. 蛋白质纯化
   1. 从步骤 2.1.7 选择单个转化剂聚位，从含有卡那霉素 （50 μg/mL） 的 LB 液体介质中选取 5 mL。在 200 rpm、37 °C 下摇动培养物过夜。
   2. 在含有5 mL过夜培养物的烧瓶中接种1L的预加热LB介质，直到OD₆₀₀为0.6。
   3. 将等丙基β-D-硫拉酮（IPTG）加入介质，最终浓度为0.4 mM，并在20°C下以200rpm在200rpm下摇动烧瓶。
      注:低温诱导对避免内含体形成很重要，因此请确保温度不超过22°C。
   4. 收获细胞后，向细胞颗粒中加入50 mL的赖沙缓冲液，以重新悬浮细胞。在200 W时，将细胞分声两次，连续5分钟，在冰上进行超声波3秒，间隔3秒。在15000 x g下在4°C下将其离心30分钟，以收集超生物。
      注: 莱沙缓冲液由 50 mM NaH₂PO₄、 300 mM NaCl、 10 mM imidazole 组成。使用 NaOH 将 pH 值调整为 8.0。
   5. 将50%Ni-NTA Sephorase的2 mL（通过赖沙缓冲液平衡）加入清除的上生子中，并通过在4°C下摇动（旋转摇床时200rpm）轻轻混合1小时。
   6. 将赖沙和 Ni-NTA 混合物装入底部出口盖盖的列中，并取下底部盖并丢弃柱流。
   7. 用6 mL洗涤缓冲液洗涤三次，然后用1.5 mL的洗脱缓冲液洗涤目标蛋白洗涤3次。在一根管子中收集埃卢特。
      注: 洗涤缓冲液由 50 mM NaH₂PO₄， 300 mM NaCl， 30 mM imidazole.使用 NaOH 将 pH 值调整为 8.0。洗脱缓冲液由50mNaH₂PO 4，300 mM NaCl，250 mM imidazole组成。使用 NaOH 将 pH 值调整为 8.0。
   8. 将脱脂蛋白放入透析袋中，在4°C下分1L的50 mM PBS，以脱盐蛋白质。更换新的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 3 次。
3. SUMO 标签的裂解
   1. 在浓度为1mg/mL的1mg/mL下加入2 mL的小泛素状修饰剂（SUMO）标记蛋白，1 mL的SUMO蛋白酶（见材料表），10xSUMO蛋白酶缓冲液和6 mL ddH₂O，以制备反应溶液。
      注:SUMO标签蛋白浓度约为1毫克/mL。酶消化后浓度过高可能导致蛋白质凝固。
   2. 在4°C下孵育混合物12-16小时。
   3. 在 4°C 下在 15，000 x g下将混合物离心 10 分钟，然后丢弃骨料。将 50% Ni-NTA 浆料的 0.5 mL（由 50 mM PBS 平衡）添加到 10 mL 清除的上生子中，并在 4°C 下摇动（旋转摇床时 200 rpm）60 分钟，轻轻混合。
   4. 将赖沙和 Ni-NTA 混合物装入底部出口盖盖的柱中。拆下底部盖，然后将流量保存到 15 mL 的离心管中。
      注: 他标记的 SUMO 蛋白在柱上结合。链接-抗原部分，从Cys开始，用于NCL反应，在流中。
   5. 在 4°C 下以 15，000 x g将流量离心 10 分钟，然后丢弃骨料。使用HPLC用25分钟梯度洗脱（0-1分钟，5%B;1-3分钟，15%B;3-20分钟，45%B;20-21分钟，85%B;21-25分钟，85%B）净化链接抗原部分，流速为1 mL/min。
      注:该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。
   6. 从HPLC收集纯化产物，然后冷冻干燥过夜，以获得链接剂抗原产品。

3. 通过原生化学结扎组装DCAF1

1. 将Fc-III肽和联结剂抗原部分结合在一起
   1. 将Fc-III肽的氢化物衍生物称重1.8毫克（1μmol），放入2 mL EP管中，在0.2M NaH₂PO 4（pH 3.0）溶液中加入0.8 mL的6M GnHCl溶液，通过涡旋将其溶解。
      注:通过使用 HCl 或 NaOH 调整 pH 值，在 0.2 M NaH₂PO₄ （pH 3.0） 溶液中制备 6 M GnHCl。
      注意:NaOH 和 HCl 具有很强的腐蚀性。穿实验室外套、手套和口罩。
   2. 在室温下，在7，200 x g下离心管1分钟后，将管子放入冰盐浴中，使用磁搅拌搅拌，轻轻搅拌溶液15分钟。
   3. 在溶液中加入40μL的0.5 M NaNO_2，以氧化氢化物组。在冰盐浴中轻轻搅拌溶液15分钟。
   4. 将步骤2.3和13.6mg的4-甲苯甲酸（MPAA）制备的11mg纯化链接剂抗原部分称重并加入冰盐浴中的反应管中，搅拌5分钟，然后在室温下将pH值调整至6.8-7.0，室温为6M NaOH。
      注: 将 pH 值调整为中性值是启动结扎反应的关键步骤。
   5. 12小时后，将0.4 mL的0.1M三分（2-碳boxyl）磷酸盐酸（TCEP）中性溶液（pH 7.0）加入反应系统，搅拌20分钟以终止反应。
      注:0.1M TCEP中性溶液（pH 7.0）通过溶解6M GnHCl中的TCEP在0.2M NaH₂PO_4（pH 3.0）溶液中，并使用NaOH将pH值调整至7.0。
   6. 在15，000 x g下将管离心10分钟，然后用HPLC分析并净化结扎产物，用26分钟梯度洗脱（0-1分钟，5%B;1-21分钟，45%B;21-22分钟，85%B;22-26分钟，85%B），流速为1 mL/min。结扎反应的预期收率超过50%。
      注:该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。
2. 共偶脱硫
   1. 在0.2 M NaH₂PO₄ （pH 7.0） 溶液中溶解从步骤3.1.6在50 μL中的6M GnHCl制备的偶联物（3.4毫克，0.3μmol）。
   2. 在上述混合物中加入50μL的1M TCEP、10μL的tBuSH和5μL的0.1M VA-044溶液。
      注:0.1 M VA-044溶液通过将9.7mg的VA-044粉末溶解成0.3 m GnHCl的0.3 m GHCl，在0.2M NaH₂PO₄ （pH 7.0） 溶液中制备。VA-044 溶液应在使用前新鲜制备，因为 VA-044 很容易因暴露于空气中而氧化。
   3. 将溶液的最终pH值调整至6.9，保持溶质37°C搅拌约5小时。
   4. 将管在15，000 x g下离心10分钟，并去除不溶性物质。以26分钟的梯度洗脱（0-1分钟，20%B;1-21分钟，45%B;21-22分钟，85%B;22-26分钟，85%B）分析并净化HPLC的结扎产物，流速为1 mL/min。脱硫反应的预期收率约为40%。
      注:该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。
3. 去除 Acm 以获得最终产品 DCAF1
   1. 溶解从步骤3.2.4在32 mM AgOAc的200μL中制备的肽（1.35mg，0.11μmol），然后在室温下搅拌反应混合物4小时。
   2. 在 0.2 M NaH₂PO₄ （pH 7.0） 溶液中加入 3 μL 的 1M 二硫酸醇 （DTT）， 将肽上的银硫酸盐转换为游离硫醇。
   3. 剧烈搅拌1分钟后，将管在15，000 x g下离心10分钟，以丢弃不溶性物质。以 26 分钟的梯度洗脱（0-1 分钟，20% B;1-21 分钟，45% B;21-22 分钟，85% B;22-26 分钟，85% B）分析并净化最终产品，流速为 1 mL/min。Acm 去保护反应的预期收率约为 30%。
      注:该柱为 4.6 mm ID，长度为 250 mm，包装有 C-18 树脂。移动阶段 A 包括 0.1% 在水中的 TFA，移动阶段 B 包括 100% 乙酰乙酸酯和 0.1% TFA。
   4. HPLC纯化后，在一夜之间冷冻干燥最终产品，并将粉末溶解在PBS（50mM NaH₂PO 4，150 mM NaCl，pH 8.0）中。在 4°C 下以 15，000 x g将管离心 10 分钟，然后丢弃颗粒。
   5. 将最终产品（从步骤 3.4）和链接剂抗原部分（从步骤 2.3.6）调整到 10 μM，使用 25°C 的 CD 光谱仪，在 25°C 和 1 mm 路径长度下，记录这两种产品的圆形双色 （CD） 光谱从 260 到 195 nm。
      注:CD光谱用于演示最终产品中的α螺旋结构与重组表示的相似量。

4. 通过质谱法检测产品

1. 将产品与每种化学反应分离 60 分钟梯度洗脱（0-8 分钟， 2% B;8-10分钟，5%B;10-35分钟，30%B;35-50分钟，50%B;50-52分钟，80%B;52-58分钟，80%B;58-59分钟，2%B;59-60分钟，2%B），流量为0.300μL/min，带1纳米HPLC系统，与高分辨率质谱仪直接接口。
   注:分析柱为75 μm ID，150毫米长，装有C-18树脂。移动A阶段包括水中0.1%的甲酸，移动阶段B包括100%乙酰乙酸和0.1%的甲酸。
2. 在全扫描模式下操作质谱仪，并将 m/z 范围设置为 300-2，000，分辨率为 60，000。
3. 打开质谱数据，找到产品在每一步的峰值，以确认化学反应已成功预成型。

5. DCAF1和4G2抗体相互作用的ELISA测定

1. 在100μL涂层缓冲液/孔中涂上1pmol抗GST抗体（见材料表）的96孔微蒂剂板，密封板并在4°C的摇床上孵育。
2. 在 PBS 中用 200 μL 的 BSA 块每口孔，密封板并在室温下在摇床上孵育 1 小时。
3. 使用 0.05% 补间 20 的 PBS 洗净每个井 4 次。
4. 将GST熔融抗原蛋白（0.05pmol在100μL的阻滞溶液中）加入井中，密封板并在室温下孵育2小时。
   注:GST熔融抗原蛋白在细菌中表达，并通过GSH塞沙罗斯纯化。
5. 重复步骤 5.3 洗盘子。
6. 在100μL的阻断溶液/孔中加入1pmol 4G2抗体或1pmol 4G2抗体加其他配体:抗原、Fc-III或DCAF1，在系列量（0.1pmol、1pmol、10pmol、100 pmol和1000 pmol）中，密封板，并在室温下在摇床上孵育2小时。
7. 重复步骤 5.3 洗盘子。
8. 在100μL的阻滞溶液/孔中加入抗小鼠IgG、HRP链接抗体（1:20，000稀释），密封板，在室温下在摇床上孵育30分钟。
9. 使用 0.05% 补间 20 的 PBS 洗好每个井 6 次。
10. 在使用前将TMB试剂A和B1:1混合在体积中，加入100μL/井，然后在室内温度下在黑暗中孵育30分钟。
11. 添加 100 μL/孔停止溶液，并使用板读取器在 30 分钟内测量每口井的 OD₄₅₀值。

6. ELISA测定Fc-III和IgG分子之间的相互作用

1. 在100μL涂层缓冲液/孔中涂上1pmol抗CA抗体（见材料表）的96孔微蒂剂板，密封板并在4°C的摇床上孵育。
2. 重复从 5.2 到 5.3 的步骤。
3. 将Fc-III或Fc-III-4C融合的CA蛋白（0.01、0.05、0.1、0.5和1pmol在100μL的阻滞溶液中）加入井中，密封板并在室温下孵育2小时。
   注:Fc-III或Fc-III-4C融合CA蛋白在细菌中表达，并通过Ni-NTA纯化。
4. 重复从 5.7 到 5.11 的步骤并检查结果。

结果

本文中原生化学结扎合成路线的流程图如图1所示。图2-6显示了Fc-III肽的化学合成氢化物衍生物的色谱图（A）和质量谱（B），重组表达链接剂和抗原部分，NCL反应的纯化产物，纯化脱硫反应产物和纯化最终产物DCAF1。色谱图显示，所有产品的纯度均超过90%，而质谱表示产品每次反应后的分子量。图3-6也反映了去量分子量，反...

讨论

此处的协议描述了使用 NCL 方法对 DCAF1 的半合成和检测，如图1所示。简单地说，DCAF1的两个片段分别进行了化学合成和重组表达;然后，对全长DCAF1分子进行组装、改性、纯化。对于氢化物衍生的Fc-III片段合成，使用低容量2-Cl树脂非常重要，因为高容量对氢化物的生成有负面影响，并导致产品产量低。链接器和抗原部分用SUMO标记表示有两个原因:第一，SUMO标记可以增强融合蛋...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Chlorotrityl resin	Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide	GL Biochem	00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate	GL Biochem	00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride	J&K Scientific	503236
4G2 antibody	Thermo	MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid	Alfa Aesar	H27658
96-well microtiter plates	NEST	701001
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
AgOAc	Sinopharm Chemical Reagent	30164324
anti-GST antibody	Abclonal	AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7076P2
BSA	Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer	Applied Photophysics Ltd
dialysis bag	Sbjbio	SBJ132636
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent	80047360
diethyl ether	Sinopharm Chemical Reagent	10009318
DNA Gel Extraction Kit	Beyotime	D0056
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
GSH Sepharose	GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride	Sinopharm Chemical Reagent	30095516
Hydrazine hydrate	Sinopharm Chemical Reagent	80070418
Hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagent	10011018
imidazole	SIGMA	12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside	SIGMA	5502-5G
kanamycin	Beyotime	ST101
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine	GL Biochem	90600
N, N-Dimethylformamide	Sinopharm Chemical Reagent	8100771933
NcoI	Thermo	ER0571
PBS buffer	Solarbio	P1022
Peptide BEH C18 Column	Waters	186003625
piperidine	Sinopharm Chemical Reagent	80104216
Plasmid Extraction Kit	Sangon Biotech	B611253-0002
QIAexpress Kit	QIAGEN	32149
Rapid DNA Ligation Kit	Beyotime	D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent	20040718
Sodium hydroxide	Sinopharm Chemical Reagent	10019762
Sodium nitrite	Sinopharm Chemical Reagent	10020018
sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent	10019318
Standard Fmoc-protected amino acids	GL Biochem
sterilizing pot	Tomy	SX-700
SUMO Protease	Thermo Fisher	12588018
stop solution	Biolegend	423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen	Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent	Biolegend	421101
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6508
Triisopropylsilane	GL Biochem	91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Aladdin	T107252-5g
tryptone	OXOID	LP0042
Tween 20	Solarbio	T8220
Ultimate 3000 HPLC	Thermo
vacuum pump	YUHUA	SHZ-95B
XhoI	Thermo	IVGN0086
yeast extract	OXOID	LP0021