Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تطوير متقارن مزدوج الوظائف من الببتيد المضاد للجينات وfc-III mimetics (DCAF) هو رواية للقضاء على الأجسام المضادة الضارة. هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لتركيب جزيء DCAF1، والتي يمكن أن تمنع بشكل انتقائي 4G2 الأجسام المضادة للقضاء على تأثير تعزيز الأجسام المضادة تعتمد خلال عدوى فيروس حمى الضنك.

Abstract

القضاء على الأجسام المضادة الضارة من الكائنات الحية هو نهج قيم لتدخل الأمراض المرتبطة بالأجسام المضادة، مثل حمى الضنك النزفية وأمراض المناعة الذاتية. منذ الآلاف من الأجسام المضادة مع النعوت مختلفة تنتشر في الدم، أي طريقة عالمية، باستثناء conjugate مزدوجة وظيفية من الببتيد المضادة للجينات وfc-III mimetics (DCAF)، وذكر لاستهداف الأجسام المضادة الضارة محددة. تطوير جزيئات DCAF يساهم بشكل كبير في تقدم العلاج المستهدف، والتي ثبت للقضاء على تأثير تعزيز تعتمد على الأجسام المضادة (ADE) في نموذج عدوى فيروس حمى الضنك (DENV) وتعزيز أستيل نشاط مستقبلات في نموذج الوهن العضلي الوبيل. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتركيب جزيء DCAF (DCAF1)، الذي يمكن أن يمنع بشكل انتقائي الأجسام المضادة 4G2 للتخفيف من تأثير ADE أثناء عدوى فيروس حمى الضنك، ويوضح ربط DCAF1 إلى 4G2 الأجسام المضادة عن طريق فحص ELISA. في طريقتنا، يتم تصنيع DCAF1 عن طريق اقتران مشتق الهيدرازين من الببتيد Fc-III ومؤتلف أعرب طويل α-اللولب مع تسلسل مضاد للجينات من خلال الربط الكيميائي الأصلي (NCL). وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة 1 وكذلك على جزيئات أخرى من قوات جنيف للرقابة على الأجسام المضادة.

Introduction

الأجسام المضادة تلعب أدوارا هامة في الاستجابة المناعية الفكاهية لتحييد البكتيريا المسببة للأمراض والفيروسات1. ومع ذلك، فإن بعض الأجسام المضادة تظهر آثار ضارة على الكائنات الحية، مثل الأجسام المضادة عبر رد الفعل في تأثير ADE أثناء عدوى DENV والأجسام المضادة المفرطة في رد الفعل في الوهن العضلي الوبيل، وهو أمراض المناعة الذاتية2،3. يتم التوسط تأثير ADE من قبل الأجسام المضادة عبر رد الفعل التي تجعل الجسر لربط DENV ومستقبلات Fc تقديم الخلايا4,5, في حين أن الوهن العضلي الوبيل هو سبب الأجسام المضادة المفرطة التي تهاجم مستقبلات أستيل بين تقاطعات الخلايا في أنسجة العضلات6،7. على الرغم من أنه تم وضع نُهج فعالة جزئياً لعلاج هذه الأمراض8و9،فإن القضاء المباشر على هذه الأجسام المضادة الضارة من شأنه أن يحرز تقدماً في التدخلات.

في الآونة الأخيرة، تم تطوير جزيئات DCAF، التي لديها مجموعات مزدوجة الوظائف، لحجب الأجسام المضادة المستهدفة10. DCAF هو الببتيد الطويل الذي يتكون من 3 أجزاء: 1) جزء مستضد التي يمكن أن تعترف محددة الأجسام المضادة كونيات، 2) علامة Fc-III أو Fc-III-4C لربط بقوة إلى منطقة Fc من الأجسام المضادة لمنع مستقبلات Fc أو تكملة البروتينات المكون ، 3) وصلة طويلة α-حلزونية التي تترافق بين هاتين المجموعتين الوظيفيتين10. تم تحسين جزء الرابط، الذي تم تصميمه من مجال Moesin FERM، من قبل برنامج Rosseta لضمان الجزء مستضد وجزء Fc-III في جزيء DCAF يمكن ربط إلى مناطق Fab وFc من IgG في وقت واحد. وقد تم تصنيع أربعة جزيئات من قوات جنيف للرقابة الديمقراطية على الرقابة على المواد النارية لاستهداف 4 أجسام مضادة مختلفة، من بينها استخدام DCAF1 للقضاء على الأجسام المضادة 4G2، وهو جسم مضاد عبر رد الفعل أثناء عدوى DENV للمساهمة في تأثير ADE. وتم تصميم DACF4 لإنقاذ مستقبلات أستيل عن طريق منع ماب35 الأجسام المضادة في الوهن العضلي الوبيل10.

في هذه الدراسة، التي أخذت DCAF1 على سبيل المثال، أظهرنا بروتوكولات لتركيب جزيء DCAF والكشف عن التفاعل بين مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة وجسمه المضاد للكونيات. وDCAF1 هو شبه توليفها من قبل نهج NCL11،12،13،14، الذي يترافق مشتق الهيدرازين من الببتيد Fc-III وأجزاء مستضد الرابط أعرب معا. وللنهج الذي تتبعه اللجنة مزايا كبيرة على التركيب الكيميائي الكامل والتعبير المؤتلف بالكامل لتوليف مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على الفي مكاف، لأن هاتين الطريقتين تؤديان إلى انخفاض الغلة وارتفاع التكلفة. النهج الحالي ليس فقط الطريقة الأكثر فعالية من حيث التكلفة للحصول على مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة، ولكن أيضا يمكن الحفاظ على مطابقة جزء الرابط مماثلة لشكله الأصلي. وبما أن جزيئات مركز جنيف للرقابة الديمقراطية على القوات المسلحة المختلفة لها تسلسلات مماثلة باستثناء أجزاء المستضد، فإن أساليبنا لتوليف DCAF1 والفحص التفاعلي بين DCAF1 و4G2 يمكن تطبيقها على جزيئات DCAF الأخرى لمنع أجسامها المضادة من الكونات أيضاً.

Protocol

1- التركيب الكيميائي لمشتق الهيدرازين لببتيد Fc-III

  1. تحويل 2-Cl-(Trt)-Cl الراتنج إلى 2-Cl-(Trt)-NHNH2 الراتنج
    1. وزن 625 ملغ من 2-Cl-(Trt)-Cl الراتنج (0.25 ملمول) في وعاء توليف الببتيد 25 مل.
    2. إضافة 5 مل من N، N-dimethylformamide (DMF) إلى الراتنج من الجزء العلوي من السفينة، ووضع الغطاء مرة أخرى، يهز بلطف السفينة لمدة 15 ق ومن ثم استنزاف. كرر غسل DMF مرتين إضافيتين.
    3. إضافة 5 مل من ثنائي كلورو الميثان (DCM) إلى السفينة، ووضع الغطاء مرة أخرى، يهز بلطف السفينة لمدة 15 ق ومن ثم استنزافه. كرر غسل DCM لمرتين إضافيتين.
    4. كرر الخطوة 1.1.2 ثلاث مرات.
    5. استخدام 6 مل من 50٪ (المجلد / المجلد) DMF / DCM لتضخم الراتنج لمدة 30 دقيقة، ومن ثم استنزافه.
    6. نقل 6 مل 5٪ (المجلد / المجلد) NH2NH2 في DMF إلى وعاء رد الفعل، يهز الخليط في 120 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم استنزاف الحل عن طريق مضخة فراغ.
      ملاحظة: إضافة 0.3 مل من هيدرات الهيدرازين إلى 5.7 مل من DMF للحصول على 5٪ (المجلد / المجلد) NH2NH2. قم بإعداد NH2NH2 طازجًا قبل الاستخدام.
      تحذير: هيدرات هيدرازين هي مادة خطرة وقد تسبب السرطان. ارتداء معطف المختبر والقفازات وقناع. إجراء التجارب في غطاء الدخان.
    7. أضف 5 مل من DMF إلى السفينة، ويهز بلطف لمدة 15 s ثم استنزافه.
    8. كرر الخطوة 1.1.6 ثم اغسل الراتنج بتكرار الخطوات 1.1.2-1.1.4 مرتين.
    9. إضافة 6 مل من 5٪ (المجلد / المجلد) MeOH / DMF إلى السفينة، يهز بلطف لمدة 10 دقيقة ثم استنزافه.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة جداً لضمان أن يتم تغطية المواقع غير المتفاعلة على الراتنج.
    10. غسل الراتنج جيدا عن طريق تكرار الخطوات 1.1.2-1.1.4.
    11. إضافة 5 مل من DCM إلى الراتنج، يهز بلطف لمدة 15 ق ومن ثم استنزاف للحصول على 2-Cl-(Trt)-NHNH2 الراتنج.
      ملاحظة: الراتنج يصبح أصفر أو أخضر فاتح عندما يكون الاستبدال ناجحاً.
  2. استطالة الببتيد
    1. إضافة 1 مليمول من Fmoc-علاء-OH (934 ملغ) و 0.95 مل من 1-[بيس(ثنائي ميثيل أمينو)ميثيلين]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] بيريدينيوم سداسي فلورو فوسفات 3 أكسيد (HATU) (360 ملغ) في أنبوب 5 مل يحتوي على 3 مل من DMF.
      تحذير: التعرض لهاتو يمكن أن يسبب رد فعل تحسسي. ارتداء معطف المختبر والقفازات وقناع.
    2. إضافة 2 مليمول من N،N-diisopropylethylamine (DIEA) (0.36 مل) إلى الحل المذاب ودوامة لمدة 0.5-1 دقيقة.
      ملاحظة: الخطوة الحرجة: يجب أن يستغرق التنشيط ما لا يزيد عن 5 دقائق، حيث أن الأحماض الأمينية المنشطة تأيزومرات من أشكال O الأكثر نشاطاً إلى أشكال N الأقل نشاطاً مع مرور الوقت.
    3. يُضاف الـ Fmoc-Ala-OH المنشط إلى وعاء التفاعل الذي يحتوي على راتنج 2-Cl-(Trt)-NHNH2، الذي تم إعداده من الخطوة 1.1. يهز بلطف في 120 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في شاكر ثابت درجة الحرارة، ومن ثم استنزاف الحل عن طريق مضخة فراغ.
    4. أضف 5 مل من DMF لغسل الراتنج، ويهز بلطف لمدة 15 s ثم استنزافه.
    5. إضافة 1 مليمول من Fmoc-Ala-OH (934 ملغ) و 0.95 مل من 2-(6-كلورو-1H-benzotriazole-1-yl)-1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate (HCTU) (390 ملغ) في أنبوب 5 مل يحتوي على 3 مل من DMF.
      تحذير: التعرض لـ HCTU يمكن أن يسبب رد فعل تحسسي. ارتداء معطف المختبر والقفازات وقناع.
    6. أضف 2 مليمول من DIEA (0.36 مل) إلى الأنبوب والدوامة لمدة 0.5-1 دقيقة لإذابة.
    7. إضافة Fmoc-علاء-OH المنشطة إلى وعاء رد الفعل. يهز بلطف في 120 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية لمدة 40-60 دقيقة في شاكر درجة حرارة ثابتة، ومن ثم استنزاف الحل عن طريق مضخة فراغ.
    8. غسل الراتنج عن طريق تكرار الخطوات 1.1.2-1.1.4.
    9. إضافة 4 مل من 20٪ (المجلد / المجلد) piperidine في DMF إلى الراتنج، يهز بلطف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ومن ثم استنزاف الحل.
      تحذير: بيريدين قابل ة للاشتعال للغاية وسامة. إجراء التجارب في غطاء الدخان.
    10. إضافة آخر 4 مل من 20٪ (المجلد / المجلد) piperidine في DMF إلى الراتنج، يهز بلطف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم استنزاف الحل.
    11. اتبع الخطوات 1.2.1-1.2.10 للزوجين وإزالة حماية Fmoc-Ala-OH، Fmoc-Thr-OH، Fmoc-Cys-OH، Fmoc-His-OH وFmoc-Ala-OH. كرر الخطوات 1.2.5-1.2.10 للزوجين وإزالة حماية Fmoc-Trp-OH، Fmoc-Val-OH، Fmoc-Leu-OH، Fmoc-Glu-OH، Fmoc-Gly-OH و Fmoc-Asp-OH.
    12. كرر الخطوات 1.1.2-1.1.4 لغسل الراتنج جيدا.
    13. كرر الخطوة 1.1.3 لغسل الراتنج ثم فراغ الجافة الراتنج لمدة 5 دقائق.
  3. انشقاق الببتيد الخام المستمدة من الهيدرازين Fc-III
    1. إضافة 12 مل من الكوكتيلات حمض ثلاثي فلورو سيتيك (TFA)/2′-(إيثيلينديوكسي)ديتاهانثيول (DODT)/triisopropylsilane (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.5) إلى الراتنج، ومن ثم استخدام شاكر درجة حرارة ثابتة لشق الببتيد من الراتنج في 200 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية حوالي 2 ح. تصفية الخليط في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    2. إضافة 1 مل من الكوكتيلات في الراتنج لغسله وجمع filtrate في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. كرر مرتين.
    3. تركيز الخليط إلى 2 مل بواسطة دوار vaper في غطاء الدخان، ومن ثم إضافة 20 مل من الأثير ثنائي الإيثيل المبردة مسبقا في الأنبوب لتعجيل الببتيدات الخام.
      ملاحظة: يجب تبريد الأثير اللامائية مسبقا إلى 0 درجة مئوية لتجنب إطلاق الحرارة العنيفة، والتي قد تسبب ردود فعل جانبية من الببتيد الخام.
    4. حضانة هطول الأمطار الببتيد في -20 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
    5. الطرد المركزي في 5000 × ز،4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وإزالة المذيب من أنبوب الطرد المركزي بعناية.
    6. إضافة 20 مل من الأثير ثنائي الإيثيل المبردة مسبقا في الأنبوب مرتين وفقا للخطوات 1.3.3-1.3.5 لغسل هطول الأمطار. الهواء الجاف المنتج الببتيد في ساعة الزجاج لمدة 15 دقيقة تقريبًا.
  4. تنقية مشتق الهيدرازين من الببتيد Fc-III
    1. استخدام نظام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لتنقية الببتيد من قبل 30 دقيقة التدرج elution (0-1 دقيقة، 5٪ B؛ 1-20 دقيقة، 50٪ B؛ 20-25 دقيقة، 85٪ B؛ 25-30 دقيقة، 85٪ B) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
      ملاحظة: العمود هو في معرف 4.6 ملم، 250 ملم طول، معبأة مع الراتنج C-18. تألفت المرحلة المتنقلة A من 0.1٪ TFA في المياه، والمرحلة المتنقلة B تألفت من 100٪ acetonitrile و 0.1٪ TFA.

2. التعبير عن البروتين وتنقية أجزاء الرابط والمستضد

  1. بناء بلازميد
    1. توليف التسلسل الجيني بأكمله الذي يمكن أن يعبر عن SUMO-linker-مستضد (انظر جدول المواد).
    2. قطع 10 نانوغرام من PET-28a ناقلات فارغة و 50 نانوغرام من جزء الحمض النووي توليفها SUMO-linker-مستضد باستخدام NcoI وXhoI في حمام المياه 37 درجة مئوية لمدة 3 ح.
    3. تنقية ناقلات مزدوجة الإنزيم هضمها وجزءا من الحمض النووي من قبل الحمض النووي هلام استخراج كيت.
    4. إضافة 5 μL من الحمض النووي هضمها جزء الحمض النووي، 5 ميكرولتر من ناقلات هضمها، 1 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ligase، 2 ميكرولتر من 10X الرباط العازلة و 7 ميكرولتر من ddH2O إلى أنبوب رد فعل، ومن ثم احتضانه بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
    5. امزج 10 ميكرولتر من منتج الربط من الخطوة 2.1.4 إلى 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة (DH5α) ووضعها على حمام جليدي لمدة 30 دقيقة. LB السائل المتوسط (دون المضادات الحيوية) إلى الأنبوب ويهز في 37 درجة مئوية، 180 دورة في الدقيقة لمدة 1 ح. معطف الخلايا المختصة على لوحة LB كانامايسين لجعلها موزعة بالتساوي، ووضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. اختيار 5 مستعمرات واحدة من لوحة وثقافة البكتيريا في 5 مل من LB المتوسطة في أنبوب اختبار باستخدام شاكر 37 درجة مئوية.
    7. استخراج بلازميدات من البكتيريا التي تم حصادها من الخطوة 2.1.6 باستخدام بلازميد استخراج كيت.
    8. إرسال بلازميدات لتسلسل الجينات واختيار المستعمرة الإيجابية التي يمكن أن تعبر عن سومو-لينكر-مستضد البروتين الانصهار. تحويل بلازميد إيجابية إلى BL21 (DE3) plysS الخلايا المختصة بعد الخطوة 2.1.5.
  2. تنقية البروتين
    1. اختيار مستعمرة واحدة من التحويلات من الخطوة 2.1.7 إلى 5 مل من السائل LB المتوسطة التي تحتوي على كانامايسين (50 ميكروغرام / مل). هز الثقافات بين عشية وضحاها في 200 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية.
    2. تلقيح 1 لتر من وسط LB المُسخّر مسبقاً يحتوي على كانامايسين (50 ميكروغرام/مل) في قارورة مع 5 مل من الثقافات الليلية، وينمو عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي، حتى يصبح OD600 0.6.
    3. إضافة isopropyl β-D-ثيوغالاكتوسيد (IPTG) في المتوسط إلى التركيز النهائي من 0.4 mM، ويهز قارورة في 200 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية.
      ملاحظة: انخفاض درجة الحرارة لتحريض البروتين مهم لتجنب إدراج تشكيل الجسم، لذلك تأكد من أن درجة الحرارة ليست أكثر من 22 درجة مئوية.
    4. بعد حصاد الخلايا، إضافة 50 مل من الليف العازلة إلى الكريات الخلية لإعادة تعليق الخلايا. Sonicate الخلية lysates مرتين لمدة 5 دقائق في 200 W, الموجات فوق الصوتية 3 ق, الفاصل الزمني 3 ق على الجليد. الطرد المركزي في 15، 000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لجمع supernatants.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت للتحلل من 50 مل NaH2PO4،300 مل NaCl، 10 mM imidazole. ضبط قيمة الحموضة إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
    5. إضافة 2 مل من 50٪ ني-NTA سيفوراسي، ومتساوية من قبل العازلة lysis، إلى supernatants تطهيرها ومزيج بلطف عن طريق هز (200 دورة في الدقيقة على شاكر دوارة) في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. قم بتحميل خليط lysate و Ni-NTA في عمود مع غطاء المخرج السفلي، وإزالة الغطاء السفلي وتجاهل تدفق العمود من خلال.
    7. غسل ثلاث مرات مع 6 مل من العازلة غسل، ومن ثم elute البروتين المستهدف 3 مرات مع 1.5 مل من العازلة elution. جمع eluate في أنبوب واحد.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت للغسيل من 50 مل NaH2PO4،300 MM NaCl، 30 mM imidazole. ضبط قيمة الحموضة إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. يتكون المخزن المؤقت elution من 50 M NaH2PO4,300 mM NaCl, 250 mM imidazole. ضبط قيمة الحموضة إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم.
    8. وضع eluate في كيس غسيل الكلى في 1 لتر من 50 MM PBS في 4 درجة مئوية لإزالة الملح من البروتين. استبدل المالحة الجديدة المخزنة بالفوسفات (PBS) لمدة 3 مرات.
  3. انشقاق علامة SUMO
    1. إضافة 2 مل من الصغيرة يوبيكويتين مثل المعدل (SUMO) الموسومة البروتين في تركيز 1 ملغ / مل، 1 مل من البروتياز SUMO (انظر جدول المواد)،1 مل من 10X سومو بروتياز العازلة و 6 مل من ddH2O لإعداد حل رد الفعل.
      ملاحظة: تركيز بروتين السومو بطاقة حوالي 1 ملغ / مل. التركيزات المفرطة بعد هضم الإنزيم قد يسبب تخثر البروتين.
    2. احتضان الخليط لمدة 12-16 ساعة عند 4 درجة مئوية.
    3. طرد الخليط في 15،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وتجاهل المجاميع. إضافة 0.5 مل من الطين ني-NTA 50٪، ومتساوية من قبل 50 MM PBS، إلى 10 مل مسح supernatants ومزيج بلطف عن طريق هز (200 دورة في الدقيقة على شاكر دوارة) في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    4. قم بتحميل خليط lysate و Ni-NTA في عمود مع غطاء منفذ أسفل. قم بإزالة الغطاء السفلي ثم احفظ التدفق في أنبوب طرد مركزي بـ 15 مل.
      ملاحظة: بروتين SUMO ذو العلامات الهستة ملزم على العمود. الجزء linker-مستضد، الذي يبدأ مع Cys لرد فعل NCL، هو في التدفق من خلال.
    5. طرد مركزي من خلال تدفق في 15،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وتجاهل المجاميع. تنقية جزء مستضد الرابط باستخدام HPLC بنسبة 25 دقيقة التدرج elution (0-1 دقيقة، 5٪ B؛ 1-3 دقيقة، 15٪ B؛ 3-20 دقيقة، 45٪ B؛ 20-21 دقيقة، 85٪ B؛ 21-25 دقيقة، 85٪ B) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
      ملاحظة: العمود هو في معرف 4.6 ملم، 250 ملم طول، معبأة مع الراتنج C-18. تألفت المرحلة المتنقلة A من 0.1٪ TFA في المياه، والمرحلة المتنقلة B تألفت من 100٪ acetonitrile و 0.1٪ TFA.
    6. جمع المنتج النقي من HPLC، ومن ثم تجميد الجافة بين عشية وضحاها للحصول على المنتج linker-مستضد.

3. تجميع DCAF1 عن طريق الربط الكيميائي الأصلي

  1. الاقتران Fc-III الببتيد وlinker-مستضد جزء معا
    1. وزن 1.8 ملغ (1 ميكرومول) من مشتق الهيدرازين من الببتيد Fc-III في أنبوب EP 2 مل وإضافة 0.8 مل من 6 M GnHCl في 0.2 M NaH2PO4 (درجة الحموضة 3.0) الحل لإذابة عن طريق الدوامة.
      ملاحظة: يتم إعداد 6 M GnHCl في 0.2 M NaH2PO4 (pH 3.0) الحل عن طريق ضبط قيمة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم.
      تحذير: هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك هي تآكل للغاية. ارتداء معطف المختبر والقفازات وقناع.
    2. بعد الطرد المركزي الأنبوب في 7200 × ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ووضع الأنبوب في حمام ملح الجليد واستخدام التحريك المغناطيسي لإثارة الحل لمدة 15 دقيقة بلطف.
    3. إضافة 40 ميكرولتر من 0.5 M NaNO2 إلى الحل لأكسدة مجموعة الهيدرازين. تحريك بلطف الحل لمدة 15 دقيقة أخرى في حمام ملح الجليد.
    4. وزن وإضافة 11 ملغ من تنقية الرابط مستضد جزء أعدت من الخطوة 2.3 و 13.6 ملغ من حمض 4-mercaptophenylacetic (MPAA) في أنبوب التفاعل في حمام الملح الجليدي، وتحريك لمدة 5 دقائق، ومن ثم ضبط قيمة الحموضة إلى 6.8-7.0 في درجة حرارة الغرفة مع 6 M هيدروكسيد الصوديوم.
      ملاحظة: ضبط قيمة درجة الحموضة إلى محايد هو الخطوة الحاسمة لبدء رد فعل الربط.
    5. بعد 12 ساعة، إضافة 0.4 مل من 0.1 M تريس (2-carboxyethyl) فسفيون هيدروكلوريد (TCEP) حل محايد (درجة الحموضة 7.0) إلى نظام رد الفعل ويحرك لمدة 20 دقيقة لإنهاء رد الفعل.
      ملاحظة: يتم إعداد 0.1 M TCEP حل محايد (pH 7.0) عن طريق حل TCEP في 6 M GnHCl في 0.2 M NaH2PO4 (pH 3.0) الحل، واستخدام هيدروكسيد الصوديوم لضبط قيمة الحموضة إلى 7.0.
    6. الطرد المركزي أنبوب في 15،000 × ز لمدة 10 دقيقة، ثم تحليل وتنقية المنتج الربط مع HPLC بنسبة 26 دقيقة التدرج elution (0-1 دقيقة، 5٪ B؛ 1-21 دقيقة، 45٪ B؛ 21-22 دقيقة، 85٪ B؛ 22-26 دقيقة، 85٪ B) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. العائد المتوقع لرد فعل الربط هو أكثر من 50٪.
      ملاحظة: العمود هو في معرف 4.6 ملم، 250 ملم طول، معبأة مع الراتنج C-18. تألفت المرحلة المتنقلة A من 0.1٪ TFA في المياه، والمرحلة المتنقلة B تألفت من 100٪ acetonitrile و 0.1٪ TFA.
  2. إزالة الكبريت من المتقارن
    1. حل المتقارن (3.4 ملغ، 0.3 ميكرومول) أعدت من الخطوة 3.1.6 في 50 ميكرولتر من 6 M GnHCl في 0.2 M NaH2PO4 (درجة الحموضة 7.0) الحل.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من 1 M TCEP، 10 ميكرولتر من tBuSH و 5 ميكرولتر من 0.1 M VA-044 الحل إلى الخليط أعلاه.
      ملاحظة: يتم إعداد 0.1 M VA-044 الحل عن طريق حل 9.7 ملغ من مسحوق VA-044 في 0.3 مل من 6 M GnHCl في 0.2 M NaH2PO4 (درجة الحموضة 7.0) الحل. وينبغي إعداد الحل VA-044 طازجة قبل الاستخدام، كما يتم أكسدة VA-044 بسهولة عن طريق التعرض للهواء.
    3. ضبط درجة الحموضة النهائية للحل إلى 6.9 والحفاظ على solutiomat 37 درجة مئوية مع التحريك لحوالي 5 ح.
    4. طرد مركزي الأنبوب في 15،000 × ز لمدة 10 دقائق وإزالة المادة غير القابلة للذوبان. تحليل وتنقية المنتج الربط مع HPLC بنسبة 26 دقيقة التدرج elution (0-1 دقيقة، 20٪ B؛ 1-21 دقيقة، 45٪ B؛ 21-22 دقيقة، 85٪ B؛ 22-26 دقيقة، 85٪ B) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. العائد المتوقع لرد فعل إزالة الكبريت حوالي 40٪.
      ملاحظة: العمود هو في معرف 4.6 ملم، 250 ملم طول، معبأة مع الراتنج C-18. تألفت المرحلة المتنقلة A من 0.1٪ TFA في المياه، والمرحلة المتنقلة B تألفت من 100٪ acetonitrile و 0.1٪ TFA.
  3. إزالة Acm للحصول على المنتج النهائي DCAF1
    1. حل الببتيد (1.35 ملغ، 0.11 ميكرومول) أعدت من الخطوة 3.2.4 في 200 ميكرولتر من 32 MM AgOAc، ومن ثم تحريك خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعة.
    2. إضافة 3 ميكرولتر من 1M Dithiothreitol (DTT) في 6 M GnHCl في 0.2 M NaH2PO4 (درجة الحموضة 7.0) الحل لتحويل ثيولاتس الفضة على الببتيد إلى ثيولس الحرة.
    3. بعد التحريك بعنف لمدة دقيقة واحدة، الطرد المركزي الأنبوب في 15،000 × ز لمدة 10 دقائق لتجاهل المادة غير القابلة للذوبان. تحليل وتنقية المنتج النهائي مع HPLC بنسبة 26 دقيقة التدرج elution (0-1 دقيقة، 20٪ B؛ 1-21 دقيقة، 45٪ B؛ 21-22 دقيقة، 85٪ B؛ 22-26 دقيقة، 85٪ B) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. العائد المتوقع لرد فعل إزالة الحماية Acm حوالي 30٪.
      ملاحظة: العمود هو في معرف 4.6 ملم، 250 ملم طول، معبأة مع الراتنج C-18. تألفت المرحلة المتنقلة A من 0.1٪ TFA في المياه، والمرحلة المتنقلة B تألفت من 100٪ acetonitrile و 0.1٪ TFA.
    4. بعد تنقية HPLC، تجميد الجافة المنتج النهائي بين عشية وضحاها، وحل المسحوق في PBS (50 مل NaH2PO4،150 مل NaCl، درجة الحموضة 8.0). طرد مركزي الأنبوب في 15،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وتجاهل بيليه.
    5. ضبط تركيزات المنتج النهائي (من الخطوة 3.4) وجزء مستضد linker (من الخطوة 2.3.6) إلى 10 μM، وتسجيل الأطياف الديشورية الدائرية (CD) من 260 إلى 195 نانومتر من هذين المنتجين باستخدام مطياف CD في 25 درجة مئوية مع طول مسار 1 مم.
      ملاحظة: يتم استخدام أطياف الأقراص المضغوطة لبيان مقدار البنية الحلزونية α في المنتج النهائي مماثلة لتلك الموجودة في المؤتلف المعبر عنه.

4. الكشف عن المنتجات عن طريق قياس الطيف الكتلي

  1. فصل المنتج من كل تفاعل كيميائي من قبل التدرج 60 دقيقة التدرج (0-8 دقيقة، 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) بمعدل تدفق قدره 0.300 يورو/دقيقة نانو-HPLC النظام الذي هو واجهة مباشرة مع مطياف كتلة عالية الدقة.
    ملاحظة: العمود التحليلي هو في معرف 75 درجة مئوية، 150 ملم طول، معبأة مع الراتنج C-18. تألفت المرحلة المتنقلة A من 0.1٪ حمض الفورميك في الماء، والمرحلة المتنقلة B تتكون من 100٪ acetonitrile و 0.1٪ حمض الفورميك.
  2. تشغيل مطياف الكتلة في وضع المسح الضوئي الكامل وتعيين نطاق م / ض في 300-2000 والقرار في 60،000.
  3. فتح البيانات الأطياف الشامل والعثور على قمم المنتج في كل خطوة لتأكيد التفاعل الكيميائي هو تشكيلها بنجاح.

5. ELISA فحص التفاعل بين DCAF1 و4G2 الأجسام المضادة

  1. معطف لوحة ميكروتيدر 96 جيدا مع 1 pmol المضادة للضريبة (انظر جدول المواد)في 100 درجة مئوية من الطلاء العازلة / جيدا، وختم لوحة واحتضانه في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها على شاكر.
  2. كتلة كل بئر مع 200 درجة مئوية من 1٪ BSA في PBS، وختم لوحة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر.
  3. غسل كل بئر 4 مرات باستخدام PBS مع 0.05٪ توين 20.
  4. إضافة بروتين مستضد GST تنصهر (0.05 pmol في 100 درجة مئوية من محلول حظر) إلى الآبار، وختم لوحة وحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم التعبير عن بروتين مستضد GST تنصهر في البكتيريا وتنقيتها من قبل GSH Sepharose.
  5. كرر الخطوة 5.3 لغسل اللوحة.
  6. إضافة 1 pmol 4G2 الأجسام المضادة أو 1 pmol 4G2 الأجسام المضادة بالإضافة إلى الأربطة الأخرى: مستضد، Fc-III أو DCAF1 بكميات سلسلة (0.1 pmol، 1 pmol، 10 pmol، 100 pmol و 1000 pmol) في 100 ميكرولتر من حل حظر / جيدا، وختم لوحة واحتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
  7. كرر الخطوة 5.3 لغسل اللوحة.
  8. إضافة المضادة للماوس IgG، HRP المرتبطة الأجسام المضادة (1:20،000 تخفيف) في 100 درجة مئوية من حل حجب / جيدا، وختم لوحة واحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
  9. غسل كل بئر 6 مرات باستخدام PBS مع 0.05٪ توين 20.
  10. مزيج TMB كاشف A و B 1:1 في حجم مباشرة قبل الاستخدام، إضافة 100 درجة مئوية / جيدا، ومن ثم احتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  11. إضافة 100 درجة مئوية / جيدا من وقف الحل، واستخدام قارئ لوحة لقياس قيم OD450 لكل بئر في غضون 30 دقيقة.

6. ELISA تحليل التفاعل بين Fc-III وجزيء IgG

  1. معطف لوحة ميكروتيدر 96 جيدا مع 1 pmol المضادة للCA (انظر جدول المواد)في 100 درجة مئوية من طلاء العازلة / جيدا، وختم لوحة واحتضانه في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها على شاكر.
  2. كرر الخطوات من 5.2 إلى 5.3.
  3. إضافة Fc-III أو Fc-III-4C بروتين CA تنصهر (0.01، 0.05، 0.1، 0.5 و 1 pmol في 100 ميكرولتر من محلول حظر) إلى الآبار، وختم لوحة وحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم التعبير عن Fc-III أو Fc-III-4C بروتين CA المنصهر في البكتيريا وتنقيته من قبل Ni-NTA.
  4. كرر الخطوات من 5.7 إلى 5.11 وتحقق من النتائج.

النتائج

يظهر المخطط الانسيابي لمسار التوليف بواسطة الربط الكيميائي الأصلي في هذه المقالة في الشكل 1. تظهر الأرقام 2-6 الكروماتوغرام(أ)والأطياف الكتلية(B)من مشتق الهيدرازين الكيميائي المركب من الببتيد Fc-III، المؤتلف أعرب linker ومستضد جزء، والمنتج النقي من رد...

Discussion

يصف البروتوكول هنا شبه التوليف والكشف عن DCAF1 باستخدام نهج NCL، والذي يظهر في الشكل 1. وباختصار، فإن جزتي اللجنة الثانية للقوات المسلحة هي أجزاء كيميائية مركبة ومعبر عنها بصورة مُدمجة، على التوالي؛ ثم، يتم تجميع جزيء DCAF1 طول كامل، وتعديلها وتنقيتها. بالنسبة لتوليف جزء Fc-III الم...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل جزئيا مؤسسة جامعة تسينغهوا - غيتس (لا. OPP1021992)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 21502103 و 21877068 و041301475)، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2017YFA0505103).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Chlorotrityl resinTianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxideGL Biochem00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphateGL Biochem00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochlorideJ&K Scientific503236
4G2 antibodyThermoMA5-24387
4-mercaptophenylacetic acidAlfa AesarH27658
96-well microtiter platesNEST701001
AcetonitrileThermo-FisherA955MS Grade
AgOAcSinopharm Chemical Reagent30164324
anti-GST antibodyAbclonalAE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7076P2
BSABeijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometerApplied Photophysics Ltd
dialysis bagSbjbioSBJ132636
DichloromethaneSinopharm Chemical Reagent80047360
diethyl etherSinopharm Chemical Reagent10009318
DNA Gel Extraction KitBeyotimeD0056
Fusion Lumos mass spectrometerThermo
GSH SepharoseGE Lifesciences
Guanidine hydrochlorideSinopharm Chemical Reagent30095516
Hydrazine hydrateSinopharm Chemical Reagent80070418
Hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagent10011018
imidazoleSIGMA12399-100G
Isopropyl β-D-ThiogalactosideSIGMA5502-5G
kanamycinBeyotimeST101
MethanolThermo-FisherA456MS Grade
N, N-DiisopropylethylamineGL Biochem90600
N, N-DimethylformamideSinopharm Chemical Reagent8100771933
NcoIThermoER0571
PBS bufferSolarbioP1022
Peptide BEH C18 ColumnWaters186003625
piperidineSinopharm Chemical Reagent80104216
Plasmid Extraction KitSangon BiotechB611253-0002
QIAexpress KitQIAGEN32149
Rapid DNA Ligation KitBeyotimeD7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrateSinopharm Chemical Reagent20040718
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent10019762
Sodium nitriteSinopharm Chemical Reagent10020018
sodium chlorideSinopharm Chemical Reagent10019318
Standard Fmoc-protected amino acidsGL Biochem
sterilizing potTomySX-700
SUMO ProteaseThermo Fisher12588018
stop solutionBiolegend423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigenTaihe Biotechnology Compay
TMB reagentBiolegend421101
Trifluoroacetic acidSIGMAT6508
TriisopropylsilaneGL Biochem91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideAladdinT107252-5g
tryptoneOXOIDLP0042
Tween 20SolarbioT8220
Ultimate 3000 HPLCThermo
vacuum pumpYUHUASHZ-95B
XhoIThermoIVGN0086
yeast extractOXOIDLP0021

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151 DCAF ELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved