美味的西式自助餐厅饮食作为模拟啮齿动物饮食诱发肥胖症的可靠方法

摘要

该协议描述了使用高度可口的西式自助餐厅饮食来模拟啮齿动物的暴食和肥胖。在这里，我们提供了食物选择、制备和测量的详细提纲，并解释了有助于产生强健和可重复表型的方法因素。

摘要

肥胖在发达国家和发展中国家的发病率正在迅速增加，已知会导致或加剧许多疾病。肥胖的健康负担及其合并条件突出表明，需要更好地了解其发病机制，但伦理限制限制了人类的研究。为此，实验室动物肥胖的外部有效模型对于理解超重和肥胖至关重要。虽然许多物种已经被用来模拟伴随人类肥胖的变化范围，但啮齿动物是最常用的。我们的实验室已经开发出一种西式自助餐厅饮食，持续导致大量体重增加和啮齿动物代谢疾病的标志。这种饮食使啮齿动物接触各种高可口的食物，从而诱发吞咽过度，从而模拟了现代西方饮食环境。这种饮食迅速诱导体重增加和身体脂肪积累大鼠允许研究过量饮食和肥胖的影响。虽然自助餐厅饮食可能无法提供与纯化高脂肪或高脂肪、高糖饮食相同的宏量营养素和微量营养素特征控制，但自助餐厅饮食通常诱发比纯化饮食更严重的代谢表型饮食，更符合在超重和肥胖人群中观察到的代谢紊乱。

引言

肥胖及其相关合并症对全球健康负担作出巨大^贡献，占澳大利亚疾病负担的7%2。肥胖的一个主要危险因素是食用饱和脂肪和精制碳水化合物含量高、纤维和微量营养素含量低的不健康^饮食3。确定肥胖治疗干预的目标需要能够系统地评估对多个生化和生理系统的影响的模型。通过使用啮齿动物模型，我们对肥胖病因的理解有了实质性的提高，在环境因素易于控制的条件下，可以随时间进行行为、代谢和分子效应的研究操纵。

自助餐厅饮食 （CAF） 模式的饮食诱发肥胖包括补充啮齿动物的标准小食与各种可口的食物，要么高饱和脂肪，精制碳水化合物，或两者兼而有之。这些食物的例子包括蛋糕、甜饼干和高脂肪的咸味小吃（如加工肉类、奶酪和薯条）。它可靠地促进啮齿动物的吞咽过度和快速体重增加。该模型的主要特征是提供各种高度可口的食物，旨在模拟现代食品环境。获得多样性会增加大鼠在^短期4和^{人类5的食物摄入量，}即使食物匹配的可食用性，并只在风味和嗅觉^线索4，6变化。然而，一项研究表明，提供能量和宏量营养素匹配的纯化饮食，味道和质地各不相同，对大鼠的长期体重增加没有^影响7，这表明营养成分和明显的口腔后效应不同的食物也可能导致暴食。暴露于多种口味和质地克服感官特定的饱质感，这描述了与^替代5相比，吃最近吃的食物的欲望减少。在我们的实验室里，我们同样观察到，使用高可口的食物会进一步放大暴食。

这种CAF饮食已经使用了40多年，因为Sclafani⁸报告说，雌性大鼠暴露于各种"超市食品"（棉花糖，巧克力，花生酱，饼干，香肠和奶酪）表现出加速体重增加相对于控件。这和其他早期研究指出，CAF式饮食似乎比纯高脂肪或高^{碳水化合物饮食8、9}更有效地加速体重增加。20世纪80年代的工作的特点是宏量营养素^谱10和膳食^模式11的老鼠喂养CAF饮食，并表现出深刻的变化脂肪质量和胰岛素^水平9，10和热^发生12。我们小组已经使用CAF饮食模型肥胖超过20^{年13，14，}在此期间，我们使用了几种变种的饮食。除了常规的菜水外，老鼠每天至少吃两个甜食和两个咸味的食物。近年来，我们已经开始补充固体CAF食品与10%蔗糖溶液。根据不同的实验设计定制CAF饮食的能力是模型的强项。

CAF 饮食促进立即吞咽症（即，在前 24 小时内）和体重和脂肪质量的稳步增加。然而，最大化多样性的一个后果是宏量营养素和微量营养素的摄入不受控制，有些人认为这是一个不可逾越^的缺陷。饮食诱发肥胖症的研究更普遍地使用纯化高脂肪 （HF） 或组合高脂肪、高糖 （HFHS） 饮食，这些饮食对营养成分的精确控制，且比 CAF 模型的劳动密集型程度低，后者需要日常监控和仔细规划和执行时间表。商业上可用的纯化HF饮食的转化相关性是一个持续争论的话题，因为他们的脂肪酸分布和脂肪和蔗糖的比例可能与人类膳食^摄入量16不一致。虽然CAF饮食对营养成分的控制程度不如纯化饮食，但它旨在模拟大多数现代社会中食物选择的可食用性和多样性。

研究方案

此处描述的协议已针对大鼠使用进行了优化。虽然我们已经成功地在^{小鼠17、18}中使用CAF饮食，软性食物研磨可能会进一步产生降低食物摄入量^可靠性19的错误。本议定书由新南威尔士大学动物护理和伦理委员会批准，并符合澳大利亚国家卫生和医学研究委员会。

注:在我们的短期研究中，很少观察到不利影响（即<10周，即CAF）;在CAF^饮食20的老鼠中，没有改变一般福祉，活动，社交或焦虑行为的证据。在较长的间隔（>16周）后，在CAF喂养的大鼠中观察到非常偶然的心血管事件。

1. 动物适应和住房

1. 让大鼠在抵达后5-7天到该设施，并免费获得控制饮食和水。每天从抵达后24小时开始处理大鼠;CAF饮食涉及与笼子的日常互动，因此定期处理很重要。
2. 确保向所有保持架提供环境富集。标准笼子包含红色聚甲基丙烯酸酯盒、筑巢材料和木制咀嚼棒，这很重要，因为 CAF 饮食中提供的软食物可能导致大鼠出现不良闭塞，而无法获得更难咀嚼的物品。
3. 在开始 CAF 饮食之前，将笼子分配给 CAF 或 chow 组，并通过比较各组之间的体重平均值和范围，并在必要时重新分配，确保这些笼子与起始体重相匹配。由于照明暴露会影响昼夜节律、食物摄入量和活动，因此可确保 CAF 和 chow 笼均匀地分布在菌群室中。
   注:当群体居住时，啮齿动物（尤其是男性）形成社会等级。社会压力的影响通过确保老鼠与其他体重相似的老鼠一起被安置在一起（以减少笼子里的欺凌）来部分控制。此外，自助餐厅的饮食应该均匀地分布在笼子周围，以便所有老鼠都能获得饮食。

2. 饮食选择和设置

1. 调度
   1. 确保经常供应的菜水，每天至少加两件甜食和两件咸味食品（每周时间表的一个示例，如表1所示;图1所示的3天食物选择）。可选的外法是高脂肪、高糖和10%蔗糖溶液。
   2. 选择每个类别中宏量营养素比例相似的食物:所有甜食的碳水化合物都比脂肪高，所有咸味食品的脂肪含量都高于碳水化合物。旨在在每一组CAF食物中提供类似比例的脂肪、碳水化合物、糖和蛋白质。
   3. 在整个实验中定期监测消费，以便在必要时定制菜单以维持吞咽过度。表2提供了几种示例食物的能量密度和宏量营养素信息，并建议200克雄性斯普拉格道利大鼠的起始量。
   4. 避免连续几天或一周太频繁地喂食任何单一食物，因为这可能会减少食物的摄入量。如果发生这种情况，在重新合并之前，从日程中省略食物几天。
      注:大鼠可能表现出新恐惧症，大多数新食物需要反复接触，以确定它们是否会被食用。老鼠通常不喜欢含有酵母（面包、比萨饼等）或有柑橘或咖啡口味的食物。
2. 湿食品
   1. 考虑在金枪鱼罐头等容器中提供含水量较高的食物，以避免弄脏床上用品。如果这样做，还应提供空容器来控制保持架。
3. 饮食采购
   1. 确保 CAF 食品是主食或获得足够的整个实验，使食品保持一致，无需被替换。
4. 饮食储存
   1. 如包装上所示或以-20°C储存食品，并在使用前一天晚上解冻。将干货（饼干）存放在密封的容器中。
5. 蔗糖溶液（可选）
   1. 制备蔗糖溶液，通常散装10%（w/v），不使用时储存在4°C。
   2. 每周更换蔗糖瓶（至少），以防止细菌或真菌生长。每天检查瓶子，如果发现生长迹象，则更换。
      注:蔗糖除了水外，还提供水，水始终可用。

3. 咖啡厅饮食准备

1. 除 霜
   1. 在使用前，拿出适量的CAF食物解冻+24小时。食物可以使用微波炉解冻，但不应在热时提供。
2. 每日补充CAF饮食
   1. 每天更换 CAF 减肥食品可确保品种最大化，并将笼子脏污降至最低。由于大鼠在黑暗周期的最初部分吃他们每天摄入的大部分食物，因此，在黑暗期开始时，安排CAF食物补充，以便此时的食物是新鲜的。在未测量食物摄入量的某一天补充 CAF 饮食。
   2. 以确保此组具有类似日常体验的方式馈送 chow 组，如下所示。
      1. 转动水瓶（向上喷口），将笼子放在工作空间上并取下盖子。
      2. 轻轻打扰床上用品约20s，以模拟从CAF笼子的床上用品收集食物的过程。
      3. 将一小撮食物料斗的颗粒放入床上用品中，以将接触与笼子床上用品的食物等同起来。
      4. 返回保持架盖并返回机架，仅在保持架固定时更换水瓶，以尽量减少溢出。
   3. 为自助餐厅群提供食物
      1. 将 CAF 饮食物品准备到每个笼子的标记容器中。
      2. 转动水瓶（向上喷口），将笼子放在工作空间上并取下盖子。
      3. 尽可能从床上用品中取出旧的自助餐厅饮食。
      4. 将新鲜的自助餐厅饮食放入笼子。
      5. 关闭保持架并返回到机架。
      6. 更换水和蔗糖瓶。
         注:为了避免将小食鼠暴露在CAF饮食中，请考虑在CAF笼子前喂食小笼子，反之亦然。手套应该改变处理不同饮食组的老鼠。
3. 根据需要，将奶瓶、水和蔗糖瓶充值。在其他程序后执行此操作更有效，因为包装盒在加满食物和水后更重。
   注:CAF 盒土壤更快，需要更频繁地更换，以避免因接触湿床上用品和强烈气味而引起的压力。每天检查床上用品，并根据需要更换。

4. 食物摄入量超过24小时

注:食物摄入量测量每周进行几次离散的 24 小时。

1. 开始CAF饮食时，每周至少测量两次体重和24小时食物摄入量，以监测饮食的有效性。在黑暗阶段开始附近开始食物摄入量测量。旨在在食物摄入量测量日提供相同的 CAF 食品，因为与风味和能量密度等同将允许精确监测随时间的变化。
   注:对于需要每周测量食物摄入量>2的研究来说，这是不可能的，因为过度接触同一食物可能会随着时间的推移减少吞咽过度。
2. CAF 和控制饮食摄入措施
   1. 准备 CAF 饮食，并放入每个笼子的标记容器中，称重和记录每个组件。图 1显示了一组完整的 CAF 食品。表 3包含一个示例食物摄入量监测表。
   2. 根据需要重新加注水、蔗糖和菜液。
3. 对于小（控制）保持架
   1. 转动水瓶（向上喷口），将笼子放在工作空间上并取下盖子。
   2. 称量大鼠，然后将它们转移到笼子里，用新鲜的床上用品，以及环境富集。
   3. 记录水瓶和奶瓶的重量。
   4. 更换笼盖，将笼子重新装回机架，然后转动水瓶。在笼子里可以添加"FOOD INTAKE"的小标志，通知服务员和研究人员不要触摸瓶子和奶瓶。
4. 对于 CAF 保持架:
   1. 执行与步骤 4.3 中相同的步骤。此外，在大鼠转移之前，用新鲜的床上用品将CAF食品的预称重容器撒在笼子里。
   2. 让大鼠在24小时的时间里，以最小的干扰。记录任何意外的中断（例如，新老鼠到达殖民地房间，或环境噪音变化）。
5. 完成食物摄入量测量
   1. 记录水瓶的重量和菜笼的菜，仔细寻找床上用品的菜块。完成后，从笼子中取出"食物摄入量"标志。
   2. 为 CAF 笼子准备新鲜的 CAF 饮食。
   3. 对于每个 CAF 保持架
      1. 记录水、乔和蔗糖的重量。
      2. 取下保持架盖，并丰富环境。
      3. 小心地从床上用品中取出 CAF 碎片，并放入单独的容器中。首先取出最大的部分，然后系统地使用温和的扫掠动作将所有笼子床上用品从一端扫到另一端。
         注:收集食物时，对每个笼子都采取同等程度的护理。记录笼子特别凌乱的地方——在某些情况下，老鼠会把蛋糕和/或饼干磨成难以收集的细粉。这可以人为地膨胀食物摄入量的措施。
      4. 在笼子周围分发新的 CAF 饮食，返回环境富集，关闭笼子盖并将其返回到机架，删除"食物摄入"标志。
      5. 将每只CAF食物的重量记录到最接近0.1克。从初始食物重量中减去剩余的食物，获得每个笼子的总消费量，然后除以每个盒子里的老鼠数量（假设摄入量相等）。
      6. 将消耗量（克/鼠）乘以制造商提供的每种食品的能量密度（kJ/g）。
         注:为了计算宏量营养素的摄入量，我们使用假设碳水化合物和蛋白质的能量密度为16.7 kJ/g，脂肪的能量密度为37 kJ/g。

结果

如图2A所示，根据三组雄性斯普拉格道利大鼠的数据，CAF饮食喂养比小食对照组的能量摄入增加了2.5倍，在6周内一致。其他研究已经证实，这种吞咽症的程度持续超过10²¹和16²²周的实验。体重曲线（图2B）表明CAF饮食喂养导致平均体重与3-4周饮食后对照组相比有20%的差异，与体重增加与人类?...

讨论

通过让大鼠接触各种高脂肪和高糖的可口食物，这里描述的CAF饮食协议为许多人食用的所谓"西方饮食"提供了一个可靠而可靠的模型。在接触的前 24 小时内观察到高吞咽症（评估为相对于对照组能量摄入的显著增长），在几周内可以看到具有统计学意义的体重差异。因此，CAF是啮齿动物饮食诱发肥胖的有效模型。

几项研究表明，CAF式饮食比纯化HF或HFHS饮食产生更夸张的肥胖?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-5 L plastic bottle			For preparing 10% sucrose solution, if applicable
Chopping board			Plastic is advised
Freezer			For storing CAF foods
Gordon's maintenance rodent chow	Gordon's Specialty Stockfeeds (Australia)		Maintenance diet used in our laboratory (14 kJ/g; 65% carb, 13% fat and 22% protein, as energy)
Large plastic storage boxes			All items above can be stored in containers for easy access
Large spoon			For CAF diet preparation
Microwave			For CAF diet thawing (when required)
Non-serrated knife			For CAF diet preparation
Paper towel			Important for cleaning work surfaces and the knife during CAF prep
Plastic containers			These are for weighing CAF food items on measurement days
Plastic funnel			For preparing 10% sucrose solution, if applicable
Red light			As CAF diet should be refreshed near the onset of the dark phase each day, a red light will assist when working in the dark
Tuna tins			For presenting 'wetter' CAF food items. Plastic containers may also be suitable
Weigh container x 3			Separate containers should be used to weigh rats, chow & bottles, and CAF foods
Weighing scale			Sensitivity to 0.1g is recommended
White sugar			For 10% sucrose solution, if applicable