Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real

Resumo

Nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta, a tecnologia do "acelerador evolução", que fornece uma plataforma controlável para estudos quantitativos em tempo real a longo prazo da dinâmica do cancro dentro das condições ambientais bem definidas no único-Cell Nível. Espera-se que esta tecnologia funcione como um modelo in vitro para pesquisa fundamental ou desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

Resumo

A cultura celular convencional continua sendo o modelo pré-clínico mais freqüentemente utilizado, apesar de sua comprovada capacidade limitada de prever resultados clínicos em câncer. Modelos de câncer microfluídico em chip têm sido propostos para colmatar a lacuna entre as culturas 2D convencionais supersimplificadas e modelos animais mais complicados, que têm capacidade limitada para produzir resultados quantitativos confiáveis e reprodutíveis. Aqui, nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta que reproduz componentes chaves de um microambiente complexo do tumor em uma maneira detalhada, contudo é simples bastante fornecer descrições quantitativas robustas da dinâmica do cancro. Este modelo microfluídico de câncer em chip, o "Evolution Accelerator", divide uma grande população de células cancerosas em uma matriz interconectada de microambientes tumorais, gerando uma paisagem de estresse quimioterápico heterogêneo. A progressão e a dinâmica evolutiva do câncer em resposta ao gradiente de drogas podem ser monitoradas por semanas em tempo real, e inúmeros experimentos a jusante podem ser realizados de forma complementar às imagens de lapso de tempo tiradas no decorrer dos experimentos.

Introdução

O câncer tem sido cada vez mais reconhecido como um ecossistema complexo que depende não só da continuação da desregulação das populações de células mutadas, mas também de interações vitais entre as células cancerosas e o microambiente hospedeiro. Nesse sentido, o câncer evolui em uma paisagem adaptativa manifestada por uma combinação de fatores, incluindo um microambiente de tumor heterogêneo e conversa cruzada com uma variedade de células hospedeiras, todas as quais contribuem com pressões seletivas para mais genética ou alterações epigenéticas^1,2,3. No contexto de tumores sólidos, a distribuição desigual de quimioterápicos e outros gradientes de recursos contribui para sua heterogeneidade molecular e pode desempenhar um papel no desenvolvimento da resistência a fármacos, aumento da angiogênese para o tumor particular subpopulações e até mesmo metástase^4,5,6. Estudos de cultura de células 2D convencionais in vitro, possuindo capacidade experimental de grande escala e conveniente, proporcionam condições de campo médio, uniformes e fixas, muitas vezes faltando o controle ambiental preciso e espacial necessário para realmente emular a dinâmica tumoral in vivo. Assim, há a necessidade de modelos ex vivo mais representativos para reproduzir o microambiente tumoral antes dos modelos animais no pipeline de desenvolvimento de fármacos para uma melhor predição da progressão do câncer, bem como respostas a drogas dentro do estresse dinâmico Paisagens. Microfluínicos têm sido propostos para colmatar a lacuna entre estudos de cultura de células 2D e estudos em animais mais complexos in vivo que podem não ser capazes de suportar estudos quantitativos verificáveis^7,8,9.

Um sistema in vitro ideal para caracterizar a dinâmica das células cancerosas deve possuir a capacidade de gerar um microambiente heterogêneo para imitar as respostas celulares adaptativas que podem ocorrer em um tumor, bem como permitir a observação dessas dinâmicas em um resolução de uma única célula. Neste artigo, descrevemos uma plataforma de cultura de células microfluídico, um dispositivo baseado em PDMS chamado "Evolution Accelerator" (EA), que permite estudos paralelos in vitro de dinâmicas de células cancerosas em resolução celular com aquisição de dados em tempo real sobre o curso de semanas, enquanto mantendo estavelmente gradientes de stress em toda a paisagem da cultura. O projeto desta plataforma é baseado em nosso trabalho precedente, em que a dinâmica evolutiva dos organismos em um metapopulação pode ser acelerada^10,11. Especificamente, em um grupo de populações espacialmente separadas que interagem em algum nível, quando expostos a uma paisagem de estresse heterogêneo, as espécies mais aptos podem dominar em uma população local mais rapidamente em comparação com a de uma grande população uniforme. As espécies vantajosas então migram para os microhabitats vizinhos em busca de recursos e espaço, e eventualmente dominam toda a população. Como mostrado na Figura 1, o padrão do chip microfluídico ea é composto de (i) um par de canais serpentinos que fornecem circulação de mídia fresca e constroem condições de contorno fixo para difusão química, e (II) a região de cultura de células hexagonais que consiste em 109 câmaras sextavadas e 24 meio-hexagonais interconectadas no centro, assemelhando-se a uma estrutura alveolar. O chip é de 100 μm em profundidade. Os canais de mídia e a região da cultura celular estão conectados com pequenas fendas (cerca de 15 μm de largura), que impedem o fluxo direto de mídia e o estresse de cisalhamento resultante em toda a área de cultura celular, mas ainda permitem que os produtos químicos se difundem através de pequenas fendas e trocam nutrientes, resíduos metabólicos, etc. A geração de gradientes químicos é demonstrada na Figura 1B, onde um canal de mídia contém 0,1 mm de fluoresceina, enquanto o outro canal está livre de fluoresceina. As pilhas são cultivadas em uma membrana permeável do gás, encapsulada pelas microestruturas com a pressão traseira positiva na membrana de encontro à microplaqueta. Os componentes do suporte do dispositivo são ilustrados na Figura 2, e a configuração experimental é ilustrada na Figura 3, onde a cultura é mantida em um microscópio invertido a 37 ° c, com acima de 85% de umidade relativa, e condicionada composição do gás normóxia.

Este sistema fornece a observação detalhada de interações celulares localizadas através do brightfield e de canaletas fluorescentes e permite os ensaios a jusante espacialmente-resolvidos tais como a imunofluorescência, o borrão ocidental, ou a espectrometria maciça. Nós demonstramos previamente como uma prova--princípio deste modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta na cocultura a longo prazo de pilhas epithelial e mesenquimais do cancro da próstata PC3¹² assim como o emergence do gigante poliplóides da droga-resistência células cancerosas usando a linha celular PC3 epitelial¹³. Quando nós apresentamos a aplicação desta plataforma para compreender a dinâmica armazenamento de PC3 epithelial e de pilhas mesenquimais do cancro da próstata um inclinação do stress de docetaxel, o sistema microfluídicos pode facilmente ser aplicado a toda a combinação de linhas de pilha e recursos (i.e., drogas, nutrientes, oxigênio) gradientes.

Protocolo

1. fabricação de microfluídico dispositivo

1. Gere o padrão microfluídico desejado usando um software de design de layout (consulte materiais complementares).
2. Fabricar a máscara fotográfica. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
   1. Utilizando um gravador de laser, escreva o padrão em uma placa de vidro de soda-cal revestida com 100 nm de CR e 500 nm de fotororesista AZ1518.
   2. Desenvolva o fotoresistente com o colaborador AZ300MIF para 60 s.
   3. Etch afastado o cromo sem proteção do fotoresistente usando CR-7 Chromium Etchant.
   4. Descasque fora o fotoresistente residual usando um descascador do fotoresistente em 70 ° c por 45 minutos.
3. Teste padrão o photoresist. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
   1. Spin Coat HMDS em wafer de silício a 4000 rpm por 40 s.
   2. Spin Coat fotoresistente AZ4330 em wafer de silício a 4000 rpm por 40 s.
   3. Soft cozer a bolacha de silício a 95 ° c por 60 s.
   4. Utilize o alinhador da máscara para expor o UV à bolacha do silicone.
   5. Desenvolva o fotoresistente com o colaborador AZ300MIF por 4 minutos.
4. Execute a gravura DRIE. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
   1. Seque-grave a bolacha modelada com o fotoresistente usando um sistema de Etching reactivo do íon do silício (Drie) para a profundidade de 100 μm.
   2. Descasque fora o fotoresistente com acetona e o plasma etch com um etcher do plasma.
5. Oxidação e silanization da bolacha. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
   1. Realize a oxidação térmica no wafer de silício gravado em um forno a 1100 ° c por 1 h.
   2. Aguarde até que a bolacha de silício esfrie e, em seguida, coloque o wafer em um dessecador com algumas gotas de tricloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silano (PFOTS) gotejados em um pequeno recipiente perto da bolacha.
   3. Bombeie a pressão do exsicador a 0,5 ATM na temperatura ambiente por 60 minutos. O molde da bolacha do silicone deve tornar-se hydrofóbico após o silanization apropriado, que pode ser testado adicionando diversas gotas da água no Wafer.
6. Litografia suave. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
   1. Misture o pre-polímero e o cross-linker (do jogo do polimetilsiloxano (PDMS) em um 10:1 pela relação do peso.
   2. Despeje o PDMS misto para criar um filme de 10 mm de altura sobre o molde de wafer de silício SILANIZADOS.
   3. Degas o sistema de Wafer PDMS-silício resultante em um dessecador por 30 min a 1 h.
   4. Incubar a bolacha do PDMS-silicone em uma incubadora de 70 ° c durante a noite para curar o PDMS.
   5. Uma vez que o PDMS é curado, descasque a película de PDMS fora da bolacha do silicone com cuidado.
   6. Usando agulhas da biópsia, perfurar através-furos nas portas de entrada baseadas na posição do teste padrão no PDMS e empregar um perfurador circular para cortar microplaquetas 27 milímetros no diâmetro.
7. Colagem da camada de PDMS.
   1. Cura de calor duas pilhas de cilindros PDMS de 27 mm (sem padronização), que se tornará a camada de reservatório e a camada tampando do dispositivo.
   2. Corte dois círculos de 7 milímetros em torno das entradas na camada do reservatório, e utilize uma agulha da biópsia para perfurar através-furos nas portas de entrada na camada tampando.
   3. Bond três pilhas de PDMS (pilha modelada, camada do reservatório, camada tampando) com tratamento do plasma do oxigênio.
   4. Com a agulha da biópsia, perfure através-furos nas tomadas e na porta Center do dispositivo.

2. mídia e linha de célula de preparação

1. Prepare mídia para a cultura de linhas de células PC3, incluindo PC3-EMT e PC3-EPI: Misture o meio RPMI 1640 com soro bovino fetal a 10% (FBS) e 1x antibiótico-Antimicótico. Gere linhas de célula como descrito anteriormente¹⁴.
   Nota: as linhas celulares PC3 são mantidas na mídia acima em incubadoras humidificadas a 37 ° c com 5% de CO₂. Divida as células e subcultura a cada 3 dias, antes de atingirem 100% de confluência.
2. As linhas celulares do transfect com marcadores fluorescentes citoplasmáticos rotulados para melhor visualização, como descrito anteriormente¹², tal que PC3-EMT expressa GFP citoplasmático e PC3-EPI expressa mcherry citoplasmática. Note-se que a tecnologia também é compatível com quaisquer células fluorescentes-rotuladas, bem como imagem brightfield de células sem rótulo.

3. configuração experimental

1. Fabricação do suporte da placa de metal
   1. Fabricar um suporte da placa que seja suficiente para prender pratos de cultura gás-permeáveis simultâneos para experimentos paralelos fazendo à máquina ou à impressão 3D. O arquivo CAD 3D ("placa de 3 poços. FCStd ") pode ser encontrado no GitHub como uma referência (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
   2. Desaparafuse os componentes do suporte (Figura 2) com uma chave de fenda. Desinfete os componentes através da exposição UV durante pelo menos 1 h e deixe-o num ambiente estéril.
      Nota: o suporte é projetado para fornecer condições substanciais para o equilíbrio térmico e composições de gás ideal, com entradas de canal de gás que permitem o fluxo de ar. Mais detalhes podem ser encontrados em nosso trabalho anterior¹².
   3. Prepare até três pratos de cultura permeáveis a gás, dos quais a membrana de cultura celular é relativamente flexível.
2. Propagação da linha celular
   1. 24 horas antes do início do experimento, colheita de células PC3-EPI e PC3-EMT por tripsinização por 5 min. Adicionar meios de cultura pré-aquecido, em seguida, centrifugar a 150 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.
   2. Células de contagem de cada PC3-EPI e PC3-EMT usando um hemocitômetro e isolar um total de 2,5 x 10⁴ de cada tipo de célula para cada gás-permeável cultura prato.
   3. Misture e ressuscite os dois tipos de células em 2 mL de meios de cultura e semente as células em cada um dos gás-permeável cultura prato.
   4. Deixe todo o suporte da placa na incubadora durante a noite para que as células se fixem.
   5. Desinfecte os dispositivos PDMS através de exposição UV por pelo menos 1 h e deixe em um ambiente estéril.
3. Configurando unidade de controle térmico e sistema de abastecimento de gás
   1. Como mostrado na Figura 3, configurar um sistema de abastecimento de gás que consiste em ambas as unidades de controle co₂ e O₂ , uma bomba de gás, uma câmara de mistura de gás, um humidificador ou um borbulhador, e três conjuntos separados de válvulas de gás e medidores de pressão. Mais detalhes podem ser encontrados em nosso trabalho anterior¹².
   2. Configure as unidades de controle CO₂ e o₂ de forma que ajustem a taxa de mistura do gás dos tanques co₂ e N₂ e da fonte o₂ . Alternativamente, qualquer sistema de abastecimento de gás que fornece gás condição de normóxia funcionaria.
   3. Certifique-se que o gás que é combinado na câmara de mistura e humidificado por um Bubbler tal que a umidade relativa é aumentada até 85% (como lido para fora de um monitor da umidade relativa) e que o gás conduz a três válvulas de gás independentes com calibres de pressão a fim controle e monitore o caudal de gás no suporte da placa.
   4. Coloque todo o suporte da placa numa unidade de controlo térmico de incubação no palco com subunidades de aquecimento separadas para a tampa e a placa inferior, com todas as unidades situadas a 37 ° c. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
4. Instalação de dispositivo microfluídico. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
   1. Identifique que os componentes detalhados do suporte da placa de 3 poços estão em ordem, como na Figura 2. Cada um dos três poços são idênticos e independentes, com um par de canais de gás para cada poço. Cada poço possui um suporte gás-permeável do prato da cultura, um suporte da microplaqueta de PDMS, um suporte de vidro da janela, e um par de janelas de vidro de 35 milímetros. Estes componentes podem ser montados usando os parafusos ajustados.
      Nota: as janelas de vidro asseguram-se de que haja um espaço termicamente isolado entre a membrana da cultura gás-permeável e o poço tal que nenhuma condensação da água ocorre devido às diferenças da temperatura na relação. Note que os 3 poços são independentes, e 3 experimentos podem ser feitos separadamente.
   2. Meio de cultura pré-aquecido a 37 ° c e Degas em câmara de vácuo por 20 min.
   3. Trate os chips PDMS usando um sistema de plasma de oxigênio para 30 s, a fim de manter a hidrofilicidade.
   4. Configure o sistema da seringa. Carregue duas seringas lentamente com meios de crescimento e outras duas seringas com reagente de interesse desejado (meios de comunicação, meios de comunicação com drogas, etc.). Conecte cada seringa individual a uma tubulação de 50 cm (0, 20 "x 0.060" OD) por uma agulha de distribuição de 23 G em um pino de aço oco. Insira um pino de aço oco na outra extremidade da tubulação.
   5. Prime a tubagem e insere o pino de aço em cada chip PDMS através da camada de nivelamento. Encha acima a camada do reservatório e molhe o teste padrão da camada do teste padrão de PDMS com meios. A camada do reservatório trabalha como uma armadilha da bolha da em-microplaqueta para impedir que as bolhas de ar começ no teste padrão microfluídicos.
   6. Carregue uma seringa de 1 mL com meios de cultura. Conecte a seringa a uma tubulação de 5 cm (0, 20 "x 0.060" OD) por uma agulha de distribuição de 23 G em um pino de aço oco. Insira um pino de aço oco na outra extremidade da tubagem e prima a tubagem.
   7. Insira o pino de aço oco no furo central da microplaqueta, onde os meios excessivos podem ser extraídos para fora da microplaqueta mais tarde durante o processo da selagem da microplaqueta.
   8. Como cada dispositivo PDMS requer 4 10 mL seringas carregadas em uma bomba de seringa, carga 2 10 mL seringas por chip na plataforma para a frente. Coloque as duas outras seringas na plataforma de retirada do sistema da seringa.
   9. Coloque o chip diretamente no topo das membranas de cultura permeável a gás (com células já aderiram às membranas). A fim de evitar a entrada de microbolhas no padrão microfluídico, dispensar 1 mL de meios pré-aquecidos e desgaseificados no prato de cultura de gás permeável de 35 mm antes da montagem e, em seguida, certifique-se de que o chip se aproxima da superfície líquida com um ângulo de inclinação de 15 graus.
   10. Prenda o prato gás-permeável da cultura e o poço no suporte gás-permeável do prato da cultura para cada microplaqueta, com o suporte de microplaqueta de PDMS que empurra o dispositivo de PDMS para baixo.
   11. Tape uma folha de um aferidor na parte superior do dispositivo PDMS e braçadeira com o suporte de chip PDMS, a fim de evitar que o chip de secar.
   12. Defina a taxa de fluxo de mídia ao redor da matriz para 20 μL/h.
   13. Ajuste a placa inteira na incubadora do em-estágio na fase motorizada de um microscópio invertido. Conecte o sistema de fornecimento de gás aos canais de gás e pressurizando a membrana de cultura permeável a gás contra o chip PDMS instalado para garantir a vedação do dispositivo. Mantenha a pressão do calibre em 0,2 libras por polegada quadrada (1,4 x 10⁴ PA).
   14. Extraia lentamente a mídia excessiva no chip usando a seringa de 1 mL do orifício central. Observe o chip o microscópio durante a extração de mídia e, em seguida, parar de extrair quando o chip é selado. A selagem da microplaqueta deve ser óbvia desde que uma parte das pilhas seria esmagada pelas microestruturas.
   15. Ligue a unidade de detecção de temperatura da incubadora no palco à placa de 3 poços e defina a 37 ° c.

4. imagem de lapso de tempo de célula única

1. Configurar software de imagem utilizando um microscópio invertido para aquisição de imagens de lapso de tempo. Observe que um microscópio fluorescente invertido com estágio x-y totalmente motorizado, botão de foco, obturador e cubos de filtro é necessário para uma experiência de EA.
2. Configure o software para adquirir imagens em dois canais com ampliação de 10x para cada chip com costura automática de imagem após uma rodada de autofoco. Esteja ciente de que os sistemas de correção automática como o foco perfeito não garantem qualidade de imagem satisfatória. É mais recomendável gerar uma superfície de foco personalizada para aquisição de imagem de longo prazo com base em foco automático ou focagem manual em todo o chip.
3. Tire imagens a cada hora e deixe a experiência em execução na escala de tempo de semanas. Monitore a qualidade da imagem em uma base diária e atualize a superfície de foco, se necessário.
4. Prepare a microplaqueta de PDMS e o prato gás-permeável da cultura para a análise imunofluorescente subseqüente, como descrito previamente¹³.

5. processamento e análise de imagens

1. Processamento pós-experimental
   1. Converta imagens em formato TIFF para processamento de imagem e medições utilizando Fiji/ImageJ.
   2. Compacte arquivos TIFF para facilitar o processamento de imagens.
2. Análise de Fiji/ImageJ
   1. Para identificar células, realize subtração de fundo e análise de partículas para identificar pontos brilhantes fluorescentes para detecção de localização de células e contagem automática de células.
   2. Utilize plugins (rastreamento manual, quimiotaxia, ferramenta de migração, Trackmate) para analisar a motilidade celular e a migração.

Resultados

Validação do crescimento celular ideal no chip
Um dos principais objetivos da plataforma experimental é reproduzir os principais componentes e interações em um microambiente de tumor complexo de forma abrangente, mas simples o suficiente para fornecer dados quantitativos, confiáveis e reprodutíveis. Este objetivo só pode ser alcançado se tivermos controle total dos fatores ambientais físicos e bioquímicos. Devemos excluir os fatores indesejados ou descobrir ...

Discussão

A cultura celular convencional foi desenvolvida há quase um século e continua sendo o modelo pré-clínico mais freqüentemente utilizado na pesquisa biomédica, apesar de sua comprovada capacidade limitada de prever resultados clínicos no câncer¹⁷. Os modelos animais oferecem a maior relevância fisiológica e similaridade genética razoável para os seres humanos, mas há muito têm sido reconhecidos para ter limitações significativas na predição de resultados humanos^18...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL BD Luer-Lok tip syringes	BD	14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955	1x anti-anti
AZ 300 MIF	Merck KGaA	18441123163	Photoresist developer
AZ1518	Merck KGaA	AZ1518	Photoresist
AZ4330	Merck KGaA	AZ4330	Photoresist
Cr Chromium Etchant	Sigma-Aldrich	651826
Fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation	10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter	Heidelberg Instruments	DWL66+	Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	379212	For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins	New England Small Tube	NE-1300-01	.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame	ibidi	10929	On-stage incubator
Luer-Lok 23 G dispensing needle	McMaster-Carr	75165A684	To connect syringes and tubings
Lumox dish 35	Sarstedt	94.6077.331	Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165	Dow Electronic Materials	Microposit Remover 1165	Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing)	McMaster-Carr	9452K114	Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing)	McMaster-Carr	9452K74	Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System	Plasmatic Systems, Inc	Plasma-Preen	Oxygen plasma system
RPMI 1640	Life Technologies Corporation	11875-093
Samco RIE800iPB DRIE	Samco	RIE800iPB	Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner	SUSS MicroTec	MA6	Mask aligner
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Fisher Scientific	NC9285739	PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher	PVA TePla	M4L	Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)	Sigma-Aldrich	448931	For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD)	Cole-Parmer	EW-06419-01	Tubings for media delivery