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要約

マイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」技術を提示し、単一細胞における明確な環境条件下でがんダイナミクスを長期リアルタイムで定量的に研究するための制御可能なプラットフォームを提供します。レベル。この技術は、基礎研究や前臨床薬開発のためのインビトロモデルとしての働きが期待されます。

要約

従来の細胞培養は、がんの臨床結果を予測する能力が限られているにもかかわらず、最も頻繁に使用される前臨床モデルのままである。マイクロ流体がんオンチップモデルは、過度に単純化された従来の2D培養と、信頼性が高く再現可能な定量的結果を生み出す能力が限られている、より複雑な動物モデルとの間のギャップを埋めるために提案されている。ここでは、複雑な腫瘍微小環境の主要成分を包括的に再現するマイクロ流体がんオンチップモデルを紹介しますが、がんダイナミクスの堅牢な定量的記述を提供するのに十分簡単です。このマイクロ流体がんオンチップモデル「エボリューションアクセラレータ」は、がん細胞の大量を相互接続された腫瘍微小環境に分解し、異種化学療法ストレスランドスケープを生成します。薬物勾配に応答する癌の進行と進化的ダイナミクスは、リアルタイムで数週間監視することができ、多数の下流実験は、実験の過程で撮影されたタイムラプス画像を補完して行うことができます。

概要

がんは、変異細胞集団の継続的な調節不全だけでなく、癌細胞と宿主の微小環境との間の重要な相互作用にも依存する複雑な生態系としてますます認識されています。この意味で、癌は、異種腫瘍微小環境および様々な宿主細胞とのクロストークを含む要因の組み合わせによって現れる適応的な風景に進化し、そのすべてがさらなる遺伝的またはエピジェネティックな変化1,2,3.固形腫瘍の文脈では、化学療法および他の資源勾配の不均一な分布は、その分子不均一性に寄与し、薬剤耐性の開発に役割を果たし、特定の腫瘍に対する血管新生の増加を果たすかもしれない亜集団、さらには転移4、5、6.従来のインビトロ2D細胞培養研究は、大規模で便利な実験能力を有する一方で、平均分野、均一、固定条件を提供し、多くの場合、真に必要な正確な空間的および時間的な環境制御を欠いている。生体内腫瘍ダイナミクスをエミュレートします。したがって、がんの進行をより良く予測し、動的ストレス内の薬物に対する応答を改善するために、薬剤開発パイプラインにおける動物モデルの前に腫瘍微小環境を再現するために、より代表的なex vivoモデルが必要とされています。風景。マイクロ流体学は、制御可能な定量的研究7、8、9をサポートすることができないかもしれない生体内動物研究における2D細胞培養研究とより複雑な間のギャップを埋めるために提案されている。

がん細胞のダイナミクスを特徴付ける理想的なインビトロシステムは、腫瘍で起こり得る適応細胞応答を模倣する不均一な微小環境を生成する能力を有し、また、単一セル解像度。本稿では、細胞分解能におけるがん細胞ダイナミクスのインビトロ研究を可能にするPDMSベースのデバイスであるマイクロ流体細胞培養プラットフォームについて、リアルタイムのデータ取得を用いて細胞分解能を用いて説明する。文化景観全体のストレスの勾配を安定的に維持しながら、数週間のコース。このプラットフォームの設計は、メタ集団における生物の進化的ダイナミクスを加速することができる我々の前の研究に基づいています10,11.具体的には、あるレベルで相互作用する空間的に分離された集団のグループでは、異種ストレス景観にさらされると、最も適合する種は、大規模な均一集団のそれと比較して、より速く地元の集団で支配することができます。有利な種は、資源と空間を求めて近隣の微生物生息地に移動し、最終的には全人口を支配する。図1に示すように、マイクロ流体EAチップのパターンは、(i)新鮮な媒体循環を提供し、化学拡散のための固定境界条件を構築する一対の蛇行チャネル、および(ii)六角形細胞培養領域で構成される。これは、ハニカム構造に似て、中央に109の相互接続された六角形と24の半六角形の部屋で構成されています。チップの深さは100μmです。培地チャネルと細胞培養領域は、小さなスリット(幅約15μm)と接続されており、直接の培地の流れを防ぎ、細胞培養領域全体で生じるせん断応力を防ぎますが、それでも化学物質が小さなスリットを通して拡散し、栄養素を交換することができます。代謝廃棄物等化学勾配の生成は図1Bで示され、一方のメディアチャネルには0.1 mMのフルオレセインが含まれ、もう一方のチャネルにはフルオレセインが含まれな場合があります。細胞はガス透過性膜上で培養され、チップに対する膜上の正の背圧を介して微細構造によって封入される。デバイスホルダーの構成要素を図2に示し、実験セットアップを図3に示し、培養は37°Cの反転顕微鏡で維持され、85%以上の相対湿度で、条件付けされています。ノルモキシアガス組成物。

このシステムは、ブライトフィールドおよび蛍光チャネルを介して局所的な細胞相互作用の詳細な観察を提供し、免疫蛍光、ウェスタンブロット、質量分析などの空間的に分解された下流アッセイを可能にします。我々は、上皮および間葉系PC3前立腺癌細胞12の長期共培養および薬剤耐性ポリプロイド巨人の出現に関するこのマイクロ流体癌オンチップモデルの原理の証明として以前に実証した。上皮PC3細胞株13を用いて癌細胞。このプラットフォームの応用は、上皮PC3とドセタキセルのストレス勾配下での間葉前立腺癌細胞の時空間的ダイナミクスを理解するために提示するが、マイクロ流体系は細胞株の任意の組み合わせに容易に適用することができる。およびリソース(すなわち、薬物、栄養素、酸素)勾配。

プロトコル

1. マイクロ流体装置の製造

  1. レイアウト設計ソフトウェアを使用して、目的のマイクロ流体パターンを生成します (補足資料を参照)。
  2. フォトマスクを製作します。詳細については、材料の表を参照してください。
    1. レーザーライターを利用して、100nmのCrと500nmのフォトレジストAZ1518でコーティングされたソーダライムガラスプレートにパターンを書きます。
    2. 60 s の開発者 AZ300MIF とフォトレジストを開発します。
    3. Cr-7クロムエッチングを使用してフォトレジストから保護することなくクロムを離します。
    4. 70°Cでフォトレジストストリッパーを使用して残留フォトレジストを45分間取り除きます。
  3. フォトレジストをパターンにします。詳細については、材料の表を参照してください。
    1. シリコンウェーハ上のスピンコートHMDSは40sの4000 rpmで。
    2. シリコンウエハ上のスピンコートフォトレジストAZ4330は40sの4000 rpmで。
    3. シリコンウェーハを95°Cで60sで柔らかく焼きます。
    4. マスクアライナーを使用して、シリコンウェーハにUVを露出します。
    5. 4分間、開発者AZ300MIFとフォトレジストを開発します。
  4. DRIE エッチングを実行します。詳細については、材料の表を参照してください。
    1. 100 μmの深さのシリコン深反応性イオンエッチング(DRIE)システムを使用してフォトレジストでパターン化されたウエハをドライエッチングします。
    2. プラズマエッチャーでアセトンとプラズマエッチングでフォトレジストを取り除きます。
  5. ウエハ酸化とサイレン化。詳細については、材料の表を参照してください。
    1. 1100°Cの炉内のエッチングシリコンウエハに熱酸化を1時間行います。
    2. シリコンウェーハが冷却するのを待ってから、ウェーハの近くの小さな容器に滴下されたトリクロロ-1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチルシラン(PFOTS)の数滴でデシケータにウエハを入れます。
    3. 60分間室温で0.5気圧にデシケータの圧力をポンプ。シリコンウエハ型は、適切なサイレン化後に疎水性になる必要があり、これはウエハに水のいくつかの液滴を加えることによってテストすることができる。
  6. 柔らかいリソグラフィー。詳細については、材料の表を参照してください。
    1. プレポリマーとクロスリンカー(ポリメチルシロキサン(PDMS)キットから)を10:1の重量比で混合します。
    2. 混合PDMSを注ぎ、高さ10mmのフィルムをシラン化されたシリコンウエハ型に作成します。
    3. 得られたPDMS-シリコンウエハシステムをデシケータで30分~1時間退出させる。
    4. PDMS-シリコンウエハを一晩70°Cインキュベーターでインキュベートし、PDMSを硬化させる。
    5. PDMSが硬化したら、慎重にシリコンウエハからPDMSフィルムを剥がします。
    6. 生検針を使用して、PDMS上のパターンの位置に基づいて入口ポートでスルーホールをパンチし、直径27mmのチップを切断するために円形のパンチを使用します。
  7. PDMS 層の接着。
    1. 熱は、デバイスの貯水池層とキャッピング層になる27ミリメートルPDMSシリンダー(パターニングなし)の2つのスタックを治します。
    2. 貯水池層の入口の周りに2つの7mmの円を切り取り、生検針を利用してキャッピング層の入口ポートでスルーホールをパンチします。
    3. 酸素プラズマ処理とPDMS(パターンスタック、貯水池層、キャッピング層)の3つのスタックを結合します。
    4. 生検針を使用して、コンセントとデバイスの中央ポートにスルーホールをパンチします。

2. 媒体および細胞株の準備

  1. PC3-EMTおよびPC3-EPIを含むPC3細胞株を培養するための培養培養培養剤を調製する:10%の胎児ウシ血清(FBS)および1x抗生物質抗菌薬と1倍の抗生物質抗菌薬とRPMI 1640培地を混合する。前述の14.
    注:PC3細胞株は、5%CO2で37°Cで加湿インキュベーターで上記の培地で維持される。細胞とサブ培養を3日ごとに分割し、100%合流に達する。
  2. 細胞質標識蛍光マーカーを用いたトランスフェクト細胞株は、前述の12のように、PC3-EMTが細胞質GFPおよびPC3-EPIを発現するように、細胞質性標識蛍光マーカーを用いて細胞質を発現させる。この技術は、任意の蛍光標識細胞だけでなく、標識されていない細胞の明視野イメージングと互換性があることに注意してください。

3. 実験的なセットアップ

  1. 金属板ホルダーの製作
    1. 機械加工や3Dプリンティングによる並列実験用のガス透過性培養皿を同時に保持するのに十分なプレートホルダーを製造します。3D CADファイル(「3ウェルプレート。FCStd")は、参照としてGitHubで見つけることができます(https://github.com/kechihl/3-well-plate)。
    2. ホルダー(図2)のコンポーネントをドライバーで外します。少なくとも1時間の紫外線暴露を介して成分を消毒し、無菌環境に残します。
      注:ホルダーは、熱平衡と理想的なガス組成物に実質的な条件を提供するように設計されており、気流を可能にするガスチャネル入り江を備えています。詳細については、前作12.
    3. 細胞培養膜が比較的柔軟である3つまでのガス透過性培養皿を準備する。
  2. 細胞株の播種
    1. 実験開始の24時間前に、PC3-EPIおよびPC3-EMT細胞を5分間トリプシン化して収穫し、予備培養培地を追加し、次いで150xgで3分間遠心分離機を行い、上清を廃棄する。
    2. 各PC3-EPIおよびPC3-EMTの細胞をヘモサイトメーターを用いてカウントし、各ガス透過性培養皿に対して各細胞タイプの合計2.5 x 104を単離する。
    3. 2つの細胞タイプを培養培養培養液の2mLに混合し再中断し、各ガス透過性培養皿に細胞を播種する。
    4. 細胞が付着するために、プレートホルダー全体をインキュベーターに一晩残します。
    5. 少なくとも1時間の紫外線暴露を介してPDMSデバイスを消毒し、無菌環境に残します。
  3. 熱制御ユニットとガス供給システムの設定
    1. 図3に示すように、CO2とO2制御ユニット、ガスポンプ、ガス混合室、加湿器またはバブラー、およびガスバルブと圧力計の3つの別々のセットで構成されるガス供給システムをセットアップします。詳細については、前作12.
    2. CO 2 および O2制御ユニットをセットアップし、CO2および N2タンクと O2ソースからのガスの混合速度を調整します。あるいは、ノルモキシア条件下でガスを供給するガス供給システムは機能します。
    3. 混合室に組み合わされ、バブラーによって加湿されたガスは、相対湿度が最大85%増加し(相対湿度モニターから読み取られるように)、ガスが圧力計を持つ3つの独立したガスバルブにつながることを確認してください。 板のホールダーのガス流量を制御し、監視する。
    4. プレートホルダー全体を、蓋と底板用に別々の加熱サブユニットを備えたステージインキュベーション熱制御ユニットに入れ、すべてのユニットを37°Cに設定します。詳細については、材料の表を参照してください。
  4. マイクロ流体装置のインストール。詳細については、材料の表を参照してください。
    1. 図 2のように、3 ウェル プレート ホルダーの詳細なコンポーネントが順番に並んでいることを確認します。3つの井戸のそれぞれは、各井戸のためのガスチャネルのペアで、同一で独立しています。すべての井戸はガス透過性の培養皿ホルダー、PDMSチップホルダー、ガラス窓ホルダー、および35mmガラス窓のペアを所有しています。これらの部品は合ったねじを使用して組み立てることができる。
      注:ガラス窓は、ガス透過性培養膜と井戸の間に熱的に隔離された空間があることを保証し、界面の温度差により水の凝縮が起こらないようにします。なお、3つの井戸は独立しており、3つの実験は別々に行うことができる。
    2. 37°Cで温める前培地と20分間真空室での脱気を行う。
    3. 親水性を維持するために、30秒の酸素プラズマシステムを使用してPDMSチップを処理します。
    4. シリンジシステムをセットアップします。成長培地と他の2つの注射器(メディア、薬物を含むメディアなど)で2つの注射器をゆっくりとロードします。個々のシリンジを50cmチューブ(0.020インチx0.060インチOD)に23Gの分配針で1本の中空鋼ピンに接続します。中空のスチールピンをチューブのもう一方の端に挿入します。
    5. チューブをプライムし、キャッピング層を通して各PDMSチップにスチールピンを挿入します。貯水池の層を埋め、メディアでPDMSパターン層パターンを濡らします。リザーバ層は、気泡がマイクロ流体パターンに入るのを防ぐために、オンチップバブルトラップとして機能します。
    6. 培養媒体で1mLの注射器をロードします。注射器を5cmチューブ(0.020インチx0.060インチOD)に23Gの分配針で1本の中空鋼ピンに接続します。チューブのもう一方の端に中空のスチールピンを挿入し、チューブをプライムします。
    7. 中空鋼ピンをチップの中央穴に挿入し、チップシールプロセス中に後で過剰なメディアをチップから抽出できます。
    8. 各PDMSデバイスは、シリンジポンプにロードされた4つの10 mLシリンジを必要とするように、フォワードデッキのチップごとに2つの10 mLシリンジをロードします。他の2つの注射器を注射器システムの引き出しデッキに置きます。
    9. ガス透過性培養膜の上にチップを直接置きます(細胞が膜に既に付着しています)。マイクロ流体パターンにマイクロバブルを巻き込むのを避けるために、組み立て前に35mmのガス透過性培養皿に1mLの予備温めおよび脱気媒体を分配し、チップが15度の傾斜角で液体表面に近づくことを確認します。
    10. PDMSチップホルダーがPDMSデバイスを押し下げ、各チップのガス透過性培養皿ホルダーにガス透過性培養皿と井戸をクランプします。
    11. PDMSデバイスの上にシーラーのシートをテープで留め、チップが乾燥するのを防ぐためにPDMSチップホルダーでクランプします。
    12. アレイ周辺のメディア流量を20 μL/hに設定します。
    13. 反転顕微鏡の電動ステージ上のステージインキュベーターにプレート全体をセットします。ガス供給システムをガスチャネルに接続し、取り付けられたPDMSチップに対してガス透過性培養膜を加圧して、デバイスのシールを確保します。ゲージ圧力を 0.2 psi (1.4 x 104 Pa) に維持します。
    14. センターホールから1mLシリンジを使用して、チップ内の過剰な培地をゆっくりと抽出します。培法中に顕微鏡下でチップを観察し、チップが密閉されたときに抽出を停止します。細胞の一部が微小構造によって押しつぶされるので、チップシールは明らかであるべきです。
    15. ステージインキュベーターの温度検出ユニットを3ウェルプレートに接続し、37°Cに設定します。

4. 単一細胞のタイムラプスイメージング

  1. 反転顕微鏡を利用したイメージングソフトウェアをタイムラプス画像集録に設定する。EA実験には、完全に電動化されたx-yステージ、フォーカスノブ、シャッター、フィルターキューブを備えた反転蛍光顕微鏡が必要です。
  2. オートフォーカスの1ラウンド後に自動画像ステッチを使用して、各チップの2つのチャンネルで10倍の倍率で画像を取得するようにソフトウェアを設定します。パーフェクトフォーカスのような自動補正システムは、満足のいく画質を保証しないことに注意してください。チップ全体のオートフォーカスまたは手動フォーカスに基づいて、長期的な画像集録用にカスタマイズされたフォーカスサーフェスを生成することをお勧めします。
  3. 1 時間ごとに画像を撮影し、数週間の時間スケールで実験を実行したままにします。日常的に画質を監視し、必要に応じてフォーカスサーフェイスを更新します。
  4. 前述の13に記載されているように、その後の免疫蛍光分析のためにPDMSチップおよびガス透過性培養皿を調製する。

5. 画像処理・解析

  1. 実験後の処理
    1. フィジー/ImageJを利用した画像処理と測定のためのTIFF形式に画像を変換します。
    2. TIFF ファイルを圧縮して、さらに画像処理を容易にします。
  2. フィジー/イメージJ分析
    1. 細胞を識別するには、バックグラウンド減算と粒子解析を実行して、細胞位置検出および自動細胞カウントのための蛍光明るいスポットを識別します。
    2. プラグイン(手動トラッキング、ケモタキシス、マイグレーションツール、トラックメイト)を使用して、細胞の運動性と移行を分析します。

結果

チップ上の最適な細胞増殖の検証
実験プラットフォームの主な目標は、複雑な腫瘍微小環境における主要なコンポーネントと相互作用を包括的な方法で再現することですが、定量的で信頼性が高く再現可能なデータを提供するのに十分なシンプルな方法です。この目標は、物理的および生化学的な環境要因を完全に制御できる場合にのみ達成できます?...

ディスカッション

従来の細胞培養はほぼ1世紀前に開発され、がん17の臨床結果を予測する実証済みの限られた能力にもかかわらず、生物医学研究で最も頻繁に使用される前臨床モデルのままである。動物モデルは、ヒトに対して最も高い生理学的関連性と合理的な遺伝的類似性を提供するが、ヒトの結果を予測する上で重要な限界があることを長い間認められてきた18。す?...

開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

この作業はNSF PHY-1659940によってサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL BD Luer-Lok tip syringesBD14-823-16E
Antibiotic-AntimycoticSigma-AldrichA59551x anti-anti
AZ 300 MIFMerck KGaA18441123163Photoresist developer
AZ1518Merck KGaAAZ1518Photoresist
AZ4330Merck KGaAAZ4330Photoresist
Cr Chromium EtchantSigma-Aldrich651826
Fetal bovine serum (FBS)Life Technologies Corporation10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriterHeidelberg InstrumentsDWL66+Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS)Sigma-Aldrich379212For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pinsNew England Small TubeNE-1300-01 .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frameibidi10929On-stage incubator 
Luer-Lok 23 G dispensing needleMcMaster-Carr75165A684To connect syringes and tubings
Lumox dish 35Sarstedt94.6077.331Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165Dow Electronic MaterialsMicroposit Remover 1165Photoresist stripper
Microseal B Adhesive SealerBio-Rad LaboratoriesMSB1001Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing)McMaster-Carr9452K114Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing)McMaster-Carr9452K74Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching SystemPlasmatic Systems, IncPlasma-PreenOxygen plasma system
RPMI 1640Life Technologies Corporation11875-093
Samco RIE800iPB DRIESamcoRIE800iPBDeep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask alignerSUSS MicroTecMA6Mask aligner 
Sylgard 184 Silicone ElastomerFisher ScientificNC9285739PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcherPVA TePlaM4LPlasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)Sigma-Aldrich448931For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD)Cole-ParmerEW-06419-01Tubings for media delivery

参考文献

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