Palatable Western-stile caffetteria dieta come un metodo affidabile per la modellazione dell'obesità indotta da dieta nei roditori

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso di una dieta caffetteria molto appetibile e in stile occidentale per modellare l'eccesso di cibo e l'obesità nei roditori. Qui, forniamo un contorno dettagliato della selezione, preparazione e misurazione degli alimenti e spieghiamo i fattori metodologici che aiutano a generare un fenotipo robusto e riproducibile.

Abstract

L'obesità è in rapido aumento nell'incidenza nei paesi sviluppati e in via di sviluppo ed è noto per indurre o esacerbare molte malattie. L'onere sanitario dell'obesità e le sue condizioni comorbide evidenziano la necessità di una migliore comprensione della sua patogenesi, ma i vincoli etici limitano gli studi nell'uomo. A tal fine i modelli di obesità valida esternamente negli animali da laboratorio sono essenziali per la comprensione del sovrappeso e dell'obesità. Mentre molte specie sono state utilizzate per modellare la gamma di cambiamenti che accompagnano l'obesità negli esseri umani, i roditori sono più comunemente utilizzati. Il nostro laboratorio ha sviluppato una dieta caffetteria in stile occidentale che porta costantemente a un notevole aumento di peso e marcatori della malattia metabolica nei roditori. La dieta espone i roditori a una varietà di alimenti altamente appetibili per indurre l'iperfagia, modellando l'ambiente alimentare occidentale moderno. Questa dieta induce rapidamente aumento di peso e l'accumulo di grasso corporeo nei ratti permettendo per lo studio degli effetti di eccesso di cibo e obesità. Mentre la dieta della mensa non può fornire lo stesso controllo sul profilo di macronutrienti e micronutrienti come diete purificate ad alto contenuto di grassi o ad alto contenuto di grassi, ad alto contenuto di zucchero, la dieta della mensa induce in genere un fenotipo metabolico più grave rispetto a quello osservato con purificati diete ed è più in linea con i disturbi metabolici osservati nella popolazione umana in sovrappeso e obesi.

Introduzione

L'obesità e le relative comorbilità contribuiscono enormemente al carico sanitario mondiale¹ e rappresentano il 7% del carico di malattie in Australia². Un fattore di rischio principale per l'obesità è il consumo di diete malsane ad alto contenuto di grassi saturi e carboidrati raffinati, e a basso contenuto di fibre e micronutrienti³. Identificare gli obiettivi per l'intervento terapeutico per l'obesità richiede modelli in grado di valutare sistematicamente gli effetti su più sistemi biochimici e fisiologici. La nostra comprensione dell'eziologia dell'obesità è stata notevolmente avanzata dal lavoro utilizzando modelli di roditori, dove gli effetti comportamentali, metabolici e molecolari possono essere studiati nel tempo in condizioni controllate in cui i fattori ambientali possono essere facilmente Manipolato.

Il modello di dieta caffetteria (CAF) di obesità indotta dalla dieta consiste nell'integrare la dieta di chow standard dei roditori con una varietà di alimenti appetibili che sono ad alto contenuto di grassi saturi, carboidrati raffinati, o entrambi. Esempi di questi alimenti includono torte, biscotti dolci e snack salati ad alto contenuto di grassi (come carni trasformate, formaggio e patatine). Promuove in modo affidabile l'iperfagia e rapido aumento di peso nei roditori. Le caratteristiche principali del modello sono la fornitura di una varietà di alimenti altamente appetibili, progettati per simulare l'ambiente alimentare moderno. L'accesso alla varietà aumenta l'assunzione di cibo nei ratti nel breve termine⁴ e negli esseri umani⁵ anche quando gli alimenti sono abbinati per appeguarsi e variano solo nel sapore e nei segnali olfattivi^4,6. Tuttavia, uno studio ha mostrato che fornire diete purificate abbinate a energia e macronutrienti che variavano nel sapore e nella consistenza non ha avuto alcun effetto sull'aumento di peso corporeo a lungo termine nei ratti⁷, suggerendo che la composizione dei nutrienti e distinti effetti post-orali diversi alimenti possono anche contribuire all'eccesso di cibo. L'esposizione a molteplici gusti e consistenze supera la sazietà sensoriale-specifica, che descrive la diminuzione del desiderio di mangiare un cibo mangiato di recente rispetto ad un'alternativa⁵. In molte coorti nel nostro laboratorio, abbiamo osservato allo stesso modo che l'uso di alimenti altamente appetibili amplifica ulteriormente l'eccesso di cibo.

Questa dieta CAF è stata utilizzata per oltre 40 anni, da quando Sclafani⁸ ha riferito che i ratti femminili esposti a un assortimento di "cibi al supermercato" (marshmallow, cioccolato, burro di arachidi, biscotti, salami e formaggio tra loro) hanno esibito un aumento di peso accelerato rispetto ai controlli. Questo e altri studi precoci hanno notato che le diete in stile CAF sembravano accelerare l'aumento di peso in modo più efficace rispetto alle diete pure ad alto contenuto di grassi o ad alto contenuto di carboidrati ^8,9. Il lavoro degli anni '80 ha caratterizzato i profili macronutrienti¹⁰ e i modelli di pasto¹¹ dei ratti alimentati diete CAF, e ha mostrato profondi cambiamenti ai livelli di massa grassa e insulina^9,10 e termogenesi¹². Il nostro gruppo ha utilizzato la dieta CAF per modellare l'obesità per oltre due decenni^13,14 e durante questo periodo abbiamo usato diverse varianti della dieta. I ratti sono presentati con almeno due prodotti alimentari dolci e due salati ogni giorno, oltre a cibo regolare e acqua. Negli ultimi anni abbiamo iniziato a integrare gli alimenti solidi CAF con soluzione di saccarosio al 10%. La capacità di adattare la dieta CAF a diversi progetti sperimentali è un punto di forza del modello.

Le diete CAF promuovono l'iperfagia immediata (cioè, entro i primi 24 h) e guadagni costanti nel peso corporeo e nella massa grassa. Tuttavia, una conseguenza della massimizzazione della varietà è che l'assunzione di macronutrienti e micronutrienti non è controllata, un punto di vista come un difetto insormontabile¹⁵. Gli studi sull'obesità indotta dalla dieta usano più comunemente diete ad alto contenuto di grassi purificati (HF) o combinate ad alto contenuto di grassi e zuccheri (HFHS), che offrono un controllo preciso sul contenuto nutrizionale e sono meno laboriose rispetto al modello CAF, che richiede un monitoraggio quotidiano e un'attenta pianificazione ed esecuzione del programma. La rilevanza traslazionale delle diete HF purificate disponibili in commercio è un argomento di dibattito in corso, poiché il loro profilo di acidi grassi e le proporzioni di grassi e saccarosio potrebbero non allinearsi con l'assunzione alimentare umana¹⁶. Mentre la dieta CAF non offre lo stesso grado di controllo sulla composizione dei nutrienti delle diete purificate, mira a modellare l'appetibilità e la varietà che caratterizza le opzioni alimentari nella maggior parte delle società moderne.

Protocollo

Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per l'uso nei ratti. Mentre abbiamo usato con successo la dieta CAF nei topi^17,18, la macinazione degli alimenti morbidi può introdurre un ulteriore errore riducendo l'affidabilità delle misure di assunzione di cibo¹⁹. Questo protocollo è approvato dal Comitato per la cura e l'etica degli animali dell'Università del Nuovo Galles del Sud e conforme alle linee guida australiane per l'uso e la cura degli animali a fini scientifici (8a edizione) fornite dall'Australian National Health e Consiglio della ricerca medica.

NOT: Pochissimi effetti negativi sono stati osservati nei nostri studi a breve termine (cioè <10 settimane ad accesso al libitum CAF); non ci sono prove di cambiamenti al benessere generale, attività, sociabilità o comportamento ansioso-come nei ratti sulla dieta CAF²⁰. Dopo intervalli più lunghi (>16 settimane) sono stati osservati incidenti cardiovascolari molto occasionali nei ratti alimentati da CAF.

1. Acclimatazione degli animali e alloggi

1. Acclima ratti alla struttura per 5-7 giorni dopo l'arrivo con accesso gratuito per controllare la dieta e l'acqua. Gestire i ratti ogni giorno a partire 24 h dopo l'arrivo; La dieta CAF comporta l'interazione quotidiana con la gabbia, quindi una manipolazione regolare è importante.
2. Garantire che l'arricchimento ambientale sia fornito a tutte le gabbie. Una gabbia standard contiene una scatola di methaccrili di polimetillato rosso, materiale da nido e un bastone da masticare in legno, che è importante perché gli alimenti morbidi forniti all'interno della dieta CAF possono provocare ratti che sviluppano malocclusione senza accesso a oggetti più duri da masticare.
3. Prima di iniziare la dieta CAF, assegnare le gabbie ai gruppi CAF o chow e assicurarsi che siano abbinati per il peso corporeo iniziale confrontando la media e la gamma di pesi corporei tra i gruppi e riassegnando se necessario. Poiché l'esposizione all'illuminazione può influenzare i ritmi circadiani, l'assunzione di cibo e l'attività, assicurarsi che le gabbie CAF e chow siano distribuite uniformemente nella stanza della colonia.
   NOT: I roditori formano gerarchie sociali quando sono ospitati in gruppo (soprattutto maschi). Gli effetti dello stress sociale sono parzialmente controllati assicurando che i ratti siano alloggiati con altri di un peso corporeo simile (per ridurre il bullismo all'interno di una gabbia). Inoltre, la dieta della caffetteria dovrebbe essere distribuita uniformemente intorno alla gabbia in modo che tutti i ratti abbiano accesso alla dieta.

2. Selezione dieta e configurazione

1. Pianificazione
   1. Assicurarsi che la carne regolare e l'acqua siano sempre disponibili e siano integrati con un minimo di due dolci e due salati al giorno (un esempio di programma settimanale è mostrato nella Tabella 1; opzioni alimentari per 3 giorni mostrate nella Figura 1). Gli extra opzionali sono prodotti ad alto contenuto di grassi, chow ad alto contenuto di zucchero e soluzione di saccarosio al 10%.
   2. Scegli gli alimenti all'interno di ogni categoria che sono simili in proporzioni macronutrienti: tutti gli articoli dolci sono relativamente più alti in carboidrati rispetto ai grassi e tutti gli elementi salati sono più alti nel grasso che nei carboidrati. Mira reperire proporzioni simili di grassi, carboidrati, zucchero e proteine in ogni insieme giornaliero di alimenti CAF.
   3. Monitorare regolarmente il consumo durante l'esperimento in modo che il menu possa essere adattato, se necessario, per sostenere l'iperfagia. La tabella 2 fornisce informazioni sulla densità di energia e sui macronutrienti per diversi alimenti di esempio e suggerisce quantità iniziali per 200 g di ratti Maschi Sprague Dawley.
   4. Evitare di nutrire qualsiasi singolo alimento in giorni consecutivi o troppo spesso in una settimana, in quanto ciò può diminuire l'assunzione di tale cibo. In questo caso, omettere il cibo dal programma per alcuni giorni prima di re-incorporare.
      NOT: I ratti possono mostrare neofobia e la maggior parte dei nuovi alimenti richiedono esposizioni ripetute per determinare se saranno consumati. I ratti in genere non preferiscono cibi contenenti lievito (pane, pizza, ecc.) o quelli con aromi di agrumi o caffè.
2. Cibi umidi
   1. Considerare la presentazione di alimenti più in alto nel contenuto di umidità in un contenitore come una latta di tonno, per evitare di sporcare la biancheria da letto. In tal caso, devono essere forniti contenitori vuoti anche per le gabbie di controllo.
3. Approvvigionamento di dieta
   1. Assicurarsi che gli alimenti CAF utilizzati siano punti fermi o ottengano abbastanza per l'intero esperimento in modo che gli alimenti rimangano coerenti e non debbano essere sostituiti.
4. Stoccaggio della dieta
   1. Conservare gli alimenti come indicato sulla confezione o a -20 gradi centigradi e scongelare la sera prima dell'uso. Conservare i prodotti secchi (biscotti) in un contenitore ermetico.
5. Soluzione di sucrosi (opzionale)
   1. Preparare la soluzione di saccarosio, in genere 10% (w/v) in massa (2–5 L) e conservare a 4 gradi centigradi quando non è in uso.
   2. Sostituire le bottiglie di saccarosio settimanali (al minimo) per prevenire la crescita batterica o fungina. Ispezionare le bottiglie ogni giorno e sostituirle se si osservano segni di crescita.
      NOT: Il saccarosio è fornito in aggiunta all'acqua, che è sempre disponibile.

3. Preparazione dieta caffetteria

1. Sbrinamento
   1. Estrarre le quantità appropriate di alimenti CAF per scongelare 24 h prima dell'uso. Il cibo può essere scongelato utilizzando un forno a microonde, ma non deve essere presentato mentre è caldo.
2. Rifornimento giornaliero della dieta CAF
   1. Cambiare gli alimenti dietetici CAF ogni giorno assicura che la varietà sia massimizzata e il sporco delle gabbie è ridotto al minimo. Poiché i ratti mangiano la maggior parte della loro assunzione giornaliera nella parte iniziale del ciclo buio, programmare il rifornimento di cibo CAF vicino all'inizio del programma buio in modo che il cibo è fresco in questo momento. Rifornire la dieta CAF in un giorno in cui l'assunzione di cibo non viene misurata.
   2. Alimenta i gruppi chow in un modo che assicura che questo gruppo abbia un'esperienza quotidiana simile, come segue.
      1. Girare le bottiglie d'acqua (beccucci), posizionare la gabbia sullo spazio di lavoro e rimuovere il coperchio.
      2. Disturbare leggermente la biancheria da letto per circa 20 s, per simulare il processo di raccolta di prodotti alimentari dalla biancheria da letto delle gabbie CAF.
      3. Mettere una piccola manciata di pellet chow dalla tramoggia nella biancheria da letto, per equiparare l'esposizione al cibo sulla biancheria da letto gabbia.
      4. Riportare il coperchio della gabbia e tornare al rack, sostituendo le bottiglie d'acqua solo quando la gabbia è depositata al fine di ridurre al minimo la fuoriuscita.
   3. Nutrire i gruppi di mensa
      1. Preparare gli articoli dietetici CAF in un contenitore etichettato per ogni gabbia.
      2. Girare le bottiglie d'acqua (beccucci), posizionare la gabbia sullo spazio di lavoro e rimuovere il coperchio.
      3. Rimuovere la maggior parte della vecchia dieta caffetteria dalla biancheria da letto possibile.
      4. Inserire la dieta fresca della mensa nella gabbia.
      5. Chiudere la gabbia e tornare al rack.
      6. Sostituire l'acqua e le bottiglie di saccarosio.
         NOT: Per evitare di esporre i ratti chow alla dieta CAF, prendere in considerazione l'alimentazione di gabbie chow prima delle gabbie CAF, o viceversa. I guanti devono essere cambiati tra la manipolazione di ratti di diversi gruppi di dieta.
3. Ricaricare chow, acqua e bottiglie di saccarosio, se necessario. Fare questo dopo altre procedure è più efficiente come scatole sono più pesanti dopo aver riempito il cibo e l'acqua.
   NOT: Le scatole CAF sporcano più rapidamente e devono essere cambiate più spesso per evitare lo stress indotto dall'esposizione alla biancheria da letto bagnata e da forti odori. Ispezionare la biancheria da letto ogni giorno e cambiare in base alle esigenze.

4. Assunzione di cibo oltre 24 H

NOT: Le misurazioni dell'assunzione di cibo sono condotte su un periodo discreto di 24 ore su più volte alla settimana.

1. Quando si iniziando la dieta CAF, misurare l'assunzione di cibo e 24 h assunzione di cibo almeno due volte a settimana per monitorare l'efficacia della dieta. Iniziare le misurazioni dell'assunzione di cibo vicino all'inizio della fase oscura. L'obiettivo è quello di presentare lo stesso insieme di alimenti CAF nei giorni di misurazione dell'assunzione di cibo, poiché l'equiparazione per densità di sapore e di energia consentirà un monitoraggio accurato dei cambiamenti nel tempo.
   NOT: Ciò potrebbe non essere possibile per studi che richiedono >2 misurazioni dell'assunzione di cibo a settimana, poiché esposizioni eccessive agli stessi alimenti possono ridurre l'iperfagia nel tempo.
2. CAF e misure di controllo dell'assunzione di diete
   1. Preparare la dieta CAF e metterla in un contenitore etichettato per ogni gabbia, pesando e registrando ogni componente. La figura 1 mostra un set completo di alimenti CAF. La tabella 3 è costituita da un esempio di foglio di monitoraggio dell'assunzione di cibo.
   2. Riempire l'acqua, il saccarosio e i livelli di chow come richiesto.
3. Per gabbie chow (controllo)
   1. Girare le bottiglie d'acqua (beccucci in su), posizionare la gabbia sullo spazio di lavoro e rimuovere il coperchio.
   2. Pesare i ratti e poi trasferirli in una gabbia con biancheria da letto fresca, insieme con arricchimento ambientale.
   3. Registrare il peso delle bottiglie d'acqua e del chow.
   4. Sostituire il coperchio della gabbia, riportare la gabbia al rack, quindi girare le bottiglie d'acqua. Piccoli cartelli che dicono "FOOD INTAKE" possono essere aggiunti alla gabbia per informare gli addetti ai ricercatori e non toccare bottiglie e chow.
4. Per le gabbie CAF:
   1. Eseguire gli stessi passaggi del passaggio 4.3. Inoltre disperdere il contenitore pre-pesato di alimenti CAF intorno alla gabbia con biancheria da letto fresca prima che i ratti vengano trasferiti.
   2. Lasciare i ratti per un periodo di 24 ore con disturbo minimo. Registrare eventuali interruzioni impreviste (ad esempio, l'arrivo di nuovi ratti nella stanza della colonia o i cambiamenti nel rumore ambientale).
5. Terminare la misurazione dell'assunzione di cibo
   1. Registrare il peso delle bottiglie d'acqua e chow per le gabbie chow, cercando con cura la biancheria da letto per pezzi di chow. Rimuovere il segno di "assunzione di cibo" dalle gabbie una volta completato.
   2. Preparare una dieta CAF fresca per le gabbie CAF.
   3. Per ogni gabbia CAF
      1. Registrare il peso di acqua, chow e saccarosio.
      2. Rimuovere il coperchio della gabbia e l'arricchimento ambientale.
      3. Rimuovere con attenzione i frammenti CAF dalla biancheria da letto e metterli in contenitori separati. Rimuovere prima i pezzi più grandi e poi setacciare sistematicamente tutta la biancheria da letto della gabbia da un'estremità all'altra utilizzando delicati movimenti di spazzamento.
         NOT: Applicare lo stesso grado di cura a ogni gabbia durante la raccolta del cibo. Registrare dove una gabbia è stata particolarmente disordinata: in alcuni casi i ratti macinano torta e/o biscotto in una polvere fine difficile da raccogliere. Questo può gonfiare artificialmente le misure di assunzione di cibo.
      4. Distribuire la nuova dieta CAF intorno alla gabbia, restituire l'arricchimento ambientale, chiudere il coperchio della gabbia e riportarlo al rack, rimuovendo il segno di "assunzione di cibo".
      5. Peso record di ogni alimento CAF al più vicino 0,1 g. Sottrai il cibo rimanente dal peso iniziale del cibo per ottenere il cibo totale consumato per gabbia, quindi divide per il numero di ratti in ogni scatola (assumendo così la stessa assunzione).
      6. Moltiplicare la quantità consumata (g/rat) per la densità di energia (kJ/g) di ogni alimento fornito dal produttore.
         NOT: Per calcolare l'assunzione di macronutrienti usiamo assumere densità di energia di 16,7 kJ / g per carboidrati e proteine, e 37 kJ / g per il grasso.

Risultati

Come mostrato nella Figura 2A, l'alimentazione dietetica CAF produce un aumento di 2,5 volte dell'apporto energetico rispetto ai controlli dei chow, sulla base dei dati di tre coorti di ratti Maschi Sprague Dawley, che è coerente in 6 settimane. Altri studi hanno confermato che questa estensione di iperfagia è sostenuta oltre 10²¹ e 16 esperimenti^{di 22} settimane. La curva di peso (Figura 2

Discussione

Esponendo i ratti a una varietà di alimenti altamente appetibili ad alto contenuto di grassi e zuccheri, il protocollo di dieta CAF descritto qui fornisce un modello affidabile e robusto della cosiddetta "dieta occidentale" consumata da molte persone. L'iperphagia, valutata come un aumento significativo dell'assunzione di energia rispetto ai controlli, si osserva entro i primi 24 h di esposizione, con differenze di peso corporeo statisticamente significative osservate in poche settimane. Così, CAF è un modello efficac...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-5 L plastic bottle			For preparing 10% sucrose solution, if applicable
Chopping board			Plastic is advised
Freezer			For storing CAF foods
Gordon's maintenance rodent chow	Gordon's Specialty Stockfeeds (Australia)		Maintenance diet used in our laboratory (14 kJ/g; 65% carb, 13% fat and 22% protein, as energy)
Large plastic storage boxes			All items above can be stored in containers for easy access
Large spoon			For CAF diet preparation
Microwave			For CAF diet thawing (when required)
Non-serrated knife			For CAF diet preparation
Paper towel			Important for cleaning work surfaces and the knife during CAF prep
Plastic containers			These are for weighing CAF food items on measurement days
Plastic funnel			For preparing 10% sucrose solution, if applicable
Red light			As CAF diet should be refreshed near the onset of the dark phase each day, a red light will assist when working in the dark
Tuna tins			For presenting 'wetter' CAF food items. Plastic containers may also be suitable
Weigh container x 3			Separate containers should be used to weigh rats, chow & bottles, and CAF foods
Weighing scale			Sensitivity to 0.1g is recommended
White sugar			For 10% sucrose solution, if applicable