巨噬细胞报告器细胞分析，以检查聚合物表面的吸附蛋白层上的收费类似受体介导NF-kB/AP-1信号

摘要

该协议为研究人员提供了一种快速、间接的方法，用于测量小鼠巨噬细胞系中与TLR相关的NF-B/AP-1转录因子活性，以响应各种聚合物表面和吸附蛋白层，这些蛋白质层为生物材料植入微环境建模。

摘要

对植入的生物材料（称为异物反应）的持续炎症宿主反应是生物医学设备和组织工程结构开发和实施方面的一个重大挑战。巨噬细胞，一种先天免疫细胞，是异物反应的关键参与者，因为它们在设备的寿命期间停留在植入部位，并且经常被研究，以理解这种有害的宿主反应。许多生物材料研究人员已经表明，在植入材料上吸附蛋白质层会影响巨噬菌体行为，进而影响宿主反应。本文的方法描述了一种体外模型，利用在聚合物生物材料表面含有细胞损伤分子的吸附蛋白层来评估巨噬细胞反应。NF-*B/AP-1报告器巨噬细胞系和相关色度碱性磷酸酶测定作为一种快速方法，间接检查NF-*B/AP-1转录因子活性，以响应含有血液蛋白和损伤相关分子模式的复杂吸附蛋白层，作为在体内生物材料表面形成的复杂吸附蛋白层的模型。

引言

异物反应（FBR）是一种慢性宿主反应，通过持续释放炎症介质和阻碍植入物质与周围组织¹的整合，会对植入的物质或装置（如药物输送装置、生物传感器）的性能产生负面影响。这种先天免疫反应是由植入程序引起的，其特点是先天免疫细胞和纤维胶囊在植入物¹周围长期存在。在物质宿主响应的上下文中，巨噬菌体-材料相互作用对宿主响应的进展和^FBR1的发展有显著影响。巨噬细胞是一种多样化的先天免疫细胞群，从组织居民巨噬细胞群或从血液中提取的单细胞衍生巨噬细胞被招募到植入部位。它们在植入后不久开始在植入部位积累，并在几天内成为植入微环境中的主要细胞群。物质粘附性巨噬细胞，以及通过巨噬细胞融合形成的异体巨细胞（FBGC），可以在植入物^2、3的寿命内在材料表面保持。因此，巨噬细胞被认为是异体反应的关键参与者，因为它们的作用是协调FBR的特征步骤:急性炎症反应、组织重塑和纤维化组织^形成1。

收费受体（TTL）是一个模式识别受体家族，由许多免疫细胞（包括巨噬细胞）表达，并已被证明在炎症和伤口愈合中发挥重要作用。除了病原体衍生的配体外，TDR 能够结合内源性分子，称为损伤相关分子模式 （DAMPs），这些分子在细胞坏死期间释放并激活炎症信号通路，导致产生亲炎细胞因子⁴。我们和其他人提出，软组织生物材料植入过程中发生的损伤释放DAMPs，然后吸附到生物材料表面，除了血液蛋白和调节随后的细胞-物质相互作用^5，6。当巨噬细胞与植入物上的吸附蛋白层相互作用时，其表面TVR可以识别吸附的DamPs并激活亲炎信号级联，导致NF-βB和AP-1转录因子的激活和原炎细胞因子的产生。我们之前已经表明，与仅吸附血清或血浆表面（即不存在DAMPs）相比，小鼠巨噬细胞显著地增加了NF-β-B/AP-1活性和肿瘤坏死因子α（TNF-α，前激细胞因子）分泌物，以响应各种聚合物表面的含DAMP吸附蛋白层，而仅吸附血清或血浆的表面（即，不存在DAMPs），而这种反应主要是由TLR2调节的。

该协议中使用的NF-+B/AP-1报告宏噬细胞细胞系（材料表）是测量巨噬细胞^5、7、8中相对NF-+B和AP-1活性的便捷方法。结合TLR通路抑制剂，该细胞系是研究TLR激活及其在炎症中作用的有用工具，对各种刺激^5，7，8。报告细胞是经过修饰的小鼠巨噬细胞样细胞系，可在NF-βB和AP-1转录因子活化⁹时稳态产生分泌的胚胎碱性磷酸酶（SEAP）。然后，可以使用色度酶碱性磷酸酶测定（材料表）来量化相对量的SEAP表达，作为NF-βB/AP-1活性的间接测量。由于NF-βB和AP-1是许多细胞信号通路的下游，因此可用于验证特定通路的作用，用于验证特定途径的作用，以靶向特定TVR（例如TLR2）或TLR适配器分子（本文中描述的方法提供了一种简单而快速的方法，用于评估 TLR 信号在小鼠巨噬细胞反应中对各种聚合物表面的贡献，其中吸附的蛋白质层同时含有血液蛋白和 DAMPs，作为植入生物材料的体外模型。

研究方案

1. 介质和试剂制备

1. 准备成纤维细胞介质。结合450 mL的Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM），50 mL的胎儿牛血清（FBS），和5 mL的青霉素/链霉素。储存在4°C下长达3个月。
2. 准备记者巨噬菌体生长介质在50 mL等分。结合45 mL的DMEM，5 mL的FBS，5μg/mL支原虫消除试剂（材料表）和200μg/mL phleomycin D1（材料表）。储存在4°C下长达3个月。
3. 准备记者巨噬菌体测定介质在50 mL等分。结合 45 mL 的 DMEM、5 mL 的热灭活 FBS （HI-FBS）、5 μg/mL 支原体消除试剂和 200 μg/mL phleomycin D1。储存在4°C下长达3个月。

2. 用聚氨酯（甲基丙烯酸酯）涂覆细胞培养表面

1. 在20 mL玻璃闪烁小瓶中以20毫克/mL（例如，在5mL氯仿中100毫克PMMA）在氯仿中溶解聚（甲基丙烯酸酯）（PMMA）。将磁力搅拌棒放入小瓶中，搅拌至少 2 小时，直到所有固体溶解。
   警告:氯仿是有害的，如果吸入。佩戴 PVA 手套时，确保在烟罩中使用溶剂。
2. 将 400 μL 的 PMMA 溶液移液器放在旋转涂层中硼硅酸盐玻璃显微镜滑片的中心，以 3000 rpm 转速旋转 2 分钟。将幻灯片存放在干净的包装盒中（用 70% 乙醇喷洒和擦拭），以供将来使用。
   注:旋转涂层通常用于在平坦的表面上沉积薄而均匀的涂层。旋转涂布机使用离心力将涂层溶液铺覆在表面上，从而高速旋转基板。
   1. 使用测角仪在额外涂层幻灯片（即，不用于细胞培养的幻灯片）表面的两个随机位置测量水接触角度，以确保玻璃表面完全涂有聚合物。
      注:只有纯度最高的水（例如玻璃三重蒸馏）才可用于水接触角度测量。
3. 在生物安全柜 （BSC） 中，使用无菌钳子和无菌技术将 8 室粘性孔连接到 PMMA 涂层滑轨上。用力按压粘性井的顶部，确保它们牢固地连接在一起。在37°C下用附着的粘水井孵育幻灯片过夜，以固定密封。
   1. 在每个孔中加入200μL的细胞培养等级（无内毒素）水，测试粘性井的密封。在室温 （RT） 下孵育 60 分钟，并确保在继续前没有泄漏。吸水，小心不要干扰PMMA涂层。
4. 在使用前，向每口井中加入300 μL的无内毒素水，孵育1小时（三次）、12小时和24小时，以去除任何剩余的溶剂，从而进行无内毒素水的浇注。
5. 测试用于细胞培养的幻灯片的内毒素浓度。在每个滑道的一个井中孵育200μL的内毒素试剂水（材料表），每次1小时。使用端点染色体内毒素测定（材料表）测量提取物中的内毒素浓度。
   注:以下协议特定于材料表中列出的内毒素测定试剂盒。
6. 这项工作仅使用经认证的无热原（即无内毒素）的水和消耗品（即移液器尖端、微离心管和井板）。此外，在制备聚合物涂层表面时使用的任何玻璃器皿在使用¹⁰之前，应使用干热灭菌（250 °C，30 分钟）进行脱硫。如本文所述，测量萃取液中的内毒素会导致材料表面^11、12上内毒素的低估。因此，建议在开发聚合物涂层方案时，直接在含有涂层样品的井内执行内毒素检测反应（即测试样品[试剂水]或尖峰控制步骤2.5.4_2.5.6），以确保在涂布过程中不会无意中将内毒素来源引入系统。
   1. 将所有测试样品（即提取物）和内毒素检测试剂带到RT.在检测缓冲液中重组致色试剂，在试剂水中采用内毒素标准，在使用前溶解5分钟，轻轻旋转。不使用时用石蜡薄膜盖住所有瓶子。
   2. 通过在试剂水中对内毒素标准进行连续稀释，创建从测定的下限到上限的内毒素标准的5×8点标准稀释曲线。
   3. 为了控制或抑制测试样品中的内毒素检测，通过稀释未使用的测试样品溶液中的已知内毒素量，制备正对照（也称为尖峰控制或尖峰样品）。
      注:正控制浓度应与标准曲线中间的标准浓度相同。如果内毒素尖峰的回收量（即正控制浓度减去未发刺的测试样品的浓度）在内毒素尖峰的名义浓度的50-200%以内，则萃取溶液可被视为对测定没有显著干扰。
   4. 在重复或三联的 96 孔板的每个孔中添加 50 μL 的标准、样品或尖峰控制。使用试剂水作为负控制。
   5. 在每个井中加入50μL的色原试剂。快速将所有试剂添加到所有井中。使用计时器记录向所有油井添加试剂所需的时间。用胶粘剂密封覆盖板，并在 37°C 孵育（孵育时间取决于很多，并在含色试剂盒中包含的分析证书上注明）。或者，在孵育期间每15分钟检查一次，直到在所有标准井中观察到颜色变化。
   6. 孵育后，向每口井中加入25μL的50%醋酸（每口井最终浓度为10%醋酸），以阻止反应。以与添加色原试剂相同的顺序添加醋酸。在 405 nm 处使用板读取器读取板的吸光度。吸气液和丢弃板。
      注:醋酸添加应需要相同的时间长度添加到每个和色原试剂采取（± 30 s）。
7. 紫外线（UV）在细胞培养实验前对幻灯片进行30分钟的消毒。

3. 用聚二甲基硅氧烷涂覆细胞培养表面

1. 以 10:1 重量比（碱基:固化剂）混合聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 弹性体。在生物安全柜中，将大约 10 mL 的聚二甲基硅氧烷基液放入无菌管中。称量管并缓慢添加固化剂，直到添加 10%。
   警告:在通风良好的区域使用 PDMS 试剂，戴上安全眼镜避免眼睛接触。
2. 通过用无菌血清移液器尖端搅拌和上下移液，彻底混合弹性体。将大约 200 μL 的溶液添加到 48 孔板的每个孔中。缓慢倾斜井板，确保使用弹性体溶液完全覆盖井。
3. 将带弹性体的孔盘放入 50 cmHg、40°C 的真空烤箱中。用单板擦拭取下盖子和盖板，以防止其他碎屑落入井中。允许孵育至少48小时。
   1. 通过目视检查确认孔已完全涂覆。在拆卸前，用无菌移液器尖端轻轻推动弹性体，确保完全固化。
4. 加入300 μL的70%乙醇（用绝对乙醇和无内毒素水制成），在RT孵育1小时。去除乙醇，通过每口井加入300μL无内毒素水，孵育1小时（3次），12小时，并在使用前24小时除去任何剩余的溶剂。
   1. 在每个板的三口井中孵育200μL无内毒素水1小时。使用端点染色体内毒素测定（步骤2.5.1~2.5.6）测量水提取物的内毒素浓度。

4. 用氟化聚苯乙烯（四氟乙烯）涂覆细胞培养表面

1. 在 20 mL 玻璃闪烁小瓶中加入 10 mg fPTFE 到 10 mL 的氟化溶剂 [材料表] ） 中，将 1mg/mL 的氟化聚乙烯 （fPTFE） 溶液制成。将磁力搅拌棒放入小瓶中，搅拌至少 24 小时，直到所有固体溶解。
2. 将约150μL的聚合物溶液添加到聚苯乙烯48孔板（即未处理组织培养物）的每个孔中。缓慢倾斜井板，确保用聚合物溶液完全覆盖所有井。更换盖子。
   1. 为确保有效的水环涂层，玻璃盖唇应涂覆在fPTFE中，用于水接触角测量（步骤4.3.1）。将盖板放在 24 孔板的井内。将约 400 μL 的聚合物溶液添加到每口含有盖玻片的井中。使用无菌钳子向下推盖玻片，确保它们完全覆盖聚合物溶液中，并用盖子盖住井板。
3. 将带有聚合物溶液和/或盖玻片的孔板放入 50 cmHg、40°C 的真空烤箱中。用单板擦拭取下盖子和盖板，以防止其他碎屑落入井中。允许孵育至少48小时。
   1. 使用测角仪测量 fPTFE 涂层盖玻片的水接触角，以确保有效涂层。
      注:只有纯度最高的水（例如玻璃三重蒸馏）才可用于水接触角度测量。
4. 加入300 μL的70%乙醇（用绝对乙醇和无内毒素水制成），在RT孵育1小时。去除乙醇，通过每口井加入300μL无内毒素水，孵育1小时（3次），12小时，并在使用前24小时除去任何剩余的溶剂。
   1. 在每个板的三口井中孵育200μL无内毒素水1小时。使用端点染色体内毒素测定法测量水提取物的内毒素浓度（步骤2.5.1~2.5.6）。
5. 紫外线在细胞培养实验前对井板进行30分钟的消毒。

5. 从 3T3 细胞制作莱沙

1. 在多个 T150 烧瓶中将 3T3 细胞生长到 70% 汇合。要分离细胞，吸气介质，用5 mL的PBS清洗表面，吸气PBS。加入5mL的无动物来源，重组细胞分离酶（材料表），并在37°C孵育3~5分钟。
2. 通过轻轻来回倾斜烧瓶来分离细胞。加入5 mL的PBS，以中和用于细胞分离的重组酶。将分离的细胞从烧瓶转移到离心管中，并通过移液混合。使用血细胞计和细胞活力染料执行活细胞计数。
   注:选择了一种可以通过在PBS中稀释中中和的细胞解散酶，以避免在裂解制剂中引入基于血清的蛋白质。如果胰蛋白酶用于分离细胞，则应用含血清的溶液中和，并应进行额外的PBS洗涤，以减少血清蛋白进入解液制剂的数量。
3. 在200 x g下将细胞离心5分钟。在PBS的原始体积（即10 mL x烧瓶数）中吸出上清液并重新悬浮细胞，以洗掉任何剩余的介质。重复。
4. 再次在200 x g下将细胞离心5分钟，并吸出上清液。加入实现1 x 10⁶细胞/mL的最终细胞浓度所需的PBS体积。将电池溶液放入-80°C冷冻箱中，直到样品完全冷冻（至少2小时）。
5. 在37°C水浴中解冻细胞溶液。完全解冻后，将溶液放回-80°C冷冻室，直到完全冷冻。重复总共 3 个冻结-解冻循环。
6. 对各种稀释剂（例如，1/100、1/200、1/500、1/1000）的细胞解液进行微质质酸（BCA）测定，以确定蛋白质浓度。将细胞内盐稀释至468.75μg/mL、等分蛋白浓度，并储存在-80°C，以供将来使用。
   注:48孔板中最终蛋白质浓度为125微克/厘米^2（基于一口井的表面面积，0.75 cm²）。
7. 通过在1.5毫米厚的10%的聚丙烯酰胺凝胶上加载40~60μse蛋白，在液中加载40~60μg蛋白，评估赖糖中的DAMPs（例如热休克蛋白60[HSP60]、高流动性组盒1[HMGB1]），评估其中是否存在DAMPs程序。

6. 评估吸附蛋白层和收费受体对巨噬细胞NF-+B活性的影响

注:有关实验工作流和板材布局的示意图，请分别参见图 1A和补充图 1。

1. 在适当大小的烧瓶中生长到70%的汇合物。吸气介质，用PBS清洗表面，吸气PBS。加入重组细胞解散酶，在37°C孵育8分钟。
2. 通过牢牢敲击烧瓶的侧面来分离细胞。通过添加相等量的生长介质（包含 10% FBS）来灭活重组细胞分离酶。使用血细胞计和细胞活力染料执行活细胞计数。
   注:在细胞解散酶中孵育8分钟后，报告巨噬细胞的预期存活率为90%。
3. 在200 x g下离心细胞5分钟。吸气上清液，在原体积的PBS中重新悬浮以洗涤细胞。再次离心，在测定介质（包含热灭活FBS）中，以7.3 x 10⁵细胞/mL重新悬浮细胞。
4. 将细胞悬浮液分离成3个不同的管:TLR4抑制剂，抗TLR2，未经治疗。使用 1 μg/mL TLR4 抑制剂孵育细胞，在 RT 下孵育 60 分钟，在 RT 使用 50 μg/mL 抗 TLR2 30 分钟。
5. 将200μL的解糖、10%FBS、10%商用小鼠血浆（材料表）或蛋白质溶液的混合物加入48孔板（或等效），并允许蛋白质在37°C下吸附所需时间（即30分钟、60分钟或24小时）。从井中吸出蛋白质溶液，为每个蛋白质溶液使用新鲜的巴斯德移液器，并用250μL的PBS清洗表面5分钟。重复 3 次，共进行 3 次。
   注:此步骤可能需要在协议中更早开始，具体取决于所需的吸附时间。相应地调整协议。
6. 孵育期后用TLR4抑制剂或抗TLR2，移液细胞重新悬浮。在每个孔中加入200μL的细胞溶液。
7. 对于 TLR2 阳性控制条件，将 Pam3CSK4 添加到 150 纳克/mL 的最终浓度中。对于TLR4阳性控制条件，将脂多糖（LPS）加入1.5μg/mL的最终浓度。在37°C孵育细胞20小时。
8. 从每个孔中取样20μL的上清液，并复制成96孔板。将三口 20 μL 测定介质作为背景控制。在每个井中加入 200 μL 的 SEAP 报告器测定试剂。用粘合密封盖住板，并在 37°C 下孵育 2.5 小时。
   注:孵育时间可能因实验条件而异，应针对正负对照井之间的吸收性差异进行优化。
   1. 将上清液的剩余部分转移到 1.5 mL 管（每口井）。以 1，000 x g离心 10 分钟，以颗粒任何碎屑。将上清液转移到新的 1.5 mL 管中，并储存在 -80°C。通过酶连结免疫吸附测定（ELISA）分析上清液是否存在前激细胞因子（例如TNF-α，白细胞素6）。
9. 拆下粘合板密封件。使用 635 nm 的板读取器读取板的吸光度。吸气液和丢弃板。

结果

对聚合物涂层表面的清洁方法进行了测试，以确保涂层不会中断，这被视为水接触角度与未涂布玻璃盖玻片的变化（图2）。在70%乙醇中浸泡PMMA涂层显微镜滑片1小时，可去除PMMA涂层（图2，左侧面板），这可能是由于PMMA在80wt%乙醇¹³中的溶解性，因此仅使用30分钟的紫外线灭菌就清洗PMMA涂层表面。PMMA涂层的浓度以前已经优化

讨论

我们实验室的一个主要重点是对固体生物材料软组织植入物的宿主响应，特别是植入过程中发生的细胞损伤如何影响宿主响应。这里介绍的初步实验使用报告宏噬细胞细胞系和体外生成的DAMP包含细胞解酶，以研究细胞损伤（即从植入手术）释放的分子对生物材料的巨噬细胞反应的影响。纤维细胞解酶用于模拟由于生物材料放置而导致的细胞损伤和DamPs的释放。由于软组织中成纤维细胞的流行，以?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2)	Biolegend	121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor)	Invivogen	TLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US origin	InnovativeResearch	IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml	Mouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Fisher Scientific	14190250	No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research grade	Wisent	98150
LPS-EK	Invivogen	TLRL-EKLPS	Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblasts	ATCC	CRL-1658
Pam3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	Synthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-100ML
Plasmocin	Invivogen	ANT-MPP	Mycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cells	Invivogen	raw-sp	NF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061
TrypLE express enzyme (1X)	Fisher Scientific	12604021	animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
Zeocin	Invivogen	ANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6	Biolegend	B213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-α	Biolegend	B220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE)	Associates of Cape Cope Inc.	E0005-5	Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mL	Associates of Cape Cope Inc.	WP1001	Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assay	Fisher Scientific	PI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kit	Associates of Cape Cope Inc.	C1500-5	Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection medium	Invivogen	rep-qb2	Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrous	Sigma Aldrich	288306-1L
Ethyl alcohol anhydrous	Commercial Alcohols	P006EAAN	Sigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forceps	Fisher Scientific	16-100-113
Fluorinert FC-40 solvent	Sigma Aldrich	F9755-100ML	Fluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free)	Fisher Scientific	SH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA)	Sigma Aldrich	182230-25G
Sylgard 184 elastomer kit	Fisher Scientific	50822180
Teflon-AF (fPTFE)	Sigma Aldrich	469610-1G	Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate seals	Fisher Scientific	AB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene caps	Fisher Scientific	03-337-4
Clear PS 48-well plate	Fisher Scientific	08-772-52
Clear TCPS 96-well plate	Fisher Scientific	08-772-2C
Clear TCPS 48-well plate	Fisher Scientific	08-772-1C
Cover glasses, circles	Fisher Scientific	12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25	Fisher Scientific	10-126-10
sticky-Slide 8 Well	Ibidi	80828
Superfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150	Fisher Scientific	08-772-48