在微流体进化加速器上生成跨癌症人群的异构药物梯度，用于实时观察

摘要

我们提出了一个微流体癌片模型，即"进化加速器"技术，它为在单细胞明确定义的环境条件下癌症动力学的长期实时定量研究提供了一个可控的平台水平。这项技术有望成为基础研究或临床前药物开发的体外模型。

摘要

传统的细胞培养仍然是最常用的临床前模型，尽管它被证明是有限的能力，预测癌症的临床结果。提出了微流体癌片模型，以弥合过于简化的传统二维培养法与更复杂的动物模型之间的差距，后者产生可靠和可重复的定量结果的能力有限。在这里，我们提出了一个微流体癌片模型，该模型以全面的方式再现复杂肿瘤微环境的关键成分，但简单到足以提供可靠的癌症动力学定量描述。这种微流体癌片模型"进化加速器"将大量癌细胞分解成一系列相互关联的肿瘤微环境，同时生成异构化疗应激环境。癌症在药物梯度反应下的进展和进化动态可以实时监测数周，并且可以进行许多下游实验，以补充实验过程中拍摄的延时图像。

引言

癌症已日益被公认为是一个复杂的生态系统，它不仅取决于突变细胞群的持续调节，还取决于癌细胞与宿主微环境之间的重要相互作用。从这个意义上说，癌症在一个适应性的景观上进化，表现为多种因素，包括异质肿瘤微环境和与各种宿主细胞的串扰，所有这些都为进一步的遗传或表观遗传变化^1，2，3。在实体肿瘤的情况下，化疗和其他资源梯度分布不均匀，有助于其分子异质性，并可能在耐药性的发展中发挥作用，增加特定肿瘤的血管生成亚种群，甚至转移4，5，6。传统的体外二维细胞培养研究，虽然拥有大规模、方便的实验能力，但提供均场、均匀和固定条件，往往缺乏真正所需的精确的空间和时间环境控制模拟体内肿瘤动力学。因此，需要更具代表性的外体模型在药物开发管道中的动物模型之前重现肿瘤微环境，以便更好地预测癌症进展以及动态压力内对药物的反应景观。微流体学已被提出来弥合二维细胞培养研究与更复杂的体内动物研究之间的差距，这些研究可能无法支持可控的定量^{研究7、8、9。}

一个理想的体外系统来描述癌细胞动力学应该具有产生异构微环境的能力，以模拟在肿瘤中可能发生的适应性细胞反应，并允许在单细胞分辨率。在本文中，我们描述了一个微流体细胞培养平台，一种基于PDMS的设备，称为"进化加速器"（EA），它允许在细胞分辨率下对癌细胞动力学进行平行体外研究，并实时采集周，同时稳定地保持整个文化景观的压力梯度。这个平台的设计是基于我们以前的工作，其中生物体的进化动力学在元种群可以^{加速10，11。}具体来说，在一组空间分离的种群中，当暴露于异质应力景观时，与大型统一种群相比，最适合的物种可以更快地在本地种群中占据主导地位。有利的物种然后迁移到邻近的微生境，以寻找资源和空间，并最终主宰整个种群。如图1所示，微流体EA芯片的图案由（i）一对蛇形通道组成，这些通道提供新鲜的介质循环，为化学扩散构造固定边界条件;（ii）六边细胞培养区它由109个相互连接的六角形和24个半六角形室组成，中间类似蜂窝结构。芯片深度为100μm。介质通道和细胞培养区域与小切线（约15μm宽）相连，防止直接介质流动和产生的剪切应力穿过细胞培养区，但仍允许化学物质通过小切线扩散并交换营养成分，代谢废物等。化学梯度的产生如图1B所示，其中一个介质通道含有0.1 mM的荧光，而另一个通道不含荧光。细胞在气体渗透膜上培养，通过膜上对芯片的正背压由微观结构封装。图2说明了器件支架的部件，实验设置如图3所示，在37°C的倒置显微镜上保持培养，相对湿度超过85%，并在诺莫夏气体成分。

该系统通过明场和荧光通道提供局部细胞相互作用的详细观察，并允许在空间上解决下游测定，如免疫荧光、西显孔或质谱。我们之前已经证明，这种微流体癌片上模型在上皮和中位PC3前列腺癌^细胞12的长期共培养，以及耐药性多倍体巨的出现，作为原理的证明癌细胞使用上皮PC3细胞^系13。尽管我们介绍了该平台的应用，以了解上皮PC3和间质性前列腺癌细胞在多西他塞的应力梯度下的时空动力学，但微流体系统可以很容易地应用于细胞系的任意组合和资源（即药物、营养、氧气）梯度。

研究方案

1. 微流体装置的制造

1. 使用布局设计软件生成所需的微流体模式（参见补充材料）。
2. 制作照片蒙版。有关详细信息，请参阅材料表。
   1. 利用激光书写器，在涂有 100 nm Cr 和 500 nm 光刻胶 AZ1518 的苏打石灰玻璃板上书写图案。
   2. 与开发人员 AZ300MIF 共同开发光刻胶，使用 60 s。
   3. 使用 Cr-7 铬蚀刻剂，无需保护光刻胶。
   4. 在 70°C 下使用光胶剥离残余光胶 45 分钟。
3. 图案的光刻胶。有关详细信息，请参阅材料表。
   1. 在 4000 rpm 的硅晶圆上旋转涂层 HMDS 40 s。
   2. 在 4000 rpm 的硅晶圆上旋转涂层光刻器 AZ4330，40 s。
   3. 在 95°C 下软烘烤硅片 60 s。
   4. 利用面膜对准器将紫外线暴露在硅晶片中。
   5. 与开发人员 AZ300MIF 共同开发光刻胶 4 分钟。
4. 执行 DRIE 蚀刻。有关详细信息，请参阅材料表。
   1. 使用硅深反应 Ion 蚀刻 （DRIE） 系统对带光刻器图案的晶圆进行干蚀，深度为 100 μm。
   2. 用丙酮和等离子蚀刻去除带等离子蚀刻的光胶。
5. 晶圆氧化和硅化。有关详细信息，请参阅材料表。
   1. 在 1100 °C 的熔炉中蚀刻硅晶片上执行热氧化 1 小时。
   2. 等待硅晶片冷却，然后将晶圆放入干燥器中，滴下几滴三氯-1H、1H、2H、2H-全氟基硅烷 （PFOTS）滴在晶圆附近的一个小容器中。
   3. 在室温下将干燥器的压力泵送至 0.5 atm 60 分钟。硅晶片模具在适当硅化后应具有疏水性，可以通过在晶圆上加入几滴水来进行测试。
6. 软光刻。有关详细信息，请参阅材料表。
   1. 按重量比率将预聚合物和交叉链接器（来自聚甲基硅氧烷 （PDMS） 试剂盒）混合。
   2. 将混合 PDMS 倒入硅片模上，将高度为 10 mm 的薄膜浇注到硅片模具上。
   3. 在干燥器中将产生的 PDMS 硅晶圆系统除气 30 分钟至 1 小时。
   4. 在70°C的培养箱中孵育PDMS硅晶片过夜，以治愈PDMS。
   5. 一旦PDMS固化，小心地从硅片上剥下PDMS薄膜。
   6. 使用活检针，根据 PDMS 上图案的位置在入口口打孔，并使用圆形冲孔切割直径为 27 mm 的芯片。
7. PDMS 层粘接。
   1. 热固化两叠27毫米PDMS气缸（无图案），这将成为设备的储层和封盖层。
   2. 在储层层入口周围切出两个 7 mm 的圆圈，并使用活检针在封顶层的进气口打孔。
   3. 将三叠 PDMS（图案堆栈、储层、封顶层）与氧等离子体处理结合。
   4. 使用活检针，在设备插座和中心端口打孔。

2. 培养和细胞系

1. 准备培养PC3细胞系的培养介质，包括PC3-EMT和PC3-EPI:将RPMI 1640介质与10%胎儿牛血清（FBS）和1x抗生素抗菌药混合。生成前¹⁴所述的细胞线。
   注:PC3细胞系在加湿培养箱中保持在37°C，CO₂为5%。分裂细胞和亚培养每3天，才达到100%汇合。
2. 转染细胞系与细胞质标记荧光标记更好的可视化，如^前面12所述，使PC3-EMT表示细胞质GFP和PC3-EPI表示细胞质mCherry。请注意，该技术还与任何荧光标记细胞以及未标记细胞的明场成像兼容。

3. 实验设置

1. 金属板支架的制造
   1. 制作一个板架，该支架足以同时容纳可透气培养皿，通过加工或 3D 打印进行并行实验。3D CAD 文件（"3 孔板"。FCStd"）可以在 GitHub 上找到作为参考（https://github.com/kechihl/3-well-plate）。
   2. 用螺丝刀拧下支架的部件 （图 2） .通过紫外线照射对部件进行消毒至少 1 小时，并在无菌环境中离开。
      注:支架设计为热平衡和理想气体成分提供实质性条件，气体通道入口允许气流。更多细节可以在我们以前^的工作12中找到。
   3. 准备多达三个透气培养皿，其中细胞培养膜相对灵活。
2. 细胞系播种
   1. 在实验开始前24小时，通过胰蛋白化5分钟收获PC3-EPI和PC3-EMT细胞。加入预热培养物，然后在150 x g下离心3分钟，并丢弃上清液。
   2. 使用血细胞计计算每个 PC3-EPI 和 PC3-EMT 的细胞，并为每个可渗透培养皿分离每个细胞类型的 2.5 x 10^4。
   3. 在2 mL培养基中混合和重新悬浮两种细胞类型，并将细胞播种到每个透气培养盘中。
   4. 将整个板架放在培养箱中过夜，以便细胞附着。
   5. 通过紫外线照射对 PDMS 设备进行消毒至少 1 小时，并在无菌环境中离开。
3. 设置热控制单元和供气系统
   1. 如图3所示，建立了一个供气系统，该系统由CO2和O ₂控制单元、气体泵、气体混合室、加湿器或气泡器以及三套独立的气体阀和压力表组成。更多细节可以在我们以前^的工作12中找到。
   2. 设置 CO₂和 O₂控制单元，以便它们从 CO₂和 N 2 储罐和 O₂源调整气体的混合速率。或者，任何在诺莫夏条件下提供气体的供气系统都起作用。
   3. 确保混合室中结合的气体通过气泡加湿，使相对湿度增加高达 85%（从相对湿度监视器中读取），并且气体通向三个带压力表的独立气体阀，以便 控制和监控板架中的气体流量。
   4. 将整个板架放在一个带独立加热子单元的舞台上孵化热控制单元中，用于盖子和底板，所有单元均设置为 37°C。有关详细信息，请参阅材料表。
4. 微流体装置的安装。有关详细信息，请参阅材料表。
   1. 确定 3 孔板支架的详细部件顺序，如图2 所示。三口井都是相同且独立的，每口井都有一对气道。每口井都拥有可透气培养皿支架、PDMS 芯片支架、玻璃窗架和一对 35 mm 玻璃窗。这些部件可以使用安装的螺钉进行组装。
      注:玻璃窗可确保透气培养膜与井之间有热隔离空间，因此界面上不发生水冷凝。请注意，3口井是独立的，3个实验可以单独完成。
   2. 在37°C下预温培养基，在真空室中脱气20分钟。
   3. 使用氧等离子体系统处理 PDMS 芯片 30 s，以保持亲水性。
   4. 设置注射器系统。用生长培养物缓慢地装入两个注射器，用所需的兴趣试剂（介质、带药物的介质等）缓慢地装上两个注射器。将每个单独的注射器连接到 50 厘米管（ 0 . 020 x 0 . 060OD ）上，通过 23 胶针连接到一个空心钢销中。将空心钢销插入管的另一端。
   5. 给油管加注，并通过封盖层将钢销插入每个 PDMS 芯片中。填充储层，用介质润湿 PDMS 图案层图案。储层层用作片上气泡陷阱，以防止气泡进入微流体模式。
   6. 使用培养培养物加载 1 mL 注射器。将注射器连接到 5 厘米管（ 0 . 020 x 0 . 060OD ），通过 23 胶针连接到一个空心钢销中。将空心钢销插入管的另一端，使管部充油。
   7. 将空心钢销插入芯片的中心孔中，在芯片密封过程中，稍后可以从芯片中抽出过多的介质。
   8. 由于每个 PDMS 设备需要将四个 10 mL 注射器加载到注射器泵上，因此在前进甲板上每个芯片上加载两个 10 mL 注射器。将另外两个注射器放在注射器系统的退出甲板上。
   9. 将芯片直接放在透气培养膜的顶部（细胞已附着在膜上）。为了避免微流体模式中的微气泡缠绕，在组装前将预热和脱气介质分配1 mL到35mm透气培养皿中，然后确保芯片以15度倾斜角度接近液体表面。
   10. 用PDMS芯片架向下推PDMS器件，将可透气培养皿和井夹在每个芯片的透气培养盘支架中。
   11. 将一块保压器板贴在 PDMS 设备顶部，用 PDMS 芯片支架夹紧，以防止芯片干燥。
   12. 将阵列周围的介质流速设置为 20 μL/h。
   13. 在倒置显微镜的电动舞台上将整个板设置在舞台上的培养箱中。将供气系统连接到气体通道，对已安装的 PDMS 芯片加压气体渗透培养膜，以确保设备密封。将仪表压力保持在 0.2 psi（1.4 x 10⁴ Pa）。
   14. 使用 1 mL 注射器从中心孔中缓慢提取芯片中的过多介质。在提取介质时观察显微镜下的芯片，然后在芯片密封时停止提取。芯片密封应该是显而易见的，因为细胞的一部分将被微结构压碎。
   15. 将舞台培养箱的温度感应单元连接到 3 孔板，并设置为 37°C。

4. 单单元延时成像

1. 利用倒置显微镜设置成像软件进行延时图像采集。请注意，EA 实验需要具有完全电动 x-y 级、对焦旋钮、快门和滤镜立方体的倒置荧光显微镜。
2. 配置软件，以 10 倍的放大倍率获取两个通道上的图像，在一轮自动对焦后自动拼接图像。请注意，像完美对焦这样的自动校正系统并不能保证令人满意的图像质量。更建议根据芯片上的自动对焦或手动对焦生成自定义对焦表面，以便进行长期图像采集。
3. 每小时拍摄一次图像，让实验以数周的时间尺度运行。每天监控图像质量，必要时更新对焦表面。
4. 准备PDMS芯片和气体渗透培养皿，以便后续免疫荧光分析，如^前13所述。

5. 图像处理和分析

1. 实验后处理
   1. 利用斐济/ImageJ 将图像转换为 TIFF 格式，用于图像处理和测量。
   2. 压缩 TIFF 文件，以便进一步处理图像。
2. 斐济/图像J分析
   1. 要识别细胞，请执行背景减法和粒子分析，以识别用于细胞位置检测和自动细胞计数的荧光亮点。
   2. 利用插件（手动跟踪、化学跟踪、迁移工具、跟踪伙伴）来分析细胞运动和迁移。

结果

芯片上最佳细胞生长的验证
实验平台的主要目标是在复杂的肿瘤微环境中全面再现关键成分和相互作用，但简单到足以提供定量、可靠和可重复的数据。只有完全控制物理和生化环境因素，才能实现这一目标。我们必须排除不需要的因素，或者找出一种方法，将无法控制的因素纳入定量模型，以正确解释人口行为。

讨论

传统细胞培养技术是近一个世纪前发展起来的，尽管事实证明，它^{预测癌症临床}结果的能力有限，但它仍然是生物医学研究中最常用的临床前模型。动物模型具有最高的生理相关性和合理的基因相似性，但长期以来，人们一直承认在预测^{人类结果方面}存在重大局限性。在现有的所有临床前模型中，微流体癌片模型似乎是最有前途的候选者，以满足癌症研究未满?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL BD Luer-Lok tip syringes	BD	14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955	1x anti-anti
AZ 300 MIF	Merck KGaA	18441123163	Photoresist developer
AZ1518	Merck KGaA	AZ1518	Photoresist
AZ4330	Merck KGaA	AZ4330	Photoresist
Cr Chromium Etchant	Sigma-Aldrich	651826
Fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation	10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter	Heidelberg Instruments	DWL66+	Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	379212	For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins	New England Small Tube	NE-1300-01	.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame	ibidi	10929	On-stage incubator
Luer-Lok 23 G dispensing needle	McMaster-Carr	75165A684	To connect syringes and tubings
Lumox dish 35	Sarstedt	94.6077.331	Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165	Dow Electronic Materials	Microposit Remover 1165	Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing)	McMaster-Carr	9452K114	Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing)	McMaster-Carr	9452K74	Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System	Plasmatic Systems, Inc	Plasma-Preen	Oxygen plasma system
RPMI 1640	Life Technologies Corporation	11875-093
Samco RIE800iPB DRIE	Samco	RIE800iPB	Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner	SUSS MicroTec	MA6	Mask aligner
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Fisher Scientific	NC9285739	PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher	PVA TePla	M4L	Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)	Sigma-Aldrich	448931	For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD)	Cole-Parmer	EW-06419-01	Tubings for media delivery