Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתוח של המשלים כפול תפקודית של פפטיד אנטיגניים ו-Fc-III mimetics (DCAF) הוא הרומן לחיסול של נוגדנים מזיקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לסינתזה של מולקולה DCAF1, אשר יכול באופן סלקטיבי לחסום נוגדן 4G2 כדי לחסל את ההשפעה התלויה נוגדן שיפור במהלך זיהום וירוס דנגה.

Abstract

חיסול של נוגדנים מזיקים מאורגניזמים הוא גישה רבת ערך להתערבות של מחלות הקשורות נוגדן, כגון קדחת דנגה מדמם ומחלות אוטואימוניות. מאחר שאלפי נוגדנים בעלי אפיסקופים שונים מסתובבים בדם, אין שיטה אוניברסלית, למעט המשלים הדו-תפקודי של הפפטיד האנטי-גניים ו-Fc-III (DCAF), דווחה כדי למקד את הנוגדנים המזיקים הספציפיים. הפיתוח של מולקולות DCAF הופכת תרומה משמעותית להתקדמות של טיפול ממוקד, אשר הוכחו לחסל את ההשפעה שיפור הנוגדן (ADE) אפקט של נגיף דנגה (DENV) זיהום המודל כדי להגביר את אצטילכולין הקולטן פעילות במודל מיאסטניה גרביס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של מולקולה DCAF (DCAF1), אשר ניתן באופן סלקטיבי לחסום נוגדן 4G2 כדי להחליש את אפקט ADE במהלך זיהום וירוס דנגה, ולהמחיש את הכריכה של DCAF1 כדי 4G2 נוגדן על ידי שיטת אליסה. בשיטה שלנו, DCAF1 הוא מסונתז על ידי הקוניוגציה של נגזרת של הידראזין של פפטיד Fc-III ו רקומביננטי הביע לאורך α-סליל עם רצף אנטיגניים באמצעות הקשר הכימי המקורי (NCL). פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על DCAF1, כמו גם מולקולות אחרות של dcaf לצורך התמקדות נוגדנים קנצוני שלהם.

Introduction

נוגדנים לשחק תפקידים חשובים בתגובה החיסונית ומוראלית עבור נטרול של חיידקים פתוגניים ווירוסים1. עם זאת, נוגדנים מסוימים מפגין השפעות מזיקות לאורגניזמים, כגון נוגדנים מתגובתית באפקט ADE במהלך זיהום denv ונוגדנים מגיבים יותר במיאסטניה גראביס, שהיא מחלות אוטואימוניות2,3. האפקט ADE מתווכת על ידי הנוגדנים החוצה תגובתי שעושים את הגשר להתחבר denv ו הקולטן Fc הצגת תאים4,5, בעוד מיאסטניה גרביס נגרמת על ידי נוגדנים מוגזמת התוקפים קולטני אצטילכולין בין הצמתים של תאי התא. ברקמת שריר6,7 למרות שגישות אפקטיביות חלקית פותחו כדי לטפל במחלות אלה8,9, ללא ספק חיסול ישיר של נוגדנים מזיקים אלה יהיה להתקדם התערבויות.

לאחרונה, מולקולות DCAF אשר בעלי פונקציונליות כפולה, פותחו עבור נוגדנים ממוקד חסימת10. Dcaf הוא פפטיד ארוך המורכב מ 3 חלקים: 1) חלק אנטיגן שיכול ספציפי לזהות את הנוגדן קנצוני, 2) fc-iii או השלישי-4c תג עבור מחייב מאוד את האזור fc של נוגדן לעכב או קולטן fc או המשלים חלבונים רכיב , 3) מקשר ארוך α-helical המעלה את שתי הקבוצות האלה פונקציונלי10. החלק המקשר, שתוכנן מתחום מוסין FERM, היה ממוטב על ידי תוכנת Rosseta כדי להבטיח את החלק אנטיגן ו-Fc-III חלק במולקולה DCAF יכול לאגד את האזורים Fab ו Fc של IgG בו. ארבעה מולקולות DCAF יש כבר מסונתז ליעד 4 נוגדנים שונים, ביניהם DCAF1 השתמשו כדי לחסל את הנוגדן 4G2, אשר הוא נוגדן חוצה תגובתי במהלך זיהום DENV לתרום לאפקט ADE; ו DACF4 נועד להצלת קולטני אצטילכולין ידי חסימת mab35 נוגדן במיאסטניה גרביס10.

במחקר הנוכחי, נלקח DCAF1 כדוגמה, הצגנו את הפרוטוקולים לסינתזה של מולקולה dcaf ואת הזיהוי של האינטראקציה בין dcaf ו נוגדן קנצוני שלה. הDCAF1 הוא מסונתז למחצה על ידי הגישה משנת11,12,13,14, אשר מעלה באוב את נגזרות הידראזין של פפטיד Fc-III ואת החלקים מתבטא-אנטיגן ביחד. הגישה NCL יש יתרונות משמעותיים על גבי סינתזה כימית מלאה ביטוי מלא רקומביננטי עבור סינתזה DCAF1, כי שתי שיטות אלה להוביל תשואה נמוכה ועלות גבוהה. הגישה הנוכחית היא לא רק הדרך החסכונית ביותר כדי לקבל את DCAF באורך מלא, אבל גם יכול לשמור על היווצרות של חלק המקשר דומה לצורתו הטבעית. מאז שונים מולקולות dcaf יש רצפים דומים למעט החלקים אנטיגן, השיטות שלנו לסינתזה DCAF1 ואת הקושי האינטראקציה בין DCAF1 ו 4g2 נוגדן ניתן להחיל מולקולות אחרות dcaf כדי ממוקדות לחסום נוגדנים קנצוני שלהם גם.

Protocol

1. הסינתזה הכימית של ה הידראזין של פפטיד Fc-III

  1. המרת 2-Cl-(Trt)-Cl שרף ל 2-Cl-(Trt)-NHNH2 שרף
    1. שוקלים 625 מ"ג של 2-Cl-(Trt)-קלרנית שרף (0.25 ממול) לתוך כלי סינתזה של 25 מ"ל.
    2. הוסף 5 מ ל של N, N-diמתיל (DMF) אל שרף מראש הספינה, לשים את הכובע בחזרה, לנער בעדינות את הכלי עבור 15 s ולאחר מכן לנקז אותו. חזור על שטיפת DMF לעוד פעמיים.
    3. הוסף 5 מ ל diלורומטן (DCM) על כלי הקיבול, לשים את הכובע בחזרה, לנער בעדינות את הכלי עבור 15 s ולאחר מכן לנקז אותו. חזרו על כביסה במשך פעמיים נוספות.
    4. חזור על השלב 1.1.2 שלוש פעמים.
    5. השתמש 6 mL של 50% (vol/vol) DMF/DCM כדי להתנפח את שרף עבור 30 דקות, ולאחר מכן לנקז אותו.
    6. העברה 6 מ"ל 5% (vol/vol) NH2nh2 ב dmf לכלי תגובה, לנער את התערובת ב 120 Rpm, 30 ° צ' עבור 30 דקות, ולאחר מכן לנקז את הפתרון על ידי משאבת ואקום.
      הערה: הוסף 0.3 mL של הידראזין מימה ל 5.7 mL של DMF כדי לקבל 5% (vol/vol) NH2nh2. טרי להכין NH2nh2 לפני השימוש.
      התראה: הידראזין מימה הוא חומר מסוכן ועלול לגרום לסרטן. , תלבש חלוק מעבדה. כפפות ומסכה בצעו את הניסויים. בתוך מכסה המנוע
    7. הוסף 5 מ ל של DMF לכלי, בעדינות לנער אותו 15 s ולאחר מכן לנקז אותו.
    8. חזור על שלב 1.1.6 ולאחר מכן רחץ את השרף על-ידי שלבים חוזרים 1.1.2-1.1.4 במשך פעמיים.
    9. הוסף 6 מ ל 5% (vol/vol) MeOH/DMF לכלי, בעדינות לנער אותו 10 דקות ולאחר מכן לנקז אותו.
      הערה: צעד זה חשוב מאוד כדי להבטיח את האתרים בלתי מגיב על שרף מוכתרים.
    10. לשטוף את שרף ביסודיות על ידי חוזר צעדים 1.1.2-1.1.4.
    11. להוסיף 5 מ"ל של DCM כדי שרף, לנער אותו בעדינות עבור 15 s ולאחר מכן לנקז אותו כדי להשיג 2-Cl-(Trt)-NHNH2 שרף.
      הערה: השרף הופך לצהוב או ירוק בהיר כשההחלפה מוצלחת.
  2. התארכות פפטיד
    1. להוסיף 1 ממול של Fmoc-Ala-הו (934 mg) ו 0.95 מ מול 1-[bis (dimethylamino) מתילן]-1H-1, 2, 3-triazolo-[4, 5-b] pyridinium hexafluorophosphate 3-תחמוצת (HATU) (360 mg) לתוך צינור 5 מ"ל המכיל 3 מ ל של DMF.
      התראה: חשיפה לHATU עלולה לגרום לתגובה אלרגית. , תלבש חלוק מעבדה. כפפות ומסכה
    2. הוסף 2 ממול N, N-diאיזופרופילי (DIEA) (0.36 mL) לפתרון מומס ומערבולת עבור 0.5 – 1 דקות.
      הערה: שלב קריטי: ההפעלה צריכה להימשך לא יותר מ-5 דקות, כאשר חומצות האמינו המופעלות איאיזוזה מתוך הצורות הפעילות יותר של ה-N-forms הפחות הפעילים לאורך זמן.
    3. הוסף את Fmoc-Ala המופעל-או לכלי התגובה המכיל 2-Cl-(Trt)-NHNH2 שרף, מוכן משלב 1.1. לטלטל בעדינות על 120 סל ד, 30 ° צ' עבור 20 דקות ב שייקר בטמפרטורה קבועה, ולאחר מכן לנקז את הפתרון על ידי משאבת ואקום.
    4. הוסף 5 מ ל של DMF לשטוף את שרף, בעדינות לנער אותו 15 s ולאחר מכן לנקז אותו.
    5. להוסיף 1 ממול של Fmoc-Ala-הו (934 mg) ו 0.95 ממול של 2-(6-כלורו-1H-benzotriazole-1-yl)-1, 1, 3, 3-הטטרתלולוטייניום hexafluorophosphate (מימן) (390 mg) לצינור 5 מ ל המכיל 3 מ ל של DMF.
      התראה: חשיפה לכצ-טו יכולה לגרום לתגובה אלרגית. , תלבש חלוק מעבדה. כפפות ומסכה
    6. הוסף 2 mmol DIEA (0.36 mL) לצינור ומערבולת עבור 0.5 – 1 דקות כדי לפזר אותו.
    7. הוסף את Fmoc-Ala המופעל-או לכלי התגובה. לטלטל בעדינות על 120 סל ד, 30 ° צ' עבור 40-60 דקות ב שייקר בטמפרטורה קבועה, ולאחר מכן לנקז את הפתרון על ידי משאבת ואקום.
    8. רוחצים את השרף על ידי חזרה על השלבים 1.1.2-1.1.4.
    9. הוסף 4 מ ל של 20% (vol/vol) פיפרידין ב dmf כדי שרף, בעדינות לנענע אותו 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לנקז את הפתרון.
      התראה: פירידין הוא דליק מאוד רעיל. בצעו את הניסויים. בתוך מכסה המנוע
    10. הוסף עוד 4 מ ל של 20% (vol/vol) פיפרידין ב dmf כדי שרף, בעדינות לנער אותו עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לנקז את הפתרון.
    11. בצע את השלבים 1.2.1-1.2.10 לזוג ולהגן על Fmoc-Ala-או, Fmoc-או, Fmoc-Cys-הו, Fmoc-שלו-או ו Fmoc-לה-הו. חזור על שלבים 1.2.5-1.2.10 לזוג וליטול הגנה על Fmoc-Trp-או, Fmoc-Val-הו, Fmoc-Leu-הו, Fmoc-לגלו-או, Fmoc-בסדר-הו ו-Fmoc-Asp-הו.
    12. חזור על שלבים 1.1.2-1.1.4 כדי לשטוף את שרף ביסודיות.
    13. חזור על השלב 1.1.3 לשטוף את שרף ולאחר מכן ואקום-יבש שרף עבור 5 דקות.
  3. פצילות ההיהידראזין הנגזרות של פפטיד גולמי-III
    1. הוסף 12 מ ל של הקוקטיילים trifluoroacetic חומצה (TFA)/2, 2 ′-(ethylenedioxy) diethanethol (DODT)/הטריאיזופרופיל (טיפים)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) כדי שרף, ולאחר מכן להשתמש בטמפרטורה קבועה שייקר כדי קליב פפטיד מן שרף ב 200 rpm, 37 ° c בערך 2 כ ' מסננים את התערובת לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL.
    2. להוסיף 1 מ ל של קוקטיילים לתוך שרף לשטוף אותו ולאסוף את פילטרט לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL. . אני חוזר פעמיים
    3. רכזו את התערובת ל-2 מ ל על ידי רוטור של מצנני בתוך מכסה המנוע, ולאחר מכן הוסיפו 20 מ ל של האתר דיאתיל מקורר לתוך הצינור כדי לזרז את הפפטידים הגולמיים.
      הערה: האתר האנטומי צריך להיות מקורר עד 0 ° צ' כדי להימנע משחרור חום אלים, העלול לגרום לתגובות צדדיות של הפפטיד הגולמי.
    4. מודקון את המשקעים פפטיד ב-20 ° c עבור 1-2 h.
    5. צנטריפוגה ב 5,000 x g, 4 ° צ' עבור 10 דקות ולהסיר את הממס מצינור הצנטריפוגה בזהירות.
    6. הוסף 20 מ ל של האתר דיאתיל מקורר לתוך הצינורית פעמיים על פי השלבים 1.3.3-1.3.5 לשטוף את המשקעים. האוויר יבש את המוצר פפטיד בתוך שעון זכוכית במשך כ 15 דקות. לאחסן את הפפטידים מיובש גולמי ב 4 ° צ' לניתוח נוסף.
  4. טיהור נגזרת של הידראזין של פפטיד Fc-III
    1. השתמש במערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים כדי לטהר את הפפטיד על-ידי הגבלת מעבר של 30 דקות (0-1 דקות, 5% B; 1-20 דקות, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) בקצב זרימה של 1 mL/min.
      הערה: העמודה היא ב 4.6 מ"מ ID, 250 mm אורך, גדוש שרף C-18. שלב נייד A כללה 0.1% TFA במים, והשלב הנייד B כללה 100% acetonitrile ו 0.1% TFA.

2. ביטוי חלבון וטיהור של חלקי מקשר ואנטיגן

  1. בנייה פלסמיד
    1. לסנתז את רצף הגנים כולו שיכול לבטא סומו-מקשר-אנטיגן (ראה טבלת חומרים).
    2. גזור 10 ng PET-28a וקטור ריק ו 50 ng של השבר מסונתז סומו-מקשר-אנטיגן-DNA באמצעות NcoI ו XhoI באמבט מים 37 ° c עבור 3 h.
    3. לטהר את הווקטור כפול אנזים מתעכל ו-DNA קטע על ידי ה-DNA ג'ל החילוץ ערכת.
    4. להוסיף 5 μl של dna מתעכל מקטע דנ א, 5 μl של וקטור מתעכל, 1 μl של T4 לליגאז DNA, 2 μl של מאגר ליגאז 10x ו -7 μl של ddh2O כדי צינור התגובה, ולאחר מכן מעכלת אותו לילה ב 16 ° c.
    5. מערבבים 10 μL של המוצר הנוגע משלב 2.1.4 לתוך 100 μL של תאים המוסמכים (DH5α) ולשים אותו על אמבט קרח 30 דקות. לשים את התאים המוסמכים ל 42 מעלות באמבטיה מים עבור 90 s ומהר להעביר אותו לאמבט קרח עבור 2 דקות. הוסף 800 mL של LB בינוני נוזלי (ללא אנטיביוטיקה) לצינור ולנענע ב 37 ° c, 180 סל ד עבור 1 h. מעיל את התאים המוסמכים על לוחית ליברות Kanamycin כדי להפוך אותם מופץ באופן שווה, ולשים את הצלחת לתוך החממה 37 ° c בלילה.
    6. לבחור 5 מושבות יחיד מן הצלחת ואת התרבות חיידקים 5 מ ל ליברות בינונית במבחנה באמצעות 37 ° c שייקר.
    7. לחלץ את הפלמידים מן החיידקים שנקטפו משלב 2.1.6 באמצעות ערכת הפקת פלאמיד.
    8. לשלוח את הפלמידים עבור רצפי גנים ולבחור את המושבה החיובית אשר יכול לבטא סומו-מקשר-אנטיגן היתוך חלבון. שינוי הצורה החיובית לBL21 (DE3) התאים המוסמכים לאחר שלב 2.1.5.
  2. טיהור חלבון
    1. בחר מושבה אחת של transformants משלב 2.1.7 לתוך 5 מ ל של ליברות בינונית נוזלית המכילה kanamycin (50 μg/mL). לנער את התרבויות לילה ב 200 סל ד, 37 ° c.
    2. מחסן 1 L של מדיום למחצה מחומם המכיל kanamycin (50 μg/mL) בבקבוקון עם 5 מ ל של תרבויות לילה, ולגדול ב 37 ° צ' עם טלטול נמרץ, עד OD600 הוא 0.6.
    3. להוסיף איזופרופיל β-D-thiogalactoside (IPTG) לתוך המדיום לריכוז הסופי של 0.4 מ"מ, ולטלטל את הבקבוקון ב 200 rpm לילה ב 20 ° c.
      הערה: הטמפרטורה הנמוכה של האינדוקציה לחלבונים חשובה להימנע מהיווצרות הגוף, לכן ודא כי הטמפרטורה היא לא יותר מ-22 ° c.
    4. לאחר לקצור את התאים, להוסיף 50 mL של מאגר הליזה כדי כדורי התא כדי להשעות מחדש את התאים. Sonicate את התא lysates פעמיים עבור 5 דקות ב 200 W, אולטרסאונד 3 s, מרווח 3 s על הקרח. צנטריפוגה אותו על 15, 000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° צ' כדי לאסוף את supernatants.
      הערה: מאגר הליזה מורכב מ-50 מ"מ2PO4, 300 מ"מ הנאל, 10 מ"מ סרפירון. התאם את ערך ה-pH ל-8.0 באמצעות NaOH.
    5. הוסף 2 מ ל 50% Ni-נ. ת. ע. מאגר הליזה, אל הסופרנטנים הנוקו וערבבו בעדינות על ידי טלטול (200 סל ד על שייקר רוטרי) ב -4 ° c עבור 1 h.
    6. טען את התערובת ליפוסט ובין נ. ת. א לתוך טור עם השקע התחתון הכתיר, ולהסיר את הכובע התחתון ולמחוק את העמודה הזרימה.
    7. כביסה שלוש פעמים עם 6 מ ל של מאגר לשטוף, ולאחר מכן elute לאחר מכן החלבון ממוקד 3 פעמים עם 1.5 mL של מאגר משחרלי. לאסוף את האלוטה בצינור אחד.
      הערה: מאגר הכביסה מורכב מ-50 מ"מ2PO4, 300 מ"מ הנאל, 30 מ"מ סרמאזול. התאם את ערך ה-pH ל-8.0 באמצעות NaOH. מאגר להתחמק מורכב 50 mM נה2PO4, 300 מ"מ הנאל, 250 מ"מ. התאם את ערך ה-pH ל-8.0 באמצעות NaOH.
    8. לשים את משחרל שקית דיאליזה ב 1 L של 50 mM PBS ב 4 ° צ' כדי desalt חלבון. החלף תמיסת מלח (PBS) חדשה באגירה במשך 3 פעמים.
  3. פצילות של תג סומו
    1. הוסף 2 מ ל של משנה כמו אוביקוויב בדומה (סומו) מתויג חלבון בריכוז של 1 מ"ג/mL, 1 מ ל הסומו פרוטאז (לראות את הטבלה חומרים), 1 מ ל של 10 x סומו מאגר פרוטאז ו 6 ML של ddh2O כדי להכין את פתרון התגובה.
      הערה: תג סומו הריכוז חלבון הוא כ 1 מ"ג/mL. ריכוזים מוגזמת לאחר שעיכול האנזים עלול לגרום לקרישת החלבון.
    2. מודג את התערובת עבור 12-16 h ב 4 ° c.
    3. צנטריפוגה את התערובת ב 15,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולמחוק את האגרגטים. הוסף 0.5 mL של 50% Ni-נ. ת. ע., מלווה על ידי 50 mM PBS, כדי 10 mL מנוקה supernatants ולערבב בעדינות על ידי טלטול (200 rpm על שייקר רוטרי) ב 4 ° צ' עבור 60 דקות.
    4. העמיסו את התערובת ליפוסט ובתוך טור עם השקע התחתון הכתיר. הסר את המכסה התחתון ולאחר מכן לשמור את הזרימה דרך לתוך שפופרת צנטריפוגה 15 מ"ל.
      הערה: חלבון סומו הייגלגד מחייב בטור. החלק המקשר-אנטיגן, אשר מתחיל עם Cys עבור התגובה NCL, הוא בזרימה דרך.
    5. צנטריפוגה את הזרם בתוך 15,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולמחוק את האגרגטים. לטהר את חלק המקשר-אנטיגן באמצעות השימוש ב-באמצעות ובקרה על ידי הגבלת מעבר של 25 דקות (0-1 דקות, 5% B; 1-3 דקות, 15% B; 3-20 דקות, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) בקצב זרימה של 1 mL/min.
      הערה: העמודה היא ב 4.6 מ"מ ID, 250 mm אורך, גדוש שרף C-18. שלב נייד A כללה 0.1% TFA במים, והשלב הנייד B כללה 100% acetonitrile ו 0.1% TFA.
    6. לאסוף את המוצר מטוהרים מתוך היום, ולאחר מכן להקפיא יבש לילה כדי לקבל את המוצר מקשר אנטיגן.

3. הרכבת DCAF1 על ידי הסתה כימית מקורית

  1. מעלה באוב-פפטיד III ו מקשר-החלק אנטיגן יחד
    1. שוקלים 1.8 מ"ג (1 μm) של נגזרת הידרzine של פפטיד Fc-III לתוך צינור 2 mL EP ולהוסיף 0.8 mL של 6 M GnHCl ב 0.2 M נה2PO4 (pH 3.0) פתרון לפזר אותו על ידי vortexing.
      הערה: 6 M GnHCl ב 0.2 M נה2PO4 (pH 3.0) הפתרון מוכן על ידי התאמת ערך ה-PH עם HCl או naoh.
      התראה: NaOH ו-HCl הם מאוד מאכל. , תלבש חלוק מעבדה. כפפות ומסכה
    2. לאחר תפרידו הצינור ב 7,200 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, לשים את הצינור באמבט מלח קרח ולהשתמש ערבוב מגנטי כדי להתסיס את הפתרון עבור 15 דקות בעדינות.
    3. הוסף 40 μL של 0.5 M NaNO2 לפתרון כדי להתחמצן על קבוצת הידראזין. מתפרעים בעדינות את הפתרון לעוד 15 דקות באמבט מלח הקרח.
    4. לשקול ולהוסיף 11 מ"ג של מקשר מטוהרים-אנטיגן חלק הכין משלב 2.3 ו 13.6 mg של 4-mercaptophenהMPAA חומצה (לתוך צינור התגובה באמבט מלח קרח, מערבבים עבור 5 דקות, ולאחר מכן להתאים את ערך ה-pH ל 6.8-7.0 בטמפרטורת החדר עם 6 מ NaOH.
      הערה: התאמת ערך ה-pH לנייטרלי היא הצעד הקריטי ליזום התגובה הנגדית.
    5. אחרי 12 h, להוסיף 0.4 mL של 0.1 M טריס (2-carboxyethyl) פוספלין הידרוכלוריד (TCEP) פתרון נייטרלי (pH 7.0) למערכת התגובה ומערבבים 20 דקות כדי לסיים את התגובה.
      הערה: 0.1 M TCEP פתרון נייטרלי (pH 7.0) מוכן על ידי המסת TCEP ב 6 M GnHCl ב 0.2 M נה2PO4 (pH 3.0) פתרון, ושימוש naoh כדי להתאים את ערך ה-pH כדי 7.0.
    6. צנטריפוגה את הצינור ב 15,000 x g עבור 10 דקות, ולאחר מכן לנתח ולטהר את המוצר הקשר עם האנליזה על ידי הימנעות 26 דקות מעבר הדרגתי (0-1 דקות, 5% b; 1-21 דקות, 45% B; 21-22 min, 85% b; 22-26 דקות, 85% b) בקצב זרימה של 1 mL/min. התשואה הצפויה לתגובה הנגדית היא מעל 50%.
      הערה: העמודה היא ב 4.6 מ"מ ID, 250 mm אורך, גדוש שרף C-18. שלב נייד A כללה 0.1% TFA במים, והשלב הנייד B כללה 100% acetonitrile ו 0.1% TFA.
  2. דסולפוריזציה של המשלים
    1. לפזר את המשלים (3.4 mg, 0.3 μm) מוכן משלב 3.1.6 ב 50 μL של 6 מ ' GnHCl ב 0.2 M נה2PO4 (pH 7.0) פתרון.
    2. הוסף 50 μL של 1 M TCEP, 10 μL של Tבוש ו-5 μL של 0.1 M VA-044 פתרון לתערובת הנ ל.
      הערה: 0.1 M VA-044 פתרון מוכן על ידי המסת 9.7 mg של VA-044 אבקה לתוך 0.3 mL של 6 M GnHCl ב 0.2 M נה2PO4 (pH 7.0) פתרון. The VA-044 הפתרון צריך להיות מוכן טרי לפני השימוש, כמו VA-044 הוא תחמוצת בקלות על ידי חשיפה לאוויר.
    3. להתאים את ה-pH הסופי של הפתרון כדי 6.9 ולשמור את מסיסות 37 ° צ' עם ערבוב עבור כ 5 h.
    4. צנטריפוגה את הצינור ב 15,000 x g עבור 10 דקות ולהסיר את החומר בלתי מסיסים. לנתח ולטהר את המוצר הנוגע באמצעות הניתוח על ידי הימנעות מדרגה של 26 דקות (0-1 דקות, 20% B; 1-21 דקות, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 דקות, 85% B) בקצב זרימה של 1 mL/min. התשואה הצפויה לתגובת הדסולפוריזציה היא כ-40%.
      הערה: העמודה היא ב 4.6 מ"מ ID, 250 mm אורך, גדוש שרף C-18. שלב נייד A כללה 0.1% TFA במים, והשלב הנייד B כללה 100% acetonitrile ו 0.1% TFA.
  3. הסרת Acm לקבלת המוצר הסופי DCAF1
    1. לפזר את פפטיד (1.35 mg, 0.11 μm) מוכן שלב 3.2.4 ב 200 μL של 32 mM AgOAc, ולאחר מכן לערבב את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר עבור 4 h.
    2. הוסף 3 μL של 1M Dithioitol (DTT) ב 6 M GnHCl ב 0.2 M נה2PO4 (pH 7.0) פתרון כדי להמיר את thiolates כסף על פפטיד ל-thiols חינם.
    3. לאחר ערבוב באלימות עבור 1 דקות, צנטריפוגה את הצינור ב 15,000 x g עבור 10 דקות כדי למחוק את החומר בלתי מסיסים. לנתח ולטהר את המוצר הסופי עם הבחינה באמצעות בחינת מעבר של 26 דקות (0-1 דקות, 20% B; 1-21 דקות, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) בקצב זרימה של 1 mL/min. התשואה הצפויה לתגובת ההגנה של Acm היא כ -30%.
      הערה: העמודה היא ב 4.6 מ"מ ID, 250 mm אורך, גדוש שרף C-18. שלב נייד A כללה 0.1% TFA במים, והשלב הנייד B כללה 100% acetonitrile ו 0.1% TFA.
    4. לאחר טיהור הבחינה, להקפיא יבש את המוצר הסופי לילה, ולפזר את האבקה ב-PBS (50 mM נה2PO4, 150 מ"מ הנאל, pH 8.0). צנטריפוגה את הצינור ב 15,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולמחוק את הגלולה.
    5. להתאים את ריכוזי המוצר הסופי (משלב 3.4) ואת המקשר-אנטיגן חלק (משלב 2.3.6) כדי 10 μM, להקליט את קיווטות מעגלי (CD) ספקטרום מ 260 אל 195 nm של שני מוצרים אלה באמצעות ספקטרומטר CD ב 25 ° צ' עם אורך הנתיב 1 מ"מ.
      הערה: ספקטרה CD משמשים כדי להדגים את כמות α המבנה ההרשמי במוצר הסופי הוא דומה לזה ברקומביננטי הביע אחד.

4. זיהוי המוצרים לפי ספקטרומטר מסה

  1. הפרד את המוצר מכל תגובה כימית על ידי הימנעות מהדרגה 60 דקות (0-8 דקות, 2% ב; 8-10 דקות, 5% B; 10-35 דקות, 30% B; 35-50 דקות, 50% B; 50-52 דקות, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 דקות, 2% ב) בקצב זרימה של 0.300 μL/min עם מערכת ננו-כמיטים אשר משולבת ישירות עם ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.
    הערה: הטור האנליטי הוא 75 יקרומטר ID, 150 מ"מ אורך, גדוש עם שרף C-18. השלב הנייד A כללה 0.1% החומצה פורמית במים, ו השלב הנייד B כללה 100% acetonitrile ו 0.1% פורמית חומצה.
  2. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב סריקה מלאה והגדר את טווח m/z ב-300-2000 וברזולוציה ב-60,000.
  3. פתח את הנתונים ספקטרום מסה ולמצוא את הפסגות של המוצר בכל שלב כדי לאשר את התגובה הכימית מראש בהצלחה.

5. שיטת אליסה של האינטראקציה בין נוגדן DCAF1 ו-4G2

  1. מעיל 96-ובכן מיקרוטיטר צלחת עם נוגדן נגד מGT 1 (ראה טבלת חומרים) ב 100 μl של מאגר ציפוי/ובכן, לאטום את הצלחת ו מודקת אותו ב 4 ° c לילה על שייקר.
  2. לחסום כל טוב עם 200 μL של 1% BSA ב-PBS, לאטום את הצלחת ואת מודקת אותו בטמפרטורת החדר עבור 1 h על שייקר.
  3. שטוף כל היטב 4 פעמים באמצעות PBS עם 0.05% רצף 20.
  4. הוסף את החלבון האנטיגן GT-התמזגו (0.05 pmol ב 100 μL of חסימת פתרון) לבארות, לאטום את הצלחת ואת הדגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: החיידק של GT-התמזגו מתבטא בחיידקים ומטוהרים על ידי GSH ספרד.
  5. חזור על השלב 5.3 כדי לשטוף את הצלחת.
  6. הוסף נוגדן 1 pmol 4g2 או 1 pmol עומת נוגדן 4g2 בתוספת ליגטרים אחרים: אנטיגן, Fc-III או DCAF1 בכמויות הסדרה (0.1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol ו 1000 pmol) ב 100 μl של פתרון חסימה/ובכן, לחתום את הצלחת ו-דגירה 2 h ב
  7. חזור על השלב 5.3 כדי לשטוף את הצלחת.
  8. הוסף אנטי עכבר IgG, הנוגדן המקושר החוצה (1:20000 דילול) ב 100 μL של פתרון חסימה/ובכן, לחתום את הצלחת ו דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.
  9. שטוף כל היטב 6 פעמים באמצעות PBS עם 0.05% רצף 20.
  10. מערבבים TMB מגיב A ו-B 1:1 בנפח מיד לפני השימוש, להוסיף 100 μL/ובכן, ולאחר מכן דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  11. הוסף 100 μL/באר של פתרון עצירה, והשתמש בקורא צלחת כדי למדוד את הערכים OD450 עבור כל באר בתוך 30 דקות.

6. שיטת אליסה של האינטראקציה בין Fc-III ו IgG מולקולה

  1. מעיל 96-היטב microtiter עם הנוגדן 1 לנגד CA (ראה טבלת חומרים) ב 100 μl של מאגר ציפוי/ובכן, לחתום את הצלחת ו מודקת אותו ב 4 ° c לילה על שייקר.
  2. חזור על הצעדים מ 5.2 עד 5.3.
  3. להוסיף את Fc-III או Fc-III-4C CA התמזגו חלבון (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 ו 1 pmol ב 100 μL של חסימת פתרון) לבארות, לאטום את הצלחת ואת הדגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: ה-Fc-III או Fc-III-4C התמזגו חלבון CA מבוטא בחיידקים ומטוהרים על ידי Ni-נ. ת. א.
  4. חזור על הצעדים מ 5.7 עד 5.11 ובדוק את התוצאות.

תוצאות

תרשים הזרימה של תוואי הסינתזה על-ידי הארכה כימית מקורית במאמר זה מוצג באיור 1. דמויות 2-6 מציגות את כרומטוגרמות (A) וספקטרום מסה (ב) של נגזרות כימיות מסונתז הידראזין של פפטיד Fc-III, רקומביננטי הביע מקשר וחלק אנטיגן, המוצר הטהור מתגובת ncl, הטוהר מוצר מתג...

Discussion

הפרוטוקול מתאר להלן את הסינתזה והזיהוי של DCAF1 באמצעות גישת NCL, המוצגת באיור 1. בקצרה, שני שברי DCAF1 הם מסונתז כימי recombinantly ביטא, בהתאמה; לאחר מכן, אורך מלא DCAF1 מולקולה מורכב, שונה ומטוהר. לצורך הידראזין הנגזר הסינתזה של החלקיק השלישי, שימוש ב-2-Cl בעל קיבולת נמוכה, הוא די חשוב, מכיוו...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי קרן שערי אוניברסיטת Tsinghua (לא. OPP1021992), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (no. 21502103, 21877068 ו 041301475), ואת תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (no 2017YFA0505103).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Chlorotrityl resinTianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxideGL Biochem00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphateGL Biochem00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochlorideJ&K Scientific503236
4G2 antibodyThermoMA5-24387
4-mercaptophenylacetic acidAlfa AesarH27658
96-well microtiter platesNEST701001
AcetonitrileThermo-FisherA955MS Grade
AgOAcSinopharm Chemical Reagent30164324
anti-GST antibodyAbclonalAE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7076P2
BSABeijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometerApplied Photophysics Ltd
dialysis bagSbjbioSBJ132636
DichloromethaneSinopharm Chemical Reagent80047360
diethyl etherSinopharm Chemical Reagent10009318
DNA Gel Extraction KitBeyotimeD0056
Fusion Lumos mass spectrometerThermo
GSH SepharoseGE Lifesciences
Guanidine hydrochlorideSinopharm Chemical Reagent30095516
Hydrazine hydrateSinopharm Chemical Reagent80070418
Hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagent10011018
imidazoleSIGMA12399-100G
Isopropyl β-D-ThiogalactosideSIGMA5502-5G
kanamycinBeyotimeST101
MethanolThermo-FisherA456MS Grade
N, N-DiisopropylethylamineGL Biochem90600
N, N-DimethylformamideSinopharm Chemical Reagent8100771933
NcoIThermoER0571
PBS bufferSolarbioP1022
Peptide BEH C18 ColumnWaters186003625
piperidineSinopharm Chemical Reagent80104216
Plasmid Extraction KitSangon BiotechB611253-0002
QIAexpress KitQIAGEN32149
Rapid DNA Ligation KitBeyotimeD7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrateSinopharm Chemical Reagent20040718
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent10019762
Sodium nitriteSinopharm Chemical Reagent10020018
sodium chlorideSinopharm Chemical Reagent10019318
Standard Fmoc-protected amino acidsGL Biochem
sterilizing potTomySX-700
SUMO ProteaseThermo Fisher12588018
stop solutionBiolegend423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigenTaihe Biotechnology Compay
TMB reagentBiolegend421101
Trifluoroacetic acidSIGMAT6508
TriisopropylsilaneGL Biochem91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideAladdinT107252-5g
tryptoneOXOIDLP0042
Tween 20SolarbioT8220
Ultimate 3000 HPLCThermo
vacuum pumpYUHUASHZ-95B
XhoIThermoIVGN0086
yeast extractOXOIDLP0021

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151DCAF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved