הדור של מעברי מדרגות של סמים הטרוגנית ברחבי אוכלוסיות סרטן על מאיץ האבולוציה Microfluidic להתבוננות בזמן אמת

Summary

אנו מציגים מודל סרטן על שבב מיקרופלואידים, הטכנולוגיה "מאיץ האבולוציה", אשר מספק פלטפורמה לשליטה לטווח ארוך בזמן אמת מחקרים כמותיים של הדינמיקה של סרטן בתנאים סביבתיים המוגדרים היטב בתא יחיד רמת. טכנולוגיה זו צפויה לעבוד כמודל מבחנה עבור מחקר בסיסי או פיתוח תרופות טרום-קליני.

Abstract

תרבות התא קונבנציונאלי נשאר מודל טרום קליני בשימוש תכוף, למרות היכולת המוגבלת שלה מוכחת לחזות תוצאות קליניות בסרטן. סרטן מיקרופלואידיג-על שבב מודלים כבר הציעו לגשר על הפער בין תרבויות 2D קונבנציונאלי מסובכים יותר מודלים בעלי חיים מורכבים יותר, אשר יש יכולת מוגבלת לייצר תוצאות כמותיים אמין ומחורץ. כאן, אנו מציגים מודל מיקרופלואידיג סרטן על שבב שמתרבה רכיבים מרכזיים של מיקרוסביבה מורכבת הגידול באופן מקיף, עדיין הוא פשוט מספיק כדי לספק תיאורים כמותיים חזקים של הדינמיקה של סרטן. זה סרטן מיקרופלואידיג מודל על שבב, "המאיץ האבולוציה," מפרק את האוכלוסייה הגדולה של תאים סרטניים לתוך מערך מחובר של מיקרוסביבות הגידול תוך יצירת מתחים הטרוגנית כימותרפיה. ההתקדמות ואת הדינמיקה האבולוציונית של סרטן בתגובה מעבר הצבע התרופה יכול להיות מנוטר במשך שבועות בזמן אמת, וניסויים רבים במורד הזרם ניתן לבצע משלים את התמונות בזמן הקפיצה שנלקחו במהלך הניסויים.

Introduction

סרטן כבר הוכר יותר ויותר כמערכת אקולוגית מורכבת, כי תלוי לא רק על המשך בלתי מתמשך של אוכלוסיות תאים מוטציה אלא גם על אינטראקציות חיוניות בין תאים סרטניים לבין מיקרואקולוגיה המארחת. במובן זה, הסרטן מתפתח על נוף אדפטיבית המתבטא על ידי שילוב של גורמים, כולל מיקרוסביבה גידול הטרוגנית והוצלב עם מגוון של תאים מארחים, כולם לתרום לחצים סלקטיבית עבור גנטי נוסף או . שינויים אפיגנטיים^1,2,3 בהקשר של גידולים מוצקים, התפלגות אחידה של chemotherapeutics ומעברי צבע אחרים התורמים לטרוגניות המולקולריים שלהם ועשויים לשחק תפקיד בפיתוח התנגדות לסמים, הגדילה אנגיוגנזה לגידול מסוים אוכלוסיות משנה, ואפילו גרורות^4,5,6. קונבנציונאלי בלימודי תרבות תא 2D, תוך שליטה בקנה מידה גדול, היכולת ניסיוני נוח, מספק שדה ממוצע, אחיד, וקבוע התנאים, לעתים קרובות חסר בקרת הסביבה המרחבית מדויק הזמני הדרושים באמת לחקות הדינמיקה הגידול vivo. כך, יש צורך יותר מודלים לשעבר vivo ex לשכפל את מיקרוסביבה הגידול לפני מודלים בעלי חיים בצינור פיתוח התרופה כדי חיזוי טוב יותר של התקדמות הסרטן, כמו גם תגובות סמים בתוך מתח דינמיות נופים. מיקרופלואידיקה הוצעו לגשר על הפער בין לימודי תרבות תא 2d ומורכבות יותר במחקרים בעלי חיים vivo שייתכן שלא יוכלו לתמוך במחקרים כמותיים שניתן לשליטה^7,8,9.

אידיאלי במערכת מבחנה כדי לאפיין את הדינמיקה תאים סרטניים צריך להחזיק את היכולת ליצור מיקרוסביבה הטרוגנית כדי לחקות את התגובות הסלולר אדפטיבית שעשוי להתרחש בגידול, כמו גם לאפשר התבוננות של הדינמיקה הזאת ב רזולוציה של תא בודד. במאמר זה, אנו מתארים פלטפורמת מיקרופלואידיג תא התרבות, מכשיר מבוסס PDMS שנקרא "מאיץ האבולוציה" (EA), המאפשר מקבילים במחקרים מחוץ לגופית של דינמיקה תא סרטן ברזולוציה התאית עם רכישת נתונים בזמן אמת על משך שבועות, בעוד שמירה על מעברי מדרגות של מתח ברחבי הנוף התרבותי. העיצוב של פלטפורמה זו מתבסס על עבודתנו הקודמת, שבה ניתן להאיץ את הדינמיקה ההתפתחותית של אורגניזמים במטא-מטאפיסיה^10,11. באופן ספציפי, בקבוצה של אוכלוסיות מופרדות הדדית האינטראקציה ברמה מסוימת, כאשר נחשפים לנוף הטרוגנית הלחץ, המינים המתאימים ביותר יכול להשתלט על האוכלוסייה המקומית מהר יותר לעומת זאת של אוכלוסיה גדולה אחידה. לאחר מכן, המינים הכדניים עוברים לבתי גידול שכנים בחיפוש אחר משאבים ומרחב, ובסופו של דבר שולטים באוכלוסיה כולה. כפי שמוצג באיור 1, התבנית של שבב EA microflu, מורכב (i) זוג של ערוצי הסרפנטיין המספקים מחזור מדיה טרי ולבנות תנאי גבול קבוע לדיפוזיה כימית, ו (ii) האזור תרבות התא משושה אשר מורכב 109 משושה המחוברים ו 24 חדרי חצי משושה במרכז, דמוי המבנה חלת דבש. השבב הוא 100 יקרומטר לעומק. ערוצי מדיה ואזור תרבות התא מקושרים עם חריצים קטנים (כ-15 יקרומטר רחב), אשר מונעים זרימת מדיה ישירה ומתח ההטיה כתוצאה מעבר לאזור התרבות של התא, ועדיין מאפשרים לכימיקלים לפזר באמצעות חריצים קטנים וחומרים מזינים של החליפין, פסולת מטבולית, וכו '. הדור של מעברי צבע כימיים מוצג באיור 1B, שבו ערוץ מדיה אחד מכיל 0.1 מ"מ של fluorescein בעוד הערוץ השני הוא חינם של fluorescein. תאים הם מתורבתים על ממברנה חדיר גז, כאשר כחלחל על ידי המיקרו מבנים דרך לחץ האחורי חיובי על הקרום נגד השבב. מרכיבי בעל ההתקן מומחשים באיור 2, והכיוונון הנסיוני מומחש באיור 3, כאשר התרבות נשמרת על מיקרוסקופ הפוך ב-37 ° c, עם מעל 85% לחות יחסית, וממוזג תחת הרכב גז נורמוסקסיה.

מערכת זו מספקת תצפית מפורטת של אינטראקציות הסלולר המותאמות לשפות אחרות באמצעות שדות פלורסנט ומאפשר העברה של הזרם החוצה, כגון immunofluorescence, אבן חשופה מערבית או ספקטרומטר מסה. הדגמנו בעבר כהוכחה של העיקרון של סרטן זה microflu, מודל על שבב של המודל על שיתוף לטווח ארוך של האפיתל ואת mesenchymal PC3 סרטן הערמונית תאים¹² , כמו גם הופעתה של ענק סמים התנגדות פוליפואיד ענקית תאים סרטניים באמצעות האפיתל PC3 תא קו¹³. בעוד אנו מציגים את היישום של הפלטפורמה הזאת כדי להבין את הדינמיקה הטמפורלית של האפיתל PC3 ו mesenchymal סרטן הערמונית תאים תחת הדרגתי לחץ של doceel, מערכת microfluidic ניתן להחיל בקלות על כל שילוב של קווי התא ומשאבים (כלומר, תרופות, מזינים, חמצן) מעברי צבע.

Protocol

1. ייצור מכשיר מיקרופלואידיג

1. צור את דפוס המיקרופלואידיג הרצוי באמצעות תוכנת עיצוב פריסה (ראה חומרים משלימים).
2. . הרכיבו את הפושאול לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
   1. ניצול כותב לייזר, לכתוב את התבנית על צלחת סודה ליים מצופה עם 100 ננומטר של Cr ו 500 nm של photoresist AZ1518.
   2. לפתח את photoresist עם מפתח AZ300MIF עבור 60 s.
   3. לחרוט את כרום ללא הגנה מphotoresist באמצעות מזמור כרום Cr-7.
   4. להסיר את photoresist שיורית באמצעות חשפנית photoresist ב 70 ° c עבור 45 דקות.
3. . Photoresist את התבנית לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
   1. ספין מעיל HMDS על סיליקון וופל ב 4000 סל ד עבור 40 s.
   2. ספין מעיל photoresist AZ4330 על סיליקון וופל ב 4000 סל ד עבור 40 s.
   3. לאפות רך סיליקון וופל ב 95 ° c עבור 60 s.
   4. לנצל את המסכה לתנינים כדי לחשוף UV לפרוסת סיליקון.
   5. לפתח את photoresist עם מפתח AZ300MIF עבור 4 דקות.
4. בצע חריטה DRIE. לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
   1. יבש-לסדר את הפרוסת וופל עם הphotoresist באמצעות מערכת סיליקון עמוק מאוד מגיב (DRIE) לעומק 100 יקרומטר.
   2. להסיר את הphotoresist עם אצטון ואיכול פלזמה עם etcher פלזמה.
5. . חמצון וופל וסילניזציה לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
   1. לבצע חמצון תרמי על וופל סיליקון חרוט בכבשן ב 1100 ° c עבור 1 h.
   2. לחכות הסיליקון וופל להתקרר, ולאחר מכן למקם את הפרוסת לתוך desiccator עם כמה טיפות של trichloro-1H, 1H, 2H, 2H-ההופעה-silane (PFOTS) מטפטפים במיכל קטן ליד וופל.
   3. משאבת הלחץ של desiccator ל0.5 כספומט בטמפרטורת החדר עבור 60 דקות. עובש סיליקון וופל צריך להיות הידרופובי לאחר silanization הנכון, אשר ניתן נבדק על ידי הוספת מספר טיפות של מים על וופל.
6. . ליתוגרפיה רכה לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
   1. מערבבים טרום פולימר ו-cross-מקשר (מ polyמתיל siloxane) ב 10:1 על ידי יחס משקל.
   2. יוצקים את ה-PDMS המעורב ליצירת סרט בגובה של 10 מ"מ על העובש הsilanized סיליקון.
   3. דגה את מערכת הסיליקון המתקבלת PDMS בdesiccator במשך 30 דקות עד 1 h.
   4. מודלת את ה-PDMS-סיליקון וופל בחממה ב70 ° c כדי לרפא את ה-PDMS.
   5. לאחר PDMS הוא נרפא, לקלף את הסרט PDMS את וופל סיליקון בזהירות.
   6. באמצעות מחטים ביופסיה, אגרוף דרך-חורים ביציאות כהים מבוסס על מיקום התבנית על PDMS ולהעסיק אגרוף עגול כדי לחתוך צ'יפס 27 מ"מ קוטר.
7. התחברות שכבה PDMS.
   1. מחממים שתי ערימות של 27 צילינדרים מסוג PDMS (ללא היטרונינג), שיהפכו לשכבת האגירה ולשכבת הסגירה של המכשיר.
   2. גזור שני עיגולים 7 מ"מ סביב אינלטס על שכבת המאגר, ולנצל מחט ביופסיה כדי אגרוף דרך-חורים ביציאות מפרץ על שכבת הסגירה.
   3. בונד שלוש ערימות של PDMS (מחסנית בדוגמת, שכבת אגירה, שכבת הסגירה) עם טיפול פלזמה חמצן.
   4. עם מחט הביופסיה, להכות דרך חורים בשקעים ובנמל המרכזי של המכשיר.

2. הכנה למדיה ולקו התאים

1. הכן מדיה עבור קווי תא PC3 culturing, כולל PC3-חובש ו PC3-אפינפרין: לערבב RPMI 1640 בינוני עם סרום העובר 10% (FBS) ו-1x אנטיביוטי-antimycotic. צור קווי תא כמתואר בעבר¹⁴.
   הערה: קווי התא PC3 נשמרים באמצעי התקשורת שלעיל בעזרת מחולל חממות ב-37 ° c עם 5% CO₂. לפצל תאים תת-תרבות כל 3 ימים, לפני שהם מגיעים 100% השטף.
2. שורות תא transfect עם סמנים פלורסנט מתויג cytoplasmic עבור הדמיה טובה יותר, כפי שמתואר בעבר¹², כך PC3-פרמדיק מבטא CYTOPLASMIC gfp ו PC3-אפינפרין מביע Cytoplasmic mcherry. שים לב כי הטכנולוגיה תואמת גם עם כל התאים המסומנים פלורסנט, כמו גם הדמיה ברייטפילד של תאים ללא תווית.

3. התקנה ניסויית

1. ייצור מחזיק לוחית מתכת
   1. הרכיבו מחזיק לוחית המספיק להחזיק מנות תרבות בו חדירות בו לניסויים מקבילים על ידי עיבוד שבבי או 3D הדפסה. קובץ ה-3D CAD (צלחת 3-טוב. FCStd ") ניתן למצוא ב-GitHub כהפניה (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
   2. להתיר את המרכיבים של המחזיק (איור 2) עם מברג. לחטא את הרכיבים באמצעות חשיפה UV לפחות 1 h ולעזוב בסביבה סטרילית.
      הערה: המחזיק נועד לספק תנאים משמעותיים עבור שיווי משקל תרמי וקומפוזיציות גז אידיאלי, עם ערוץ הגז המאפשר זרימת אוויר. פרטים נוספים ניתן למצוא בעבודה הקודמת שלנו¹².
   3. היכונו עד שלוש מנות תרבות חדירות, אשר קרום התרבות התא הוא גמיש יחסית.
2. זריעת שורות תאים
   1. 24 שעות לפני תחילת הניסוי, הקציר PC3-אפינפרין ו-PC3-בתאי החירום על ידי טריסיזציה עבור 5 דקות. הוסף מדיה התרבות prewarmed, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 150 x g עבור 3 דקות ולהיפטר supernatant.
   2. לספור את התאים של כל PC3-אפינפרין ו-PC3-פרמדיק באמצעות הומוציטוטומטר ולבודד סך של 2.5 x 10⁴ של כל סוג תא עבור כל צלחת תרבות חדיר.
   3. ערבבו והשהה את שני סוגי התאים ב -2 מ ל של מדיית תרבות וזרע את התאים לתוך כל אחד מכלי התרבות הניתן לחדירות הגז.
   4. השאירו את מחזיק הצלחת כולו בחממה למשך הלילה כדי לצרף תאים.
   5. חטא את התקני PDMS באמצעות חשיפה UV לפחות 1 h ולעזוב בסביבה סטרילית.
3. הקמת יחידת בקרה תרמית ומערכת אספקת גז
   1. כפי שמוצג באיור 3, להגדיר מערכת אספקת גז המורכבת הן CO₂ ו O₂ יחידות בקרה, משאבת גז, תא ערבוב גז, מכשיר אדים או בובלר, ושלושה סטים נפרדים של שסתומי גז ומאבחנים לחץ. פרטים נוספים ניתן למצוא בעבודה הקודמת שלנו¹².
   2. להגדיר את שיתוף₂ ו O₂ יחידות הבקרה כגון שהם מתאימים את קצב ערבוב של הגז מ CO₂ ו-N₂ טנקים מקור O₂ . לחילופין, כל מערכת אספקת גז המספקת גז תחת מצב normoxia יעבוד.
   3. ודא שהגז המשולב בחדר הערבוב ומחולל לחות על-ידי בובלר, כך שהלחות היחסית גדלה עד 85% (לקריאה מתוך צג לחות יחסית) וכי הגז מוביל לשלושה שסתומי גז עצמאיים עם ממדי לחץ כדי ל שליטה וניטור שיעור זרימת גז במחזיק הצלחת.
   4. מניחים את מחזיק לוחית כולה ביחידת הבקרה התרמית של הדגירה בשלב עם יחידות משנה חימום נפרד עבור המכסה ואת הצלחת התחתונה, עם כל היחידות להגדיר ב 37 ° c. לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
4. התקנת מכשיר מיקרופלואידיג. לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
   1. לזהות את המרכיבים המפורטים של בעל 3-הצלחות היטב בסדר, כמו באיור 2. כל אחת משלוש הבארות זהות ועצמאית, עם זוג ערוצי גז לכל באר. בכל באר יש מחזיק גז חדיר החברה בעל יכולת, מחזיק שבב PDMS, מחזיק חלון זכוכית, וזוג של 35 מילימטר חלונות זכוכית. ניתן להרכיב רכיבים אלה באמצעות הברגים המצוידים.
      הערה: חלונות זכוכית להבטיח כי יש מרחב תרמי מבודד בין קרום התרבות חדיר מסוגל היטב כגון כי עיבוי מים לא מתרחשת עקב הבדלי טמפרטורה בממשק. שימו לב כי 3 בארות הם עצמאיים, ו 3 ניסויים ניתן לעשות בנפרד.
   2. מדיום התרבות לפני החום ב 37 ° c ו דגה בחדר ריק עבור 20 דקות.
   3. התייחס לאסימונים PDMS באמצעות מערכת פלזמה חמצן עבור 30 s כדי לשמור על hydrophilicity.
   4. . הגדר את מערכת המזרק טען שני מזרקים באיטיות עם מדיית צמיחה ושני מזרקים אחרים בעלי התעניינות מלאה (מדיה, מדיה עם סמים וכו '). לחבר כל מזרק בודד לצינורות 50 ס מ (0.020 "x 0.060" OD) על ידי מחט בגובה 23 גר' לתוך סיכת פלדה חלולה אחת. הכנס סיכת פלדה חלול לקצה השני של אבובים.
   5. הראשי אבובים ולהכניס את סיכת הפלדה לכל שבב PDMS דרך שכבת הסגירה. מלאו את שכבת האגירה והרטבת את תבנית שכבת הדפוס של PDMS עם מדיה. שכבת המאגר פועלת כמלכודת בועה על שבב כדי למנוע בועות אוויר מלקבל לתוך דפוס microfluidic.
   6. . העמיסו מזרק מ-mL עם מדיית תרבות לחבר את המזרק לצינורות 5 ס מ (0.020 "x 0.060" OD) באמצעות מחט של 23 גר' לתוך סיכת פלדה חלולה אחת. הכנס סיכת פלדה חלול לקצה השני של אבובים הממשלה אבובים.
   7. הכנס את סיכת הפלדה חלול לתוך החור במרכז של השבב, שם מדיה מוגזמת ניתן לחלץ מן השבב מאוחר יותר במהלך תהליך איטום השבב.
   8. כמו כל התקן PDMS דורש מזרקים 4 10 mL טעון על משאבת מזרק, טען 2 10 mL מזרקים לכל שבב בסיפון הקדמי. הניחו את שני המוזרקים האחרים בסיפון הנסיגה של מערכת המזרק.
   9. מניחים שבב ישירות על גבי קרום התרבות חדירות גז (עם תאים כבר דבקה הקרומים). על מנת למנוע בועות מיקרו הראפ בתבנית microflu, לחלק 1 מ ל של מדיה מראש ומגנטיות לתוך המנה התרבותית של 35 מ"מ גז חדיר לפני ההרכבה, ולאחר מכן לוודא כי השבב מתקרב למשטח הנוזלי עם זווית להטות 15 מעלות.
   10. מהדק את צלחת התרבות חדיר הדלק ואת הבאר של מחזיק את הכלים התרבות חדיר החקלאות עבור כל שבב, עם המחזיק שבב PDMS דוחף את המכשיר PDMS כלפי מטה.
   11. קלטת גיליון של החותם על גבי התקן PDMS ומלחציים עם מחזיק שבב PDMS כדי למנוע את השבב מייבוש.
   12. הגדר קצב זרימת מדיה מסביב למערך כדי להיות 20 μL/h.
   13. הגדר את כל הצלחת בחממה על הבמה בשלב המונע של מיקרוסקופ הפוך. לחבר את מערכת אספקת הגז לתעלות הגז והלחץ על קרום התרבות חדיר מסוגל גז נגד שבב PDMS מותקן כדי להבטיח איטום של המכשיר. לשמור על לחץ מד ב 0.2 psi (1.4 x 10⁴ פא).
   14. באיטיות לחלץ מדיה מוגזמת בשבב באמצעות מזרק 1-mL מהחור במרכז. שימו לב לשבב מתחת למיקרוסקופ תוך חילוץ מדיה ולאחר מכן להפסיק חילוץ כאשר השבב אטום. איטום שבב צריך להיות ברור מאז חלק של התאים יהיה נמחץ על ידי מיקרו מבנים.
   15. חברו את יחידת חישת הטמפרטורה של החממה על הבמה לצלחת 3-היטב וה37 ° c.

4. תא יחיד לפקיעה הדמיה

1. להגדיר תוכנת דימות ניצול מיקרוסקופ הפוך לרכישת תמונה בזמן הקפיצה. שים לב כי מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה עם ממונע מלא x-y שלב, כפתור המיקוד, תריס, וקוביות מסנן נדרש עבור ניסוי EA.
2. קביעת תצורה של תוכנה לרכישת תמונות על פני שני ערוצים בהגדלה 10x עבור כל שבב עם תמונה אוטומטית-תפרים לאחר סיבוב אחד של פוקוס אוטומטי. שים לב כי מערכות תיקון אוטומטי כמו פוקוס מושלם לא להבטיח איכות תמונה מספקת. מומלץ יותר ליצור משטח מיקוד מותאם אישית עבור רכישת תמונה ארוכת טווח מבוסס על פוקוס אוטומטי או פוקוס ידני על פני השבב.
3. לקחת תמונות כל שעה ולהשאיר ניסוי פועל בסרגל הזמן של שבועות. הצג איכות תמונה על בסיס יומי ועדכן את משטח המיקוד במידת הצורך.
4. הכינו את שבב ה-PDMS ומיכל התרבות החדיר לטיפול בגז לניתוח האימונולומידורף שלאחר מכן, כמתואר בעבר¹³.

5. עיבוד תמונה וניתוח

1. עיבוד לאחר ניסיוני
   1. המרת תמונות לפורמט TIFF לעיבוד תמונה ומדידות באמצעות פיג'י/ImageJ.
   2. דחיסת קבצי TIFF כדי להקל על עיבוד תמונה נוסף.
2. ניתוח פיג'י/דפוס
   1. כדי לזהות תאים, בצע ' חיסור רקע ' ו'ניתוח חלקיקים ' כדי לזהות כתמים בהירים של פלורסנט לאיתור מיקום התא וספירת תאים אוטומטיים.
   2. להשתמש בתוספים (מעקב ידני, כימוטקסיס, כלי הגירה, Trackmate) כדי לנתח את התנועתיות תאים והגירה.

תוצאות

אימות של צמיחת תאים אופטימליים בשבב
המטרה העיקרית של פלטפורמת הניסוי היא לשכפל רכיבים מרכזיים ואינטראקציות בסביבה מורכבת של גידולים מורכבים באופן מקיף, אך פשוט מספיק כדי לספק נתונים כמותיים, אמינים ומתכלים. מטרה זו יכולה להיות מושגת רק אם יש לנו שליטה מלאה על ...

Discussion

תרבות התא קונבנציונאלי פותחה כמעט לפני מאה שנה והוא נשאר המודל הנפוץ ביותר טרום קלינית במחקר ביו, למרות היכולת המוגבלת שלה מוכחת לחזות תוצאות קליניות סרטן¹⁷. דגמי בעלי חיים מציעים את הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר והדמיון הגנטי הסביר לבני האדם, אך זמן רב הכירו במגבלות מש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL BD Luer-Lok tip syringes	BD	14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955	1x anti-anti
AZ 300 MIF	Merck KGaA	18441123163	Photoresist developer
AZ1518	Merck KGaA	AZ1518	Photoresist
AZ4330	Merck KGaA	AZ4330	Photoresist
Cr Chromium Etchant	Sigma-Aldrich	651826
Fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies Corporation	10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter	Heidelberg Instruments	DWL66+	Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich	379212	For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins	New England Small Tube	NE-1300-01	.025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame	ibidi	10929	On-stage incubator
Luer-Lok 23 G dispensing needle	McMaster-Carr	75165A684	To connect syringes and tubings
Lumox dish 35	Sarstedt	94.6077.331	Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165	Dow Electronic Materials	Microposit Remover 1165	Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer	Bio-Rad Laboratories	MSB1001	Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing)	McMaster-Carr	9452K114	Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing)	McMaster-Carr	9452K74	Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System	Plasmatic Systems, Inc	Plasma-Preen	Oxygen plasma system
RPMI 1640	Life Technologies Corporation	11875-093
Samco RIE800iPB DRIE	Samco	RIE800iPB	Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner	SUSS MicroTec	MA6	Mask aligner
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Fisher Scientific	NC9285739	PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher	PVA TePla	M4L	Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)	Sigma-Aldrich	448931	For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD)	Cole-Parmer	EW-06419-01	Tubings for media delivery