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Resumo

Este protocolo fornece aos pesquisadores um método rápido e indireto de medição de atividade de fator de transcrição NF-кB/AP-1 dependente de TLR em uma linha de células de macrófagos de urina em resposta a uma variedade de superfícies poliméricas e camadas de proteína adsorbed que modelam o microambiente de implante biomaterial.

Resumo

A resposta inflamatória persistente do hospedeiro a um biomaterial implantado, conhecido como reação do corpo estranho, é um desafio significativo no desenvolvimento e implementação de dispositivos biomédicos e construções de engenharia de tecidos. Macrófagos, uma célula imune inata, são os principais intervenientes na reação do corpo estranho, porque eles permanecem no local do implante para a vida do dispositivo, e são comumente estudados para obter uma compreensão desta resposta hospedeira prejudicial. Muitos pesquisadores de biomateriais mostraram que as camadas de proteína adsorbed em materiais implantados influenciam o comportamento do macrófago e, posteriormente, impactam a resposta do hospedeiro. Os métodos deste artigo descrevem um modelo in vitro usando camadas de proteína adsorbed contendo moléculas de danos celulares em superfícies biomateriais de polímeros para avaliar as respostas de macrófagos. Um ensaio celular de macrófago de repórter NF-кB/AP-1 e o ensaio colorimmmétrico de fosfatase colorimétrica foram usados como um método rápido para examinar indiretamente a atividade do fator de transcrição NF-кB/AP-1 em resposta a camadas complexas de proteína adsorense contendo proteínas do sangue e padrões moleculares associados a danos, como um modelo das complexas camadas de proteína adsorbed formadas em superfícies biomateriais in vivo.

Introdução

A reação do corpo estranho (FBR) é uma resposta crônica do hospedeiro que pode impactar negativamente o desempenho de um material ou dispositivo implantado (por exemplo, dispositivos de entrega de medicamentos, biossensores), através da liberação persistente de mediadores inflamatórios e impedindo a integração entre o material implantado e o tecido circundante1. Esta resposta imune inata é iniciada pelo procedimento de implantação e é caracterizada pela presença a longo prazo de células imunes inatas e formação de cápsulas fibrosas em torno do implante1. No contexto das respostas materiais do hospedeiro, as interações macrofago-material têm um impacto significativo na progressão da resposta e desenvolvimento do hospedeiro de um FBR1. Macrófagos são uma população de células imunes inatas diversas, recrutadas para o local do implante, seja a partir de populações de macrófagos residentes em tecidos ou do sangue como macrófagos derivados de monócito. Eles começam a se acumular no local do implante logo após a implantação, e dentro de dias se tornam a população celular predominante no microambiente de implante. Macrófagos adeptos de materiais, juntamente com células gigantes de corpo estranho (FBGC) formadas através da fusão de macrófagos, podem persistir na superfície material para a vida útil do implante2,3. Consequentemente, os macrófagos são considerados atores-chave na resposta do corpo estranho devido a seus papéis orquestrando os passos característicos do FBR: resposta inflamatória aguda, remodelação do tecido e formação do tecido fibrótico1.

Receptores semelhantes a pedágios (TLRs) são uma família de receptores de reconhecimento de padrões que são expressos por muitas células imunes, incluindo macrófagos, e têm sido mostrados para desempenhar um papel significativo na inflamação e cicatrização de feridas. Além de ligantes derivados de patógenos, As TLRs são capazes de ligar moléculas endógenas, conhecidas como padrões moleculares associados a danos (DAMPs), que são liberados durante a necrose celular e ativam vias de sinalização inflamatória, resultando na produção de citocinas proinflamatórias4. Nós e outros propusemos que os danos causados durante os procedimentos de implantação de biomateriais de tecidos moles liberam DAMPs, que então adsorb para superfícies biomateriais, além de proteínas do sangue e modulam interações celulares subsequentes5,6. Quando os macrófagos interagem com a camada de proteína adsorbed em um implante, seus TLRs de superfície podem reconhecer DAMPs adsorbed e ativar cascatas de sinalização do proInflammatory, conduzindo à ativação e à produção do fator da transcrição nF-κB e do AP-1 de citocinas. Nós mostramos previamente que os macrófagos do murine aumentaram significativamente a atividade nf-κB/AP-1 e o fator α da necrose do tumor (TNF-α, secreção de citocina proinflamatória) em resposta às camadas de proteína adsorbed contendo DAMP em uma variedade de superfícies poliméricas em comparação com superfícies apenas com soro ou plasma adsorbed (ou seja, nenhum DAMPs presente), e que esta resposta é amplamente mediada pelo TLR2, enquanto o TLR4 desempenha um papel menor5.

A linha celular de macrófagos nf-κB/AP-1 repórter(Tabela de Materiais)utilizada neste protocolo é um método conveniente para medir a atividade relativa nf-κb e AP-1 em macrófagos5,7,8. Em combinação com inibidores da via TLR, esta linha celular é uma ferramenta útil para investigar a ativação do TLR e seu papel na inflamação em resposta a uma variedade de estímulos5,7,8. As células repórter são uma linha de células modificada semelhante a macrófago de camundongos que pode produzir facadamente a fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) sobre a ativação do fator de transcrição NF-κB e AP-19. O ensaio colorimmmático de fósforo alcalino enzimático(Tabela de Materiais)pode então ser usado para quantificar quantidades relativas de expressão SEAP como uma medida indireta da atividade NF-κB/AP-1. Como NF-κB e AP-1 estão a jusante de muitas vias de sinalização celular, neutralizar anticorpos e inibidores visando TLRs específicos (por exemplo, TLR2) ou moléculas de adaptador TLR (por exemplo, MyD88) podem ser usadas para verificar o papel de uma via específica. A metodologia descrita neste artigo fornece uma abordagem simples e rápida para avaliar a contribuição da sinalização tlr em respostas de macrófagos de urina para uma variedade de superfícies poliméricas com camadas de proteína adsorbed contendo proteínas do sangue e DAMPs como um modelo in vitro de biomateriais implantados.

Protocolo

1. Preparação de mídia e reagente

  1. Prepare a mídia de fibroblasto. Combine 450 mL do meio modificado eagle (DMEM) de Dulbecco, 50 mL de soro bovino fetal (FBS) e 5 mL de penicilina/estreptomicina. Guarde a 4°C por até 3 meses.
  2. Prepare a mídia de crescimento de macrófagos de repórter em alíquotas de 50 mL. Combine 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS, 5 μg/mL reagente de eliminação mycoplasma(Tabela de Materiais),e 200 μg/mL phleomycin D1 (Tabela de Materiais). Guarde a 4°C por até 3 meses.
  3. Prepare a mídia de talofagem de macrófagos de repórter em alíquotas de 50 mL. Combine 45 mL de DMEM, 5 mL de calor inativado FBS (HI-FBS), 5 μg/mL reagente de eliminação mycoplasma e 200 μg/mL phleomycin D1. Guarde a 4°C por até 3 meses.

2. Superfícies da cultura da pilha de revestimento com poli (methacrylate do methyl)

  1. Dissolva poli (metilme metacrilato) (PMMA) em clorofórmio a 20 mg/mL (por exemplo, 100 mg de PMMA em 5 mL de clorofórmio) em um frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Coloque uma barra de agitação magnética no frasco e deixe mexer por pelo menos 2 h, até que todos os sólidos sejam dissolvidos.
    CUIDADO: Clorofórmio é prejudicial se inalado. Certifique-se de usar solvente em um capô de fumaça enquanto estiver usando luvas PVA.
  2. Pipette 400 μL da solução PMMA no centro de um microscópio de vidro borosilicato desliza em um coater de rotação, e gire a 3000 rpm por 2 min. Prepare o número de slides necessários para o ensaio, bem como 3-5 extra para medição de ângulo de contato com a água. Armazenar slides em uma caixa limpa (pulverizado e limpo com 70% de etanol) para uso futuro.
    Nota: O revestimento da rotação é usado frequentemente para depositar um revestimento fino, uniforme em uma superfície lisa. Um coater da rotação gira um substrato em altas velocidades, usando a força centrífuga para espalhar a solução de revestimento sobre a superfície.
    1. Medir o ângulo de contato de água em duas posições aleatórias na superfície de slides revestidos extras (ou seja, não os slides que estão sendo usados para a cultura celular) com um goniômetro para garantir que a superfície de vidro fosse completamente revestida com o polímero.
      Nota: Somente a água da pureza a mais elevada (por exemplo, vidro destilado triplo) deve ser usada para medidas do ângulo do contato da água.
  3. Em um armário de segurança biológica (BSC) anexar 8 câmaras de poços pegajosos para PMMA revestido-slides usando fórceps estéreis e seguindo a técnica asséptica. Pressione firmemente na parte superior dos poços pegajosos para certificar-se que são unidos fortemente. Incubar os slides com poços pegajosos anexados a 37 °C durante a noite para proteger o selo.
    1. Teste o selo dos poços pegajosos adicionando 200 μL de água de nível de cultura celular (livre de endotoxina) a cada poço. Incubar à temperatura ambiente (RT) por 60 min e garantir nenhum vazamento antes de prosseguir. Assaa a água, tomando cuidado para não perturbar o revestimento PMMA.
  4. Executar lavhes de água livre de endotoxina, adicionando 300 μL de água livre de endotoxina para cada poço e incubação por 1 h (três vezes), 12 h e 24 h antes de usar para remover qualquer solvente restante.
  5. Teste a concentração de endotoxinas dos slides para ser usado para a cultura celular. Incubar 200 μL de água reagente livre de endotoxina(Mesa de Materiais)em um poço de cada slide para 1 h. Medir a concentração de endotoxina no extrato usando um ensaio de endotoxina cromogênica de ponto final (Tabela de Materiais).
    Nota: O protocolo a seguir é específico para o kit de ensaio de endotoxina listado na Tabela de Materiais.
  6. Use apenas água e consumíveis (ou seja, pontas de pipetas, tubos de microcentrífuga e placas de poço) que são certificados sem pirógeno (ou seja, livre de endotoxina) para este trabalho. Além disso, qualquer vidro usado na preparação das superfícies revestidas de polímero deve ser depyrogenated usando esterilização de calor seco (250 °C para 30 minutos) antes de usar10. Medir a endotoxina na solução do extrato, como descrito aqui, pode conduzir a uma subestimação da endotoxina na superfície material11,12. Consequentemente, recomenda-se que, ao desenvolver um protocolo de revestimento de polímero, realize a reação do ensaio de endotoxina (ou seja, passos 2,5,4-2,5,6 para amostras de teste [água reagente] ou controles de pico) diretamente dentro de poços contendo a amostra revestida para garantir que nenhuma fonte de endotoxina seja inadvertidamente introduzida no sistema durante o processo de revestimento.
    1. Traga todas as amostras de teste (ou seja, extratos) e reagentes de ensaio de endotoxina para RT. Reconstituir reagente cromogênico no buffer de ensaios e padrão de endotoxina em água reagente, permitir dissolver por 5 min e girar suavemente antes de usar. Cubra todas as garrafas com filme de parafina quando não estiver em uso.
    2. Crie uma curva de diluição padrão de 5 a 8 pontos do padrão de endotoxina que varia do limite inferior ao superior do ensaio, realizando uma diluição serial do padrão de endotoxina na água reagente.
    3. Para controlar o aprimoramento ou inibição do ensaio de endotoxina em amostras de teste, prepare um controle positivo (também chamado de controle de pico ou amostra cravada) diluindo uma quantidade conhecida de endotoxina na solução de amostra de teste não utilizada.
      Nota: A concentração do controle positivo deve ser a mesma concentração que um padrão no meio da curva padrão. Se a quantidade recuperada do pico de endotoxina (ou seja, a concentração do controle positivo menos a concentração da amostra de teste não cravado) está dentro de 50-200% da concentração nominal do pico de endotoxina, a solução de extração pode ser considerada não interferir significativamente com o ensaio.
    4. Adicione 50 μL de padrões, amostras ou controles de pico para cada poço de uma placa de 96 poços em duplicata ou triplicado. Use a água do reagente como um controle negativo.
    5. Adicione 50 μL de reagente cromogênico a cada poço. Adicione reagente rapidamente a todos os poços. Use um tempora para registrar a quantidade de tempo que leva para adicionar reagente a todos os poços. Cubra a placa com um selo adesivo e incubada a 37 °C (o tempo de incubação é dependente de lote e indicado no Certificado de Análise incluído no kit de reagente cromogênico). Alternativamente, verifique a placa a cada 15 min durante a incubação até que a mudança de cor seja observada em todos os poços padrão.
    6. Após a incubação, adicione 25 μL de 50% de ácido acético a cada poço (concentração final de 10% de ácido acético por poço) para parar a reação. Adicione o ácido acético na mesma ordem que o reagente cromogênico foi adicionado. Leia a absorção da placa usando um leitor de placa em 405 nm. Aspirar líquido e descartar placa.
      Nota: A adição de ácido acético deve levar o mesmo período de tempo para adicionar a cada poço como o reagente cromogênico levou (± 30 s).
  7. Ultravioleta (UV) esterilizar os slides para 30 minutos antes de experimentos de cultura celular.

3. Superfícies da cultura da pilha de revestimento com polydimethylsiloxane

  1. Misture o polidimetilsiloxano (PDMS) elastômero em uma relação de peso 10:1 (base:agente de cura). Em um armário de segurança biológica, pipeta de aproximadamente 10 mL de base polidimitilsiloxano em um tubo estéril. Pese o tubo e adicione lentamente o agente de cura até que 10% seja adicionado.
    CUIDADO: Use reagentes PDMS em uma área bem ventilada e evitar o contato visual usando óculos de segurança.
  2. Misture bem o elastômero mexendo com uma ponta de pipeta sorológica e por pipetting cima e para baixo. Adicione aproximadamente 200 μL da solução a cada poço de uma placa de 48 poços. Incline a placa do poço lentamente para assegurar a cobertura completa dos poços com solução do elastômero.
  3. Coloque a placa de poço com elastômero em um forno a vácuo fixado em 50 cmHg, 40 °C. Retire a tampa e cubra com uma limpeza única dobra para evitar que outros detritos caiam nos poços. Deixe incubar por pelo menos 48 h.
    1. Confirme que os poços estão completamente revestidos por inspeção visual. Certifique-se de que o elastômero é totalmente curado por cutucar suavemente com uma ponta de pipeta estéril antes de remover.
  4. Adicione 300 μL de 70% de etanol (feito com etanol absoluto e água livre de endotoxina) e incubada na RT por 1 h. Retire o etanol e execute laves de água livres de endotoxina adicionando 300 μL de água livre de endotoxina a cada poço e incubando por 1 h (três vezes), 12 h , e 24 h antes de usar para remover qualquer solvente restante.
    1. Incubar 200 μL de água livre de endotoxina em três poços de cada placa para 1 h. Medir a concentração de endotoxina dos extratos de água usando um ensaio de endotoxina cromogênica de ponto final (passos 2,5,1-2,5,6).

4. Superfícies da cultura da pilha de revestimento com poli fluorado (tetrafluoroetileno)

  1. Faça uma solução de 1 mg/mL de poli fluorado (tetrafluoroetileno) (fPTFE) (por exemplo, adicione 10 mg de fPTFE a 10 mL de solvente fluorado [Tabela de Materiais])em um frasco de cintilação de vidro de 20 mL. Coloque uma barra de agitação magnética no frasco e deixe mexer por pelo menos 24 h, até que todos os sólidos sejam dissolvidos.
  2. Adicione aproximadamente 150 μL da solução do polímero a cada poço de uma placa do poliestireno 48-poço (isto é, não cultura do tecido tratada). Incline a placa do poço lentamente para assegurar a cobertura completa de todos os poços com solução do polímero. Substitua a tampa.
    1. Para garantir o revestimento eficaz de poços fPTFE, os lábios de vidro devem ser revestidos em fPTFE e usados para medição do ângulo de contato com a água (passo 4.3.1). Coloque os lábios de cobertura dentro dos poços de uma placa de 24 poços. Adicione aproximadamente 400 μL da solução do polímero a cada poço que contem um coverslip. Empurre os lábios para baixo usando fórceps estéreis, garantindo que eles estão completamente cobertos de solução de polímero, e cubra a placa de poço com uma tampa.
  3. Coloque a placa de poço com solução de polímero e/ ou coverslips em um forno a vácuo fixado em 50 cmHg, 40 °C. Retire a tampa e cubra com uma limpeza única dobra para evitar que outros detritos caiam nos poços. Deixe incubar por pelo menos 48 h.
    1. Medir o ângulo de contato de água de cobres revestidos de fPTFE com um goniômetro para garantir revestimento eficaz.
      Nota: Somente a água da pureza a mais elevada (por exemplo, vidro destilado triplo) deve ser usada para medidas do ângulo do contato da água.
  4. Adicione 300 μL de 70% de etanol (feito com etanol absoluto e água livre de endotoxina) e incubada na RT por 1 h. Retire o etanol e execute laves de água livres de endotoxina adicionando 300 μL de água livre de endotoxina a cada poço e incubando por 1 h (três vezes), 12 h , e 24 h antes de usar para remover qualquer solvente restante.
    1. Incubar 200 μL de água livre de endotoxina em três poços de cada placa para 1 h. Medir a concentração de endotoxina de extratos de água usando um ensaio de endotoxina cromogênica de ponto final (passos 2,5,1-2,5,6).
  5. UV esterilizar as placas de poço para 30 minutos antes de experimentos de cultura celular.

5. Fazendo lysate a partir de células 3T3

  1. Crescer células 3T3 em vários frascos T150 para 70% de confluência. Para separar as células, aspirate mídia, lavar a superfície com 5 mL de PBS, e aspirar PBS. Adicione 5 mL de enzima de dissociação de células recombinantes e sem origem animal(Tabela de Materiais)e incubada a 37 °C por 3 a 5 min.
  2. Desaque as células inclinando suavemente o frasco para frente e para trás. Adicione 5 mL de PBS para neutralizar a enzima recombinante usada para dissociação celular. Transfira as células destacadas dos frascos em um tubo de centrífuga e misture através de pipetting. Executar uma contagem de células vivas usando um hemocytometer e tinuosidade de viabilidade celular.
    Nota: Uma enzima de dissociação celular que pode ser neutralizada através da diluição na PBS foi selecionada para evitar a introdução de proteínas à base de soro na preparação de lisato. Se a trippsina é usada para dissociar as células, ela deve ser neutralizada com uma solução contendo soro, e uma lavagem pbs adicional deve ser realizada para reduzir a quantidade de proteínas séricatransportadas para a preparação de lisato.
  3. Centrífugas as células a 200 x g por 5 min. Aspirar as células supernatant e resuspender em volume original (ou seja, 10 mL x número de frascos) de PBS para lavar qualquer mídia restante. Repetir.
  4. Centrífugaas as células novamente a 200 x g por 5 min e aspiram o supernatant. Adicione o volume de PBS necessário para alcançar uma concentração final de células de 1 x 106 células/mL. Coloque a solução celular em um freezer -80 °C até que a amostra esteja totalmente congelada (pelo menos 2 h).
  5. Descongele a solução celular em um banho de água de 37 °C. Uma vez completamente descongelado, coloque a solução de volta para o congelador -80 °C até totalmente congelado. Repita para um total de 3 ciclos de congelamento-degelo.
  6. Realize um micro ácido bicinchoninic (BCA) ensaio no lysate da pilha em uma variedade de diluições (por exemplo, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) para determinar a concentração da proteína. Diluir o lisato celular a uma concentração de proteína de 468,75 μg/mL, alíquota e armazenar a -80 °C para uso futuro.
    Nota: A concentração final de proteína em uma placa de 48 poços é de 125 μg/cm2 (com base na área de superfície de um poço, 0,75 cm2).
  7. Realize uma mancha ocidental para avaliar a presença de DAMPs em lisato (por exemplo, proteína de choque térmico 60 [HSP60], caixa de grupo de alta mobilidade 1 [HMGB1]) carregando 40-60 μg de proteína de lisato no buffer de carga em um gel de poliacrilamida de 1,5 mm de espessura e siga a mancha ocidental padrão e siga a mancha ocidental padrão Procedimentos.

6. Avaliando o efeito das camadas de proteína adsorbed e receptores semelhantes a pedágio na atividade nf-κb de macrófagos

Nota: Para um esquema do fluxo de trabalho experimental e do layout da placa, consulte a Figura 1A e a Figura Suplementar 1,respectivamente.

  1. Crescer macrófagos repórter em um frasco de tamanho adequado para 70% de confluência. Mídia aspirate, lavar a superfície com PBS, e pirata PBS. Adicione a enzima de dissociação celular recombinante e incubar a 37 °C por 8 min.
  2. Separar as células batendo firmemente os lados do frasco. Inativar a enzima de dissociação de células recombinante, adicionando um volume igual de mídia de crescimento (contendo 10% FBS). Executar uma contagem de células vivas usando um hemocytometer e tinuosidade de viabilidade celular.
    Nota: A viabilidade esperada para os macrófagos do repórter que seguem uma incubação de 8 min na enzima da dissociação da pilha é 90%.
  3. Células centrífugas a 200 x g por 5 min. Aspirate supernatant e resuspender no volume original de PBS para lavar as células. Centrífuga novamente e resuspender as células em 7,3 x 105 células / mL em meios de ensaio (contendo calor inativado FBS).
  4. Suspensão celular separada em 3 tubos diferentes: inibidor de TLR4, anti-TLR2 e não tratada. Incubate células com 1 μg/mL Inibidor TLR4 para 60 min em RT ou com 50 μg/mL anti-TLR2 por 30 min na RT.
  5. Adicione 200 μL de lysate, 10% FBS, 10% de plasma comercial do rato(Tabela de Materiais), ou uma mistura das soluções proteicas a uma placa de 48 poços (ou equivalente) e permita que a proteína adsorb a 37 °C para a quantidade desejada de tempo (ou seja, 30 min, 60 min, ou 24 h). Soluções de proteína Aspirate de poços, usando uma pipeta Pasteur fresca para cada solução de proteína, e lavasuperfícies com 250 μL de PBS por 5 min. Aspirate PBS. Repita para um total de 3 laves.
    Nota: Esta etapa pode precisar de ser começada mais cedo no protocolo dependendo do tempo desejado do adsorption. Ajuste o protocolo em conformidade.
  6. Após o período de incubação com o inibidor tlr4 ou anti-TLR2, células pipetas para resuspender. Adicione 200 μL de solução celular para cada poço.
  7. Para a condição de controle positivo tlr2, adicione Pam3CSK4 a uma concentração final de 150 ng/mL. Para a condição de controle positivo TLR4, adicione o lipopolissacarídeo (LPS) a uma concentração final de 1,5 μg/mL. Incubar células a 37 °C por 20 h.
  8. Experimente 20 μL de supernatant de cada poço e placa em duplicata em uma placa de 96 poços. Inclua três poços de 20 μL ensaio mídia como um controle de fundo. Adicione 200 μL de repórter SEAP ensaio reagente para cada poço. Cubra a placa com um selo adesivo e incubar por 2,5 h a 37 °C.
    Nota: O tempo de incubação pode variar dependendo das condições experimentais, e deve ser otimizado para uma forte diferença na absorção entre poços de controle positivos e negativos.
    1. Transfira o restante do supernatant a um tubo de 1.5 mL (por o poço). Centrífuga a 1.000 x g por 10 min para pelota quaisquer detritos. Transfira o supernatant a um tubo novo de 1.5 mL e armazene -80 °C. Analise o supernatant para a presença de citocinas proinflamatórias (por exemplo, TNF-α, interleucina 6) através de ensaio imunosorvente ligado a enzimas (ELISA).
  9. Retire o selo da placa adesiva. Leia a absorção da placa usando um leitor de placa em 635 nm. Aspirar líquido e descartar placa.

Resultados

Os métodos de limpeza para as superfícies revestidas de polímero foram testados para garantir que não houvesse interrupção do revestimento, o que seria visto como uma mudança no ângulo de contato com a água para um coverslip de vidro não revestido (Figura 2). Foram encontrados slides de microscópio revestidos de PMMA em 70% de etanol por 1 h para remover o revestimento PMMA(Figura 2,painel esquerdo), provavelmente devido à solubilidade do PMMA em 80 ...

Discussão

Um foco principal do nosso laboratório é a resposta do hospedeiro a implantes sólidos de tecidos moles biomateriais e, em particular, como os danos celulares sofridos durante o procedimento de implantação afetam a resposta do hospedeiro. O trabalho apresentado aqui descreve experimentos preliminares usando uma linha de células de macrófago repórter e lysate celular contendo DAMP in vitro, para investigar a influência das moléculas liberadas durante danos celulares (ou seja, da cirurgia de implante) nas resposta...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem com gratidão o financiamento operacional do Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), do Queen's University Senate Advisory Research Committee e do apoio à infraestrutura do Canadian Foundation for Innovation John Evan's Leadership Fund (Project 34137) e do Ministry of Research and Innovation Ontario Research Fund (Project 34137). L.A.M. foi apoiada por um Queen's University R. Samuel McLaughlin Fellowship, um Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Canadian Graduate Scholarship Master's Award e uma Bolsa de Pós-Graduação de Ontário. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Myron Szewczuk por seu generoso dom da linha de células de macfagagem repórter NF-κB/AP-1 e drs. Michael Blennerhassett e Sandra Lourenssen pelo uso de seu sistema de imagem gel e leitor de placas.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2)Biolegend121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor)InvivogenTLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US originInnovativeResearchIGMSC57-K2 EDTA-Compl-10mlMouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Sigma AldrichD6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Fisher Scientific14190250No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research gradeWisent98150
LPS-EKInvivogenTLRL-EKLPSLipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblastsATCCCRL-1658
Pam3CSK4Invivogentlrl-pmsSynthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycinSigma AldrichP4333-100ML
PlasmocinInvivogenANT-MPPMycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cellsInvivogenraw-spNF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061
TrypLE express enzyme (1X)Fisher Scientific12604021animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
ZeocinInvivogenANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6BiolegendB213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-αBiolegendB220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE)Associates of Cape Cope Inc.E0005-5Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mLAssociates of Cape Cope Inc.WP1001Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assayFisher ScientificPI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kitAssociates of Cape Cope Inc.C1500-5Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection mediumInvivogenrep-qb2Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrousSigma Aldrich288306-1L
Ethyl alcohol anhydrousCommercial AlcoholsP006EAANSigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forcepsFisher Scientific16-100-113
Fluorinert FC-40 solventSigma AldrichF9755-100MLFluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free)Fisher ScientificSH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA)Sigma Aldrich182230-25G
Sylgard 184 elastomer kitFisher Scientific50822180
Teflon-AF (fPTFE)Sigma Aldrich469610-1GPoly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate sealsFisher ScientificAB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mLFisher Scientific14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene capsFisher Scientific03-337-4
Clear PS 48-well plateFisher Scientific08-772-52
Clear TCPS 96-well plateFisher Scientific08-772-2C
Clear TCPS 48-well plateFisher Scientific08-772-1C
Cover glasses, circlesFisher Scientific12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25Fisher Scientific10-126-10
sticky-Slide 8 WellIbidi80828
Superfrost microscope slidesFisher Scientific12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150Fisher Scientific08-772-48

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