Palatável dieta de estilo ocidental cafeteria como um método confiável para modelagem de dieta induzida obesidade em roedores

Resumo

Este protocolo descreve o uso de uma dieta altamente palatável, de estilo ocidental cafeteria para modelar excessos e obesidade em roedores. Aqui, fornecemos um esboço detalhado da seleção, preparação e medição de alimentos e explicamos fatores metodológicos que ajudam na geração de um fenótipo robusto e reproduzível.

Resumo

A obesidade está aumentando rapidamente na incidência em países desenvolvidos e em desenvolvimento e é conhecida por induzir ou exacerbar muitas doenças. A carga de saúde da obesidade e suas condições de comórbida destacam a necessidade de uma melhor compreensão de sua patogênese, mas as restrições éticas limitam os estudos em humanos. Para este fim, modelos externamente válidos de obesidade em animais de laboratório são essenciais para a compreensão do excesso de peso e obesidade. Enquanto muitas espécies têm sido usadas para modelar a gama de mudanças que acompanham a obesidade em seres humanos, roedores são mais comumente usados. Nosso laboratório desenvolveu uma dieta de cafeteria de estilo ocidental que consistentemente leva a um ganho de peso considerável e marcadores de doença metabólica em roedores. A dieta expõe roedores a uma variedade de alimentos altamente palatáveis para induzir hiperfagia, modelando o ambiente alimentar ocidental moderno. Esta dieta induz rapidamente o ganho de peso e o acúmulo de gordura corporal em ratos, permitindo o estudo dos efeitos de excessos e obesidade. Enquanto a dieta cafeteria pode não fornecer o mesmo controle sobre o perfil de macronutrientes e micronutrientes como purificado dietas ricas em gordura ou alto teor de gordura, alto teor de açúcar, a dieta cafeteria normalmente induz um fenótipo metabólico mais grave do que o observado com purificado dietas e está mais de acordo com distúrbios metabólicos observados na população humana com sobrepeso e obesidade.

Introdução

A obesidade e suas comorbidades relacionadas dão uma enorme contribuição para a carga de saúde global¹ e respondem por 7% da carga da doença na Austrália². Um dos principais fatores de risco para a obesidade é o consumo de dietas insalubres que são ricos em gordura saturada e carboidratos refinados, e pobre em fibras e micronutrientes³. Identificar alvos para intervenção terapêutica para obesidade requer modelos que possam avaliar sistematicamente os efeitos em múltiplos sistemas bioquímicos e fisiológicos. Nossa compreensão da etiologia da obesidade tem sido avançada substancialmente pelo trabalho usando modelos de roedores, onde efeitos comportamentais, metabólicos e moleculares podem ser estudados ao longo do tempo condições controladas, onde os fatores ambientais podem ser facilmente Manipulado.

O modelo de dieta cafeteria (CAF) de obesidade induzida pela dieta consiste em complementar a dieta padrão de ração dos roedores com uma variedade de alimentos palatáveis que são ricos em gordura saturada, carboidratos refinados, ou ambos. Exemplos desses alimentos incluem bolos, biscoitos doces e lanches salgados ricos em gordura (como carnes processadas, queijo e batatas fritas). Promove de forma confiável a hiperfagia e o rápido ganho de peso em roedores. As principais características do modelo são o fornecimento de uma variedade de alimentos altamente palatáveis, projetados para simular o ambiente alimentar moderno. O acesso à variedade aumenta a ingestão de alimentos em ratos a curto prazo⁴ e em seres humanos^5, mesmo quando os alimentos são combinados para palatabilidade e variam apenas em sabor e pistas olfativas^4,6. No entanto, um estudo mostrou que o fornecimento de dietas purificadas combinadas com energia e macronutrientes que variavam em sabor e textura não teve efeito sobre o ganho de peso corporal a longo prazo em ratos^7,sugerindo que a composição de nutrientes e os efeitos pós-orais distintos de diferentes alimentos também podem contribuir para comer demais. A exposição a múltiplos sabores e texturas supera a saciedade sensorial-específica, que descreve a diminuição do desejo de comer um alimento recentemente comido em relação a uma alternativa⁵. Em muitas coortes em nosso laboratório, observamos da mesma forma que o uso de alimentos altamente palatáveis amplifica ainda mais os excessos.

Esta dieta caf tem sido usada há mais de 40 anos, desde Sclafani⁸ relatou que ratos do sexo feminino expostos a uma variedade de "alimentos de supermercado" (marshmallows, chocolate, manteiga de amendoim, biscoitos, salame e queijo entre eles) exibiu ganho de peso acelerado em relação aos controles. Este e outros estudos iniciais observou que as dietas caf estilo parecia acelerar o ganho de peso de forma mais eficaz do que puro alto teor de gordura ou dietas ricas em carboidratos ^8,9. O trabalho na década de 1980 caracterizou os perfis de macronutrientes¹⁰ e padrões de refeição¹¹ de ratos alimentados com dietas CAF, e mostrou profundas mudanças nos níveis de massa gorda e insulina^9,10 e termogênese¹². Nosso grupo tem usado a dieta CAF para modelar a obesidade por mais de duas décadas^13,14 e durante este tempo temos usado várias variantes da dieta. Ratos são apresentados com pelo menos dois alimentos doces e dois salgados por dia, além de comida regular e água. Nos últimos anos, começamos a complementar alimentos sólidos caf com solução de sacarose de 10%. A capacidade de adaptar a dieta CAF a diferentes projetos experimentais é uma força do modelo.

As dietas da CAF promovem hiperfagia imediata (ou seja, dentro das primeiras 24 h) e ganhos constantes em peso corporal e massa gorda. No entanto, uma conseqüência da maximização da variedade é que a ingestão de macronutrientes e micronutrientes não é controlada, um ponto de vista alguma como uma falha intransponível¹⁵. Estudos de obesidade induzida pela dieta mais comumente usam dietas purificadas de alto teor de gordura (HF) ou dietas combinadas com alto teor de gordura e alto teor de açúcar (HFHS), que oferecem controle preciso sobre o conteúdo nutricional e são menos trabalhosas do que o modelo CAF, que requer monitoramento diário e planejamento cuidadoso e execução do cronograma. A relevância translacional das dietas de HF purificadas comercialmente disponíveis é um tema de debate em curso, já que seu perfil de ácidos graxos e proporções de gordura e sacarose podem não se alinhar com a ingestão alimentar humana¹⁶. Embora a dieta caf não oferece o mesmo grau de controle sobre a composição de nutrientes como dietas purificadas, que visa modelar a palatabilidade e variedade que caracteriza as opções alimentares na maioria das sociedades modernas.

Protocolo

O protocolo descrito aqui foi otimizado para uso em ratos. Embora tenhamos usado a dieta CAF com sucesso em camundongos^17,18, moagem de alimentos moles pode introduzir mais erros reduzindo a confiabilidade da ingestão de alimentos medidas¹⁹. Este protocolo é aprovado pelo Animal Care and Ethics Committee da Universidade de Nova Gales do Sul e está em conformidade com as diretrizes australianas para o uso e cuidados de animais para fins científicos (8ª Edição) fornecidas pela Australian National Health e Conselho de Pesquisa Médica.

Nota: Muito poucos efeitos adversos foram observados em nossos estudos de curto prazo (ou seja, <10 semanas ad libitum CAF acesso); não há evidências de mudanças no bem-estar geral, atividade, sociabilidade ou comportamento de ansiedade em ratos na dieta^{CAF 20}. Após intervalos mais longos (>16 semanas) incidentes cardiovasculares muito ocasionais foram observados em ratos alimentados com CAF.

1. Aclimatação animal e habitação

1. Aclimate ratos à instalação por 5-7 dias após a chegada com acesso gratuito para controlar a dieta e a água. Lidar com ratos diariamente a partir de 24 h após a chegada; A dieta da CAF envolve interação diária com a gaiola, então o manuseio regular é importante.
2. Certifique-se de que o enriquecimento ambiental é fornecido a todas as gaiolas. Uma gaiola padrão contém uma caixa de metilo vermelho de metacrilato, material de nidificação e um bastão de mastigação de madeira, o que é importante porque os alimentos macios fornecidos dentro da dieta CAF podem resultar em ratos que desenvolvem maloclusão sem acesso a itens mais difíceis de mastigar.
3. Antes de iniciar a dieta caf, atribuir gaiolas para grupos caf ou chow e garantir que estes são combinados para iniciar o peso corporal, comparando a média ea gama de pesos corporais entre os grupos e realocação, se necessário. Como a exposição à iluminação pode afetar os ritmos circadianos, a ingestão e a atividade dos alimentos, garantir que as gaiolas de CAF e chow sejam distribuídas uniformemente na sala da colônia.
   Nota: Roedores formam hierarquias sociais quando abrigados em grupo (especialmente machos). Os efeitos do estresse social são parcialmente controlados, garantindo ratos estão alojados com outros de um peso corporal semelhante (para reduzir o bullying dentro de uma gaiola). Além disso, a dieta do refeitório deve ser distribuída uniformemente ao redor da gaiola para que todos os ratos tenham acesso à dieta.

2. Seleção de dieta e configuração

1. Agendamento
   1. Certifique-se de que a comida e a água regulares estejam sempre disponíveis e sejam complementadas com um mínimo de dois itens doces e dois salgados por dia (um exemplo de uma programação semanal é mostrado na Tabela 1; opções de comida para 3 dias mostradas na Figura 1). Extras opcionais são alto teor de gordura, sopa de alto teor de açúcar e solução de sacarose 10%.
   2. Escolha alimentos dentro de cada categoria que são semelhantes em proporções de macronutrientes: todos os itens doces são relativamente mais elevados em carboidratos do que a gordura e todos os itens salgados são mais elevados em gordura do que carboidratos. Objetivo de fornecer proporções semelhantes de gordura, carboidratos, açúcar e proteína em cada conjunto diário de alimentos CAF.
   3. Monitorar regularmente o consumo durante todo o experimento para que o menu possa ser adaptado, se necessário, para sustentar a hiperfagia. A tabela 2 fornece a densidade de energia e a informação do macronutrient para diversos alimentos do exemplo, e sugeriu quantidades começando para 200 g ratos masculinos de Sprague Dawley.
   4. Evite alimentar qualquer alimento único em dias consecutivos ou com muita freqüência em uma semana, pois isso pode diminuir a ingestão desse alimento. Se isso ocorrer, omita a comida do cronograma por alguns dias antes de reincorporar.
      Nota: Ratos podem exibir neofobia e a maioria dos novos alimentos requerem exposições repetidas para determinar se eles serão consumidos. Ratos não costumam preferir alimentos que contenham levedura (pães, pizza, etc)ou aqueles com sabores cítricos ou de café.
2. Alimentos molhados
   1. Considere apresentar alimentos mais elevados no índice da umidade em um recipiente tal como uma lata de atum, para evitar sujar o fundamento. Recipientes vazios também devem ser fornecidos para controlar gaiolas se isso for feito.
3. Dietética sourcing
   1. Certifique-se de que os alimentos da CAF utilizados são grampos ou obtenham o suficiente para todo o experimento para que os alimentos permaneçam consistentes e não precisem ser substituídos.
4. Armazenamento da dieta
   1. Armazenar alimentos como indicado na embalagem ou a -20 °C e descongelar na noite anterior ao uso. Armazenar produtos secos (biscoitos) em um recipiente hermético.
5. Solução de sacarose (opcional)
   1. Prepare a solução de sacarose, normalmente 10% (w/v) a granel (2-5 L) e guarde a 4 °C quando não estiver em uso.
   2. Substitua garrafas de sacarose semanalmente (no mínimo) para evitar o crescimento bacteriano ou fúngico. Inspecione garrafas diariamente e substitua se forem observados sinais de crescimento.
      Nota: A sacarose é fornecida além da água, que está sempre disponível.

3. Preparação da dieta do cafeteria

1. Descongelar
   1. Tire quantidades adequadas de alimentos CAF para descongelar ~ 24 h antes do uso. Os alimentos podem ser descongelados usando um microondas, mas não devem ser apresentados enquanto estiver quente.
2. Reposição diário da dieta da CAF
   1. Mudar os alimentos da dieta CAF diariamente garante que a variedade é maximizada, e a sutura da gaiola é minimizada. Como os ratos comem a maior parte de sua ingestão diária na parte inicial do ciclo escuro, agendar a reposição de alimentos caf perto do início do horário escuro para que os alimentos são frescos neste momento. Reabastecer a dieta caf em um dia em que a ingestão de alimentos não está sendo medido.
   2. Alimente os grupos de ração de uma forma que garanta que esse grupo tenha uma experiência diária semelhante, da seguinte forma.
      1. Vire as garrafas de água ao redor (bicos para cima), coloque a gaiola no espaço de trabalho e retire a tampa.
      2. Perturbe levemente o fundamento para aproximadamente 20 s, para simular o processo de coleta de alimentos a partir da cama de gaiolas CAF.
      3. Coloc um punhado pequeno de pelotas do chow do funil do alimento no fundamento, para igualar a exposição ao alimento no fundamento da gaiola.
      4. Devolva a tampa da gaiola e retorne ao rack, substituindo garrafas de água somente quando a gaiola for liquidada, a fim de minimizar o derramamento.
   3. Alimentando os grupos do cafeteria
      1. Prepare itens da dieta CAF em um recipiente rotulado para cada gaiola.
      2. Vire as garrafas de água ao redor (bicos para cima), coloque a gaiola no espaço de trabalho e retire a tampa.
      3. Remova tanto da dieta velha do cafeteria do fundamento como possível.
      4. Coloque a dieta fresca do refeitório na gaiola.
      5. Feche a gaiola e volte para o rack.
      6. Substitua as garrafas de água e sacarose.
         Nota: Para evitar expor ratos de chow à dieta da CAF, considere alimentar gaiolas de chow antes das gaiolas da CAF, ou vice-versa. Luvas devem ser alteradas entre o manuseio de ratos de diferentes grupos de dieta.
3. Recuo as garrafas de ração, água e sacarose, conforme necessário. Fazer isto depois que outros procedimentos são mais eficientes porque as caixas são mais pesadas após a cobertura acima do alimento e da água.
   Nota: As caixas do CAF sujam mais ràpida e precisam de ser mudadas mais frequentemente para evitar o esforço induzido pela exposição ao fundamento molhado assim como cheiros fortes. Inspecione o fundamento diário e mude conforme apropriado.

4. Ingestão de alimentos mais de 24 H

Nota: As medições de ingestão de alimentos são realizadas durante um período discreto de 24 h várias vezes por semana.

1. Ao iniciar a dieta CAF, medir o peso corporal e 24 h ingestão de alimentos pelo menos duas vezes por semana para monitorar a eficácia da dieta. Comece as medições de ingestão de alimentos perto do início da fase escura. O objetivo é apresentar o mesmo conjunto de alimentos da CAF em dias de medição de ingestão de alimentos, pois equiparar para densidades de sabor e energia permitirá um monitoramento preciso das mudanças ao longo do tempo.
   Nota: Isso pode não ser possível para estudos que exigem medições >2 de ingestão de alimentos por semana, já que exposições excessivas aos mesmos alimentos podem reduzir a hiperfagia ao longo do tempo.
2. Caf e controlar medidas de ingestão de dieta
   1. Prepare a dieta caf e coloque em um recipiente rotulado para cada gaiola, pesando e registrando cada componente. A Figura 1 mostra um conjunto completo de alimentos caf. A tabela 3 consiste em uma folha de monitoramento de ingestão de alimentos de exemplo.
   2. Reencher os níveis de água, sacarose e ração, conforme necessário.
3. Para gaiolas de ração (controle)
   1. Vire garrafas de água ao redor (bicos para cima), coloque a gaiola no espaço de trabalho e retire a tampa.
   2. Pese os ratos e, em seguida, transferi-los para uma gaiola com cama fresca, juntamente com o enriquecimento ambiental.
   3. Peso recorde de garrafas de água e ração.
   4. Substitua a tampa da gaiola, devolva a gaiola ao rack e, em seguida, vire as garrafas de água ao redor. Pequenos sinais que anotam a "entrada food" podem ser adicionados à gaiola para notificar os atendentes e pesquisadores para não tocar garrafas e comer.
4. Para as gaiolas da CAF:
   1. Executar os mesmos passos que na etapa 4.3. Além disso, espalhe o recipiente pré-pesado de alimentos CAF ao redor da gaiola com cama fresca antes que os ratos sejam transferidos.
   2. Deixe ratos por um período de 24 h com perturbação mínima. Registre quaisquer interrupções inesperadas (por exemplo, chegada de novos ratos à sala da colônia ou mudanças no ruído ambiente).
5. Terminar a medição de ingestão de alimentos
   1. Peso recorde de garrafas de água e comida para as gaiolas de comida, cuidadosamente procurando na cama por pedaços de comida. Retire o sinal de "ingestão de alimentos" das gaiolas uma vez concluída.
   2. Prepare a dieta fresca da CAF para gaiolas da CAF.
   3. Para cada gaiola da CAF
      1. Peso recorde de água, ração e sacarose.
      2. Retire a tampa da gaiola e o enriquecimento ambiental.
      3. Retire cuidadosamente os fragmentos da CAF da cama e coloque em recipientes separados. Remova as partes as maiores primeiramente e sift sistematicamente todo o fundamento da gaiola de uma extremidade à outro usando movimentos arrebatadores delicados.
         Nota: Aplique o mesmo grau de cuidado a cada gaiola ao coletar o alimento. Registro onde uma gaiola tem sido particularmente confuso, em alguns casos ratos vai moer bolo e / ou biscoito em um pó fino que é difícil de coletar. Isso pode inflar artificialmente as medidas de ingestão de alimentos.
      4. Distribua a nova dieta da CAF ao redor da gaiola, devolva o enriquecimento ambiental, feche a tampa da gaiola e devolva-a ao rack, removendo o sinal de "ingestão de alimentos".
      5. Peso recorde de cada alimento CAF para os alimentos mais próximos de 0,1 g. Subtraia os alimentos remanescentes do peso alimentar inicial para obter alimentos totais consumidos por gaiola e, em seguida, divida pelo número de ratos em cada caixa (assumindo assim a ingestão igual).
      6. Multiplique a quantidade consumida (g/rat) pela densidade energética (kJ/g) de cada alimento fornecido pelo fabricante.
         Nota: Para calcular a ingestão de macronutrientes, usamos assumir densidades energéticas de 16,7 kJ/g para carboidratos e proteínas, e 37 kJ/g para gordura.

Resultados

Como mostrado na Figura 2A, a alimentação dietética caf produz um aumento de 2,5 vezes na ingestão de energia em relação aos controles de ração, com base em dados de três coortes de ratos machos Sprague Dawley, que é consistente ao longo de 6 semanas. Outros estudos confirmaram que essa extensão da hiperfagia é sustentada ao longo de 10 experimentos^{de 21} e 16^{semanas 22} semanas. A curva de peso(F...

Discussão

Ao expor ratos a uma variedade de alimentos altamente palatáveis ricos em gordura e açúcar, o protocolo de dieta CAF descrito aqui fornece um modelo confiável e robusto da chamada "dieta ocidental" consumida por muitas pessoas. A hiperfagia- avaliada como um aumento significativo na ingestão de energia em relação aos controles - é observada nos primeiros 24 h de exposição, com diferenças estatisticamente significativas de peso corporal observadas em semanas. Assim, a CAF é um modelo eficaz de obesidade induzi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-5 L plastic bottle			For preparing 10% sucrose solution, if applicable
Chopping board			Plastic is advised
Freezer			For storing CAF foods
Gordon's maintenance rodent chow	Gordon's Specialty Stockfeeds (Australia)		Maintenance diet used in our laboratory (14 kJ/g; 65% carb, 13% fat and 22% protein, as energy)
Large plastic storage boxes			All items above can be stored in containers for easy access
Large spoon			For CAF diet preparation
Microwave			For CAF diet thawing (when required)
Non-serrated knife			For CAF diet preparation
Paper towel			Important for cleaning work surfaces and the knife during CAF prep
Plastic containers			These are for weighing CAF food items on measurement days
Plastic funnel			For preparing 10% sucrose solution, if applicable
Red light			As CAF diet should be refreshed near the onset of the dark phase each day, a red light will assist when working in the dark
Tuna tins			For presenting 'wetter' CAF food items. Plastic containers may also be suitable
Weigh container x 3			Separate containers should be used to weigh rats, chow & bottles, and CAF foods
Weighing scale			Sensitivity to 0.1g is recommended
White sugar			For 10% sucrose solution, if applicable