Antijenik Peptid ve Fc-III Mimetics (DCAF) Çift Fonksiyonlu Konjuge tarafından Hedefli Antikor Engelleme

Özet

Antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu bir konjuge gelişimi zararlı antikorların ortadan kaldırılması için yeni bir yeniliktir. Burada, Dang virüsü enfeksiyonu sırasında antikorbağımlı geliştirme etkisini ortadan kaldırmak için seçici olarak 4G2 antikor engelleyebilir DCAF1 molekülünün sentezi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Özet

Zararlı antikorların organizmalardan uzaklaşması, Dang hemorajik ateş ve otoimmün hastalıklar gibi antikorilişkili hastalıkların müdahalesi için değerli bir yaklaşımdır. Farklı epitopslara sahip binlerce antikor kanda dolaştığından, antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu konjuge dışında evrensel bir yöntemin spesifik zararlı antikorları hedef ettiği bildirilmiştir. DCAF moleküllerinin gelişimi, dang virüsü (DENV) enfeksiyon modelinde antikor bağımlı geliştirme (ADE) etkisini ortadan kaldırmak ve asetilkolinartırmak için gösterilmiştir hedefli tedavi, ilerlemesine önemli katkı yapar bir miyastenia gravis modelinde reseptör aktivitesi. Burada, Dang virüs enfeksiyonu sırasında ADE etkisini zayıflatmak için 4G2 antikorunu seçici olarak bloke eden ve DCAF1 ile 4G2 antikorunun ELISA testi ile bağlanmasını gösteren bir DCAF molekülünün (DCAF1) sentezine yönelik bir protokolü tanımlıyoruz. Yöntemimizde DCAF1, fc-III peptidin hidrat türevinin konjugasyonu ve doğal kimyasal ligasyon (NCL) yoluyla antijenik diziliuzun uzun α-sarlis ifade edilmesi yle sentezlenir. Bu protokol, cognate antikorlarını hedeflemek için DCAF1'e ve diğer DCAF moleküllerine başarıyla uygulanmıştır.

Giriş

Antikorlar patojenik bakteri ve virüslerin nötralizasyonu için humoral immün yanıt önemli rol oynamaktadır^1. Ancak, bazı antikorlar organizmalar için zararlı etkiler sergiler, DENV enfeksiyonu sırasında ADE etkisi çapraz reaktif antikorlar ve miyasteni ait gravis aşırı reaktif antikorlar gibi, hangi bir otoimmün^hastalıklar2^,3. ADE etkisi DENV ve Fc reseptör sunan hücreleri bağlamak için köprü yapmak çapraz reaktif antikorlar aracılık edilir^4,5, miyasteni gravis asetilkolin reseptörlerine saldıran aşırı antikorlar neden olurken kas dokusunda hücre-hücre kavşakları arasında^6,7. Bu hastalıkların tedavisinde kısmen etkili yaklaşımlar geliştirilmiş olmasına rağmen^8,9, şüphesiz bu zararlı antikorların doğrudan ortadan kaldırılması müdahaleler için ilerleme olacaktır.

Son zamanlarda, çift fonksiyonlu gruplara sahip DCAF molekülleri, hedefli antikor blokaj ı için geliştirilmiştir¹⁰. DCAF 3 bölümden oluşan uzun bir peptittir: 1) spesifik bir antijen parçası cognate antikor tanıyabilir, 2) fc-III veya Fc-III-4C etiketi güçlü antikor Fc bölgesine bağlı ya Fc reseptör veya kompleman bileşen proteinleri inhibe etmek için , 3) bu iki fonksiyonel grup¹⁰conjugates uzun bir α-sarmal bağlayıcı . Moesin FERM etki alanından tasarlanan bağlantı parçası, Bir DCAF molekülündeki antijen ve Fc-III kısmının aynı anda IgG'nin Fab ve Fc bölgelerine bağlanabilmesini sağlamak için Rosseta yazılımı tarafından optimize edildi. Dört DCAF molekülleri hedef 4 farklı antikorlar için sentezlenmiş, aralarında DCAF1 4G2 antikor ortadan kaldırmak için kullanılmıştır, Hangi DENV enfeksiyonu sırasında çapraz reaktif antikor ADE etkisine katkıda bulunmak için; ve DACF4 miyasteni ait gravis¹⁰mab35 antikor engelleyerek asetilkolin reseptörlerinin kurtarılması için tasarlanmıştır.

Örnek olarak DCAF1'i örnek alan bu çalışmada, DCAF molekülünün sentezi ve DCAF ve bilişli antikor arasındaki etkileşimin saptanması için protokolleri gösterdik. DCAF1 ncl yaklaşım^11,12,13,14, bir Fc-III peptid hidrat türevi ve ifade bağlayıcı-antijen parçaları birlikte conjugates tarafından yarı sentezlenir. Her iki yöntem de düşük verim ve yüksek maliyetyol çünkü NCL yaklaşımı, tam kimyasal sentezve DCAF1 sentezi için tam rekombinant ifade üzerinde önemli avantajlara sahiptir. Mevcut yaklaşım sadece tam uzunlukta DCAF almak için en uygun maliyetli bir yoldur, ama aynı zamanda yerel formu olarak benzer bağlayıcı parçasının konformasyon koruyabilirsiniz. Farklı DCAF molekülleri antijen parçaları dışında benzer dizilere sahip olduğundan, DCAF1 sentezi ve DCAF1 ve 4G2 antikorları arasındaki etkileşim telimizden dolayı yöntemlerimiz diğer DCAF moleküllerine uygulanabilir ve bu moleküllerin biliş antikorlarını bloke etmek hedeflenebilir.

Protokol

1. Fc-III peptidin hidrazin türevinin kimyasal sentezi

1. 2-Cl-(Trt)-Cl rezorinin 2-Cl-(Trt)-NHNH₂ rezorne ye dönüştürülmesi
   1. 25 mL'lik peptid sentez damarına 625 mg 2-Cl-(Trt)-Cl reçine (0.25 mmol) ağırlığındadır.
   2. Geminin üst kısmından reçine 5 mL N,N-dimethylformamide (DMF) ekleyin, kapağı geri koyun, yavaşça 15 s için damar ıslayın ve sonra drenaj. DMF yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
   3. Damara 5 mL diklorometan (DCM) ekleyin, kapağı geri koyun, kabı hafifçe 15 s'lik sallayın ve sonra boşaltın. DCM yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
   4. Adımı 1.1.2'yi üç kez tekrarlayın.
   5. Rekarini 30 dakika boyunca şiştirmek için %50 (vol/vol) DMF/DCM'nin 6 mL'sini kullanın ve sonra boşaltın.
   6. DMF'de 6 mL %5 (vol/vol) NH₂NH_2'yi reaksiyon kabına aktarın, karışımı 120 rpm'de sallayın, 30 dakika 30 dakika boyunca 30 °C'de sallayın ve vakum pompası ile çözeltiyi boşaltın.
      NOT: %5 (vol/vol) NH₂NH₂almak için 5,7 mL DMF'ye 0,3 mL hidrat ekleyin. Kullanmadan önce NH₂NH_2'yi taze olarak hazırlayın.
      DİkKAT: Hidrazin hidrat tehlikeli bir maddedir ve kansere neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giy. Deneyleri duman kaputunda gerçekleştirin.
   7. Damara 5 mL DMF ekleyin, 15 s boyunca hafifçe sallayın ve sonra boşaltın.
   8. 1.1.6 adımını tekrarlayın ve 1.1.2-1.1.4 adımlarını iki kez tekrarlayarak rezorini yıkayın.
   9. Damara %5 (vol/vol) MeOH/DMF 6 mL ekleyin, 10 dakika hafifçe sallayın ve süzün.
      NOT: Bu adım, rezorin üzerindeki tepkisiz sitelerin kapatılmış olduğundan emin olmak için çok önemlidir.
   10. 1.1.2-1.1.4 adımlarını tekrarlayarak reçiyiyi iyice yıkayın.
   11. Resenin için 5 mL DCM ekleyin, 15 s boyunca hafifçe sallayın ve 2-Cl-(Trt)-NHNH₂ resin elde etmek için süzün.
       NOT: Reçin, ikame başarılı olduğunda sarı veya açık yeşil olur.
2. Peptit uzaması
   1. 1 mmol Fmoc-Ala-OH (934 mg) ve 0.95 mmol 1-[bis(dimethylamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] piridinium heksaflorofoffat 3-oksit (HATU) (360 mg) içeren 5 mL'lik bir tüpe DFF 3 mL içeren 5 mL'lik bir tüp ekleyin.
      DİkKAT: HATU'ya maruz kalmak alerjik reaksiyona neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giy.
   2. Çözünmüş çözeltiye 2 mmol N,N-diisopropiletilemin (DIEA) (0.36 mL) ekleyin ve 0.5-1 dk.
      NOT: Kritik Adım: Aktivasyon en fazla 5 dakika sürmelidir, aktivasyon amino asitler zaman içinde daha aktif O-formları için daha aktif O-formları isomerize olarak.
   3. Adım 1.1'den hazırlanan 2-Cl-(Trt)-NHNH₂ reçinesini içeren reaksiyon kabına aktif Fmoc-Ala-OH'u ekleyin. 120 rpm'de, 30 °C'de 20 dk sabit sıcaklıkta çalkalayıcıda hafifçe sallayın ve vakum pompası ile çözeltiyi boşaltın.
   4. Reçiyiyi yıkamak için 5 mL DMF ekleyin, 15 s boyunca hafifçe sallayın ve sonra süzün.
   5. 1 mmol Fmoc-Ala-OH (934 mg) ve 0.95 mmol 2-(6-kloro-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametrileminim hekzaflorofoffosfat (HCTU) (390 mg) 3 mL dmL içeren 5 mL tüp içine ekleyin.
      DİkKAT: HCTU'ya maruz kalmak alerjik reaksiyona neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giy.
   6. Tüpün ve girdabın ait 2 mmol (0,36 mL) ilave edin ve çözülmesi için 0,5-1 dakika.
   7. Reaksiyon kabına aktif Olan Fmoc-Ala-OH'u ekleyin. 120 rpm' de, 30 °C' de 40-60 dk sabit sıcaklıkta çalkalayıcıda hafifçe sallayın ve vakum pompası ile çözeltiyi boşaltın.
   8. 1.1.2-1.1.4 adımlarını tekrarlayarak reçiyiyi yıkayın.
   9. Rezorin dmf% 20 (vol / vol) pipeiddine 4 mL ekleyin, yavaşça oda sıcaklığında 5 dakika sallayın ve sonra çözelti drenaj.
      DİkKAT: Piridin son derece yanıcı ve zehirlidir. Deneyleri duman kaputunda gerçekleştirin.
   10. Resenin dmf başka bir 4 mL (vol / vol) pipeiddine ekleyin, yavaşça oda sıcaklığında 15 dakika sallayın ve sonra çözelti drenaj.
   11. 1.2.1-1.2.10 adımlarını takip edin ve Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH ve Fmoc-Ala-OH'u koruyun. 1.2.5-1.2.10 adımlarını çift ve fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH ve Fmoc-Asp-OH'u korumak için tekrarlayın.
   12. Rezorsu iyice yıkamak için 1.1.2-1.1.4 adımlarını tekrarlayın.
   13. Reçiyiyi yıkamak için 1.1.3 adımını tekrarlayın ve reçine 5 dk vakumla kurutun.
3. Hydrazine türetilmiş Fc-III ham peptid dekolte
   1. 12 mL kokteyl trifloroasetik asit (TFA)/2,2′-(etilenedioksi)diethanethiol (DODT)/triisopropilsilane (TIPS)/H₂O (92.5/2.5/2.5/2.5) reçine ye ekleyin ve sonra reçine den cleave için sabit sıcaklık shaker kullanın 20r, 20 r0 rpm 37 °C yaklaşık 2 saat. Karışımı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün.
   2. Yıkamak için reçine içine kokteyller 1 mL ekleyin ve 50 mL santrifüj tüp içine filtrasyon toplamak. İki kez tekrarlayın.
   3. Karışımı bir duman kaputuna bir vaper rotor la 2 mL'ye konsantre edin ve ham peptidleri çökeltmek için tüpün içine 20 mL önceden soğutulmuş metil eter ekleyin.
      NOT: Susuz eter, ham peptidin yan reaksiyonlarına neden olabilecek şiddetli ısı salınımını önlemek için 0 °C'ye kadar önceden soğutulmalıdır.
   4. Peptit çökeltisi -20 °C'de 1-2 saat kuluçkaya yatırın.
   5. 10 dk için 5.000 x g, 4 °C'de santrifüj edin ve çözücüyü santrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın.
   6. Çökeltiyi yıkamak için 1.3.3-1.3.5 basamaklarına göre tüpe 20 mL önceden soğutulmuş dietil eter ekleyin. Peptit ürünü bir saat bardağında yaklaşık 15 dakika kurutun. Daha fazla analiz için kurutulmuş ham peptidleri 4 °C'de saklayın.
4. Fc-III peptidin hidrazin türevinin saflaştırılması
   1. Peptidin 30 dk degrade elüsyonu (0-1 dk, %5 B; 1-20 dk, %50 B; 20-25 dk, %85 B; 25-30 dk, %85 B) ile 1 mL/dk akış hızıyla arındırmak için yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sistemini kullanın.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.

2. Bağlayıcı ve antijen parçaların protein ekspresyonu ve saflaştırılması

1. Plazmid yapımı
   1. SUMO-linker-antijeni ifade edebilen tüm gen dizisini sentezle (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. 3 7 °C'lik su banyosunda NcoI ve XhoI kullanarak 10 ng PET-28a boş vektörve sentezlenen SUMO-linker-antijen DNA parçasının 50 ng'sini 3 saat boyunca kesin.
   3. Çift enzimli sindirilmiş vektör ü ve DNA parçasını DNA Jel Ibçekimi Kiti ile arındırın.
   4. 5 μL DNA sindirilmiş DNA parçası, 5 μL sindirilmiş vektör, 1 μL T4 DNA ligaz, 2 μL 10x ligaz tampon ve 7 μL ddH₂O bir reaksiyon tüpü ne zaman bir gecede kuluçkaya yatırın.
   5. Ligasyon ürününün 10 μL'sini 2,1,4'ten 100°L'lik yeterli hücreye (DH5α) karıştırın ve 30 dakika boyunca bir buz banyosuna koyun. LB sıvı orta (antibiyotik olmadan) tüp ve 37 °C, 1 80 rpm 1 h. Coat yetkili hücreleri bir Kanamycin LB plaka üzerine eşit dağıtılmış yapmak için yetkili hücreleri sallamak ve bir gecede 37 °C kuluçka içine plaka koymak.
   6. 37 °C'lik bir çalkalayıcı kullanarak bir test tüpünde 5 mL LB orta daki bakterileri plakadan 5 tek kolon seçin ve kültüredin.
   7. Plazmid Ekstraksiyon Kiti kullanarak adım 2.1.6 hasat bakterilerden plazmidler ayıklayın.
   8. Gen dizilimi için plazmidleri gönderin ve SUMO-linker-antijen füzyon proteinini ifade edebilen pozitif koloniyi seçin. Pozitif plazmidi BL21(DE3)plysS yetkili hücrelerine 2.1.5 adımını takiben dönüştürün.
2. Protein arınması
   1. Kanamisin (50 μg/mL) içeren LB sıvı ortamın 2,1,7'den 5 mL'ye kadar tek bir transformant kolonisini seçin. 200 rpm, 37 °C'de kültürleri bir gecede sallayın.
   2. Kanamisin (50 μg/mL) içeren önceden ısınmış LB ortamının 1 L'sini bir şişede 5 mL'lik bir şişede inceleyin ve OD₆₀₀ 0,6 olana kadar 37 °C'de kuvvetli titreme ile büyüyün.
   3. 0,4 mM'lik son konsantrasyona orta içine isopropil β-D-tiogalaktoside (IPTG) ekleyin ve şişeyi 20 °C'de bir gecede 200 rpm'de sallayın.
      NOT: Protein indüksiyonu için düşük sıcaklık, vücut oluşumunu önlemek için önemlidir, bu nedenle sıcaklığın 22 °C'den fazla olmadığından emin olun.
   4. Hücreleri hasat sonra, hücreleri yeniden askıya almak için hücre peletlerine 50 mL lysis tampon ekleyin. 200 W'da 5 dakika boyunca iki kez hücre lysate sonicate, ultrason 3 s, buz üzerinde aralık 3 s. 15, 000 x g'de 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantları toplayın.
      NOT: Lysis tamponu 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolden oluşmaktadır. NaOH kullanarak pH değerini 8.0 olarak ayarlayın.
   5. Temizlenmiş süpernatantlara %50 Ni-NTA Sephoraz'ın 2 mL'sini ekleyin ve 4 °C'de 1 saat boyunca sallayarak hafifçe karıştırın.
   6. Lysate ve Ni-NTA karışımını alt çıkış kapaklı bir kolona yükleyin ve alt kapağı çıkarın ve kolon akışını atın.
   7. 6 mL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve 1,5 mL elüsyon tamponu ile hedeflenen proteini 3 kez temizler. Bir tüp içinde eluate toplamak.
      NOT: Yıkama tamponu 50 mM NaH₂PO_4,300 mM NaCl, 30 mM imidazolden oluşmaktadır. NaOH kullanarak pH değerini 8.0 olarak ayarlayın. Elüsyon tamponu 50 mM NaH₂PO_4,300 mM NaCl, 250 mM imidazolden oluşmaktadır. NaOH kullanarak pH değerini 8.0 olarak ayarlayın.
   8. Proteini tuzdan arındırmak için eluate'yi 4 °C'de 50 mM PBS'nin 1 L'inde bir diyaliz torbasına koyun. Yeni fosfat tamponlu salini (PBS) 3 kez değiştirin.
3. SUMO etiketinin bölünmesi
   1. Reaksiyon çözeltisini hazırlamak için 1 mg/mL konsantrasyonunda 2 mL Küçük Ubiquitin Benzeri Değiştirici (SUMO) etiketli protein, 1 mL SUMO Proteaz (Bkz. Malzeme Tablosu),1 mL 10x SUMO Proteaz Tampon ve 6 mL ddH₂O ekleyin.
      NOT: SUMO etiket protein konsantrasyonu yaklaşık 1 mg/mL'dir. Enzim sindiriminden sonra aşırı konsantrasyonlar proteinin pıhtılaşmasına neden olabilir.
   2. Karışımı 4 °C'de 12-16 saat kuluçkaya yatırın.
   3. Karışımı 15.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin ve agregaları atın. 10 mL temizlenmiş süpernatanta %50 Ni-NTA bulamacının 0,5 mL'sini ekleyin ve 60 dk boyunca 4 °C'de 4 °C'de sallayarak hafifçe karıştırın .
   4. Lysate ve Ni-NTA karışımını alt çıkış kapaklı bir kolona yükleyin. Alt kapağı çıkarın ve daha sonra 15 mL santrifüj tüpü içine akışı kaydedin.
      NOT: Histagged SUMO proteini kolona bağlanır. NCL reaksiyonu için Cys ile başlayan bağlayıcı-antijen kısmı, akış içindedir.
   5. 4 °C'de 10 dakika boyunca 15.000 x g'de akışı santrifüj edin ve agregaları atın. 1 mL/dk akış hızıyla 25 dk degrade elüsyonu (0-1 dk, %5 B; 1-3 dk, %15 B; 3-20 dk, %45 B; 20-21 dk, %85 B; 21-25 dk, %85 B) hplc kullanarak bağlantı-antijen parçasını arındırın.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.
   6. HPLC saflaştırılmış ürün toplamak ve daha sonra linker-antijen ürün almak için gecede dondurularak-kuru.

3. DCAF1'in yerli kimyasal ligasyon ile montajı

1. Fc-III peptid ve bağlayıcı-antijen parçasını bir arada birleştirme
   1. 2 mL EP tüp içine bir Fc-III peptid hidrazin türevi 1.8 mg (1 μmol) tartMak ve 0.2 M NaH₂PO₄ (pH 3.0) çözeltisi girdap ile eritmek için 6 M GnHCl 0.8 mL ekleyin.
      NOT: 0,2 M NaH₂PO₄ (pH 3.0) çözeltisinde 6 M GnHCl pH değeri HCl veya NaOH ile ayarlanarak hazırlanır.
      DİkKAT: NaOH ve HCl son derece aşındırıcıdır. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giy.
   2. Oda sıcaklığında 1 dakika için 7.200 x g tüp santrifüj sonra, bir buz-tuz banyosu tüp koymak ve hafifçe 15 dakika için çözelti ajite için manyetik karıştırma kullanın.
   3. Hydrazine grubunu okside etmek için çözeltiye 40 μL 0,5 M NaNO₂ ekleyin. Yavaşça buz-tuz banyosunda başka bir 15 dakika için çözelti ajite.
   4. Tartmak ve adım 2.3 ve 13.6 mg 4-mercaptophenylacetic asit (MPAA) buz-tuz banyosu reaksiyon tüpü içine hazırlanan saflaştırılmış linker-antijen parçası 11 mg ekleyin, 5 dakika için karıştırın, ve sonra 6 M NaOH ile oda sıcaklığında 6.8-7.0 için pH değerini ayarlayın.
      NOT: pH değerini nötre ayarlamak ligasyon reaksiyonunu başlatmak için kritik bir adımdır.
   5. 12 saat sonra reaksiyon sistemine 0,4 mL 0,1 M tris (2-karboksitil)fosfin hidroklorür (TCEP) nötr çözeltisi (pH 7.0) ekleyin ve reaksiyonu sonlandırmak için 20 dakika karıştırın.
      NOT: 0,1 M TCEP nötr çözeltisi (pH 7.0) TCEP'in 6 M GnHCl'de 0,2 M NaH₂PO₄ (pH 3.0) çözeltisinde çözülmesi ve pH değerini 7.0'a ayarlamak için NaOH kullanılarak hazırlanır.
   6. Tüpü 10 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüj edin, daha sonra 10 mIn/mL/mL'lik bir akışla 26 dk degrade lisan (0-1 dk, %5 B; 1-21 dk, %45 B; 21-22 dk, %85 B; 22-26 dakika, %85 B) HPLC ile ligasyon ürününü analiz edin ve arındırın. Ligasyon reaksiyonu için beklenen verim %50'nin üzerindedir.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.
2. Konjugenin desülfürizasyonu
   1. 0,2 M NaH₂PO₄ (pH 7.0) çözeltisinde 6 M GnHCl'nin 50 μL'inde 3.1.6'dan hazırlanan eşlenik (3.4 mg, 0.3 μmol) çözün.
   2. Yukarıdaki karışıma 50 μL 1 M TCEP, 10 μL tBuSH ve 5 μL 0,1 M VA-044 çözeltisi ekleyin.
      NOT: 0,1 M VA-044 çözeltisi 9,7 mg VA-044 tozunun 0,2 M NaH₂PO₄ (pH 7.0) çözeltisinde 6 M GnHCl 0,3 mL'ye çözülmesi yle hazırlanır. VA-044 çözeltisi kullanıma maruz kalarak kolayca oksitlendiği için kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
   3. Çözeltinin son pH'ını 6,9'a ayarlayın ve solutiomat 37 °C'yi yaklaşık 5 saat karıştırarak saklayın.
   4. Tüpü 10 dk için 15.000 x g'de santrifüj edin ve çözünmez maddeyi çıkarın. 1 mL/dk akış hızıyla (0-1 dk, %20 B; 1-21 dk, %45 B; 21-22 dk, %85 B; 22-26 dk, %85 B) HPLC ile ligasyon ürününü analiz edin ve arındırın. Desülfürizasyon reaksiyonu için beklenen verim yaklaşık %40'tır.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.
3. Son ürün DCAF1 almak için Acm kaldırılması
   1. 32 mM AgOAc'ın 200 μL'sinde 3.2.4 adımdan hazırlanan peptiti (1.35 mg, 0.11 μmol) eritin ve reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 4 saat karıştırın.
   2. 0,2 M NaH₂PO₄ (pH 7.0) çözeltisinde 6 M GnHCl'de 3 μL 1M Dithiothreitol (DTT) ekleyerek peptid üzerindeki gümüş tiyolitleri serbest tiyollere dönüştürün.
   3. 1 dakika boyunca şiddetle karıştırdıktan sonra, 15.000 x g'de tüpü çözünmez maddeyi atmak için 10 dk santrifüj edin. HPLC ile nihai ürünü 26 dk degrade elüsyonu (0-1 dk, %20 B; 1-21 dk, %45 B; 21-22 dk, %85 B; 22-26 dk, %85 B) 1 mL/dk akış hızıyla analiz edin ve arındırın. Acm deprotection reaksiyonu için beklenen verim yaklaşık% 30'dur.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.
   4. HPLC saflaştırma sonra, dondurma-bir gecede nihai ürün kuru ve PBS (50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 8.0) toz eritin. Tüpü 15.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin ve peleti atın.
   5. Nihai ürünün (adım 3.4'ten itibaren) ve bağlayıcı-antijen parçasının (adım 2.3.6'dan 10 μM'ye) konsantrasyonlarını ayarlayın, bu iki ürünün 260-195 nm arası dairesel dikroizm (CD) spektrumlarını 1 mm yol uzunluğuna sahip 25 °C'de bir CD spektrometresi kullanarak kaydedin.
      NOT: CD spektrumları, nihai üründeki α sarmal yapısının miktarını göstermek için rekombinanttaki ne kadar benzer olduğunu göstermek için kullanılır.

4. Ürünlerin kütle spektrometresi ile saptanması

1. Ürünü her kimyasal reaksiyondan 60 dk degrade elüsyonu (0-8 dk, %2 B; 8-10 dk, %5 B; 10-35 dk, %30 B; 35-50 dk, %50 B; 50-52 dk, %80 B; 52-58 dk, %80 B; 58-59 dk, %2 B; 59-60 dk, %2 B) 0,300 μL/min akış hızında doğrudan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile arayüz nano-HPLC sistemi.
   NOT: Analitik kolon 75 μm ID, 150 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 formik asit, gezici faz B ise %100 asetonitril ve %0.1 formik asitten oluşuyordu.
2. Kütle spektrometresini tam tetkik modunda çalıştırın ve m/z aralığını 300-2.000 ve çözünürlüğü 60.000 olarak ayarlayın.
3. Kütle spektrum verilerini açın ve kimyasal reaksiyonun başarılı bir şekilde önceden oluştuğunu doğrulamak için her adımda ürünün tepenoktalarını bulun.

5. DCAF1 ve 4G2 antikor arasındaki etkileşimin ELISA tsay

1. 1pmol anti-GST antikorlu 96 kuyulu mikrotiter plakayı (Bkz. Malzeme Tablosu)100 μL kaplama tamponu/kuyusu yla kaplayın, plakayı kapatın ve bir shaker üzerinde bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. PBS'de %1 BSA'nın 200 μL'si ile her kuyuyu bloke edin, plakayı kapatın ve bir çalkalayıcıda 1 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
3. % 0,05 Tween 20 ile PBS kullanarak her iyi 4 kez yıkayın.
4. Gst-erimiş antijen proteinini (100 μL bloklama çözeltisinde 0,05 pmol) kuyulara ekleyin, tabağı kapatın ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.
   NOT: GST-erimiş antijen proteinbakterilerle ifade edilir ve GSH Sepharose tarafından saflaştırılır.
5. Plakayı yıkamak için adım 5.3'u tekrarlayın.
6. 1 pmol 4G2 antikor veya 1 pmol 4G2 antikor artı diğer ligandlar ekleyin: antijen, Fc-III veya DCAF1 seri miktarlarda (0.1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol ve 1000 pmol) bloklama çözeltisi /iyi 100 μL, plaka mühür ve bir çalkalayıcı oda sıcaklığında 2 saat kuluçka.
7. Plakayı yıkamak için adım 5.3'u tekrarlayın.
8. Anti-fare IgG, HRP bağlantılı Antikor (1:20.000 seyreltme) bloklama çözeltisi / iyi 100 μL ekleyin, plaka mühür ve bir çalkalayıcı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka.
9. % 0,05 Tween 20 ile PBS kullanarak her iyi 6 kez yıkayın.
10. Kullanmadan hemen önce TMB reaktifA ve B 1:1'i hacim olarak karıştırın, 100 μL/kuyu ekleyin ve ardından karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
11. 100 μL/iyi stop çözeltisi ekleyin ve 30 dakika içinde her kuyu için OD₄₅₀ değerlerini ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.

6. Fc-III ve IgG molekülü arasındaki etkileşimin ELISA tetkik

1. 1pmol anti-CA antikora sahip 96 kuyulu mikrotiter plakayı (Bkz. Malzeme Tablosu)100 μL kaplama tamponu/kuyusu yla kaplayın, plakayı kapatın ve bir çalkalayıcı üzerinde bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
2. 5,2'den 5,3'e kadar olan adımları yineleyin.
3. Fc-III veya Fc-III-4C erimiş CA proteinini (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 ve 1 pmol 100 μL bloklama çözeltisine) kuyulara ekleyin, plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.
   NOT: Fc-III veya Fc-III-4C erimiş CA proteini bakterilerle ifade edilir ve Ni-NTA tarafından saflaştırılır.
4. Adımları 5,7'den 5,11'e kadar tekrarlayın ve sonuçları kontrol edin.

Sonuçlar

Bu makalede yerli kimyasal ligasyon ile sentez yolu için akış şeması Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 2-6, fc-III peptidin kimyasal sentezlenmiş hidrazin türevi kromatogramlarını (A) ve kütle spektrumlarını(B)gösterir, rekombinant ifade bağlayıcısı ve antijen parçası, NCL reaksiyonundan saflaştırılmış ürün, saflaştırılmış desülfürizasyon reaksiyonu ve saflaştırılmış nihai ürün DCAF1 ürün, sırası...

Tartışmalar

Buradaki protokol, Şekil 1'degösterilen NCL yaklaşımı kullanılarak DCAF1'in yarı sentezini ve saptanması açıklanmaktadır. Kısaca, DCAF1'in iki parçası sırasıyla kimyasal sentezlenir ve yeniden ifade edilir; sonra, tam uzunlukta DCAF1 molekülü monte edilir, modifiye ve saflaştırılır. Hydrazine türetilen Fc-III parça sentezi için, düşük kapasiteli 2-Cl reçine kullanımı oldukça önemlidir, çünkü yüksek kapasiteli hidrazin üretimi için olumsuz bir etkiye sah...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Chlorotrityl resin	Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide	GL Biochem	00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate	GL Biochem	00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride	J&K Scientific	503236
4G2 antibody	Thermo	MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid	Alfa Aesar	H27658
96-well microtiter plates	NEST	701001
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
AgOAc	Sinopharm Chemical Reagent	30164324
anti-GST antibody	Abclonal	AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7076P2
BSA	Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer	Applied Photophysics Ltd
dialysis bag	Sbjbio	SBJ132636
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent	80047360
diethyl ether	Sinopharm Chemical Reagent	10009318
DNA Gel Extraction Kit	Beyotime	D0056
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
GSH Sepharose	GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride	Sinopharm Chemical Reagent	30095516
Hydrazine hydrate	Sinopharm Chemical Reagent	80070418
Hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagent	10011018
imidazole	SIGMA	12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside	SIGMA	5502-5G
kanamycin	Beyotime	ST101
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine	GL Biochem	90600
N, N-Dimethylformamide	Sinopharm Chemical Reagent	8100771933
NcoI	Thermo	ER0571
PBS buffer	Solarbio	P1022
Peptide BEH C18 Column	Waters	186003625
piperidine	Sinopharm Chemical Reagent	80104216
Plasmid Extraction Kit	Sangon Biotech	B611253-0002
QIAexpress Kit	QIAGEN	32149
Rapid DNA Ligation Kit	Beyotime	D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent	20040718
Sodium hydroxide	Sinopharm Chemical Reagent	10019762
Sodium nitrite	Sinopharm Chemical Reagent	10020018
sodium chloride	Sinopharm Chemical Reagent	10019318
Standard Fmoc-protected amino acids	GL Biochem
sterilizing pot	Tomy	SX-700
SUMO Protease	Thermo Fisher	12588018
stop solution	Biolegend	423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen	Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent	Biolegend	421101
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6508
Triisopropylsilane	GL Biochem	91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Aladdin	T107252-5g
tryptone	OXOID	LP0042
Tween 20	Solarbio	T8220
Ultimate 3000 HPLC	Thermo
vacuum pump	YUHUA	SHZ-95B
XhoI	Thermo	IVGN0086
yeast extract	OXOID	LP0021