Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק לחוקרים עם שיטה מהירה, עקיפה של מדידת tlr תלויי-NF-кb/AP-1 הפעילות שעתוק בשורה מקרופאג cell מורה בתגובה למגוון של משטחים פולימריים ושכבות חלבון נספחת כי המודל ביומיהמיקרוסביבה השתל ביומטריה.

Abstract

התגובה מארח דלקתי מתמשך ביוביוחומר מושתל, המכונה תגובת גוף זר, הוא אתגר משמעותי בפיתוח ויישום של מכשירים ביו ומבנים הנדסת רקמות. מקרופאגים, תא חיסונית מולדת, הם שחקני מפתח בתגובת הגוף הזר משום שהם נשארים באתר השתל למשך החיים של המכשיר, והוא למדו בדרך כלל כדי להשיג הבנה של תגובה זו מארח מזיקה. חוקרים רבים ביואטיליים הראו כי שכבות חלבון נספחת על חומרים מושתלים להשפיע על התנהגות מקרופאג, ולאחר מכן להשפיע על התגובה המארחת. השיטות במאמר זה מתארים מודל בלתי מתורבת באמצעות שכבות חלבון נספחת המכילים נזק תאי מולקולות על משטחי פולימר משטחים כדי להעריך תגובות מקרופאג. NF-кb/AP-1 עיתונאי מקרופאג קו התא ואת העיבוד המקושר באופן אלקליין פוספספטאז משמש כשיטה מהירה כדי לבחון בעקיפין NF-кb/AP-1 פעילות שעתוק בתגובה לשכבות חלבון מורכבות נספחת המכילים חלבונים בדם הקשורים לנזק דפוסי מולקולרי, כמודל של שכבות החלבון המורכבות הנוצרות על משטחי ביומטריה בvivo.

Introduction

תגובת הגוף הזר (FBR) היא תגובת מארח כרונית שיכולה להשפיע לרעה על הביצועים של חומר או מכשיר מושתל (למשל, התקני משלוחים לסמים, ביוחיישנים), באמצעות שחרור מתמשך של מגשרים דלקתיים ובאמצעות השתלבות בשילוב בין החומר המושתל לבין הרקמה הסובבת1. זה התגובה החיסונית מולדת היא ביוזמת הליך ההשתלה מאופיין על ידי נוכחות ארוכת טווח של תאים חיסוניים מולדים היווצרות קפסולה סיבי סביב השתל1. בהקשר של תגובות מארח חומרים, לאינטראקציות חומרים מקרופאג יש השפעה משמעותית על ההתקדמות של התגובה המארחת ופיתוח של FBR1. מקרופאגים הם האוכלוסייה החיסונית מגוונת מולדים המערכת, גויס לאתר השתל או מתוך רקמות תושב האוכלוסייה מקרופאג או מהדם כמו מקרוציט הנגזרים מונופאגים. הם מתחילים להצטבר באתר השתל זמן קצר לאחר השרשה, ובתוך ימים להפוך לאוכלוסיית התא השולט במיקרו הסביבה השתל. חומר-מקרופאגים, יחד עם הגוף הזר תאים ענקיים (fbgc) נוצר באמצעות מקרופאג fusion, יכול להתמיד במשטח החומר למשך החיים של השתל2,3. כתוצאה מכך, מקרופאגים נחשבים לשחקנים מרכזיים בתגובה לגוף הזר בשל תפקידם מנצח את השלבים האופייניים של FBR: תגובה דלקתית חריפה, שיפוץ רקמות, היווצרות של רקמת פיברוטיק1.

קולטני שיחת כמו (TLRs) הם משפחה של קולטני זיהוי תבנית אשר מבוטאים על ידי תאים חיסוניים רבים, כולל מקרופאגים, והוכחו לשחק תפקיד משמעותי דלקת וריפוי הפצע. בנוסף לליגני הפתוגן, TLRs מסוגלים לאגד מולקולות אנדודוגני, הידועות כתבניות מולקולריות הקשורות נזק (DAMPs), אשר פורסמו במהלך נמק בתא ולהפעיל מסלולים איתות דלקתיות וכתוצאה מכך ייצור ציטוקינים proinflammatory4. אנחנו ואחרים הציעו כי הנזק שנגרם במהלך בדיקת רקמה רכה השתלת שחרור damps, אשר לאחר מכן ספוח כדי ביומטריה בנוסף לחלבונים בדם ולווסת את האינטראקציות חומרים סלולריים הבאים5,6. כאשר מקרופאגים אינטראקציה עם שכבת החלבון נספחת על השתל, משטח שלהם tlrs עשוי לזהות נספחת damps ולהפעיל מפלי איתות proinflammatory, המוביל NF-κB ו AP-1 שעתוק גורם ההפעלה והייצור של ציטוקינים proinflammatory. בעבר הצגנו כי מקרופאגים murine הגדילו באופן משמעותי NF-κB/AP-1 פעילות נמק גורם הגידול α (tnf-α, הפרשת cy, ציטומין) בתגובה לח-המכיל שכבות חלבון נספחת על מגוון של משטחים פולימריים לעומת משטחים עם סרום נספחת או פלזמה בלבד (כלומר, אין damps נוכח), וכי תגובה זו מתווכת במידה רבה על ידי TLR2, בעוד TLR4 משחק תפקיד פחותה5.

הכתב NF-κB/AP-1 מקרופאג line (הטבלה של חומרים) המשמשים בפרוטוקול זה היא שיטה נוחה למדוד יחסי NF-κB ו-AP 1 פעילות ב מקרופאגים5,7,8. בשילוב עם מעכבי מסלול tlr, קו תא זה הוא כלי שימושי עבור חקירת ההפעלה tlr ואת תפקידה בדלקת בתגובה למגוון גירויים5,7,8. התאים עיתונאי הם העכבר שונה מקרופאג כמו קו תא זה יכול לייצר באופן בלתי נשכח פוספספטאז אלקליין עובריים (SEAP) על NF-κB ו-AP-1 הפעלת שעתוק מקדם9. לאחר מכן ניתן להשתמש במיטרי הצביעה האלקליין מסוג פוספספטאז (טבלת חומרים) כדי לכמת כמויות יחסיות של ביטוי seap כאמצעי עקיף של הפעילות NF-ΚB/AP-1. כמו NF-κB ו-AP-1 נמצאים במורד הזרם של מסלולים רבים של איתות תאים, נטרול נוגדנים ומעכבי המיקוד TLRs ספציפיים (למשל, TLR2) או מולקולות TLRS (g., MyD88) ניתן להשתמש כדי לאמת את התפקיד של מסלול מסוים. המתודולוגיה המתוארת במאמר זה מספקת גישה פשוטה ומהירה להערכת התרומה של ה-tlr איתות בתגובות מקרופאג murine למגוון של משטחים פולימריים עם שכבות חלבון נספחת המכילים הן חלבונים בדם ו-damps כמו מודל מבחנה של בדיקות מושתלים מושתל.

Protocol

1. הכנה לתקשורת ומגיב

  1. . הכן מדיה בפיברובלסט שילוב 450 mL של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 50 mL של סרום של שור עוברי (FBS), ו-5 מ ל של פניצילין/סטרפטומיצין. החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.
  2. הכינו כתבת מקרופאג מדיית גדילה ב50 mL. שילוב 45 mL של DMEM, 5 מ ל של FBS, 5 μg/mL mycoplasma אלימינציה מגיב (טבלת חומרים), ו 200 μg/Ml phleomycin D1 (טבלת חומרים). החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.
  3. הכינו כתבת מקרופאג מדיה ב50 mL. שילוב 45 mL של DMEM, 5 מ ל של חום מופעל FBS (HI-FBS), 5 μg/mL mycoplasma אלימינציה מגיב, ו 200 μg/mL phleomycin D1. החנות ב -4 ° c עד שלושה חודשים.

2. ציפוי תאים משטחי תרבות עם פולי (מתיל מתיונין)

  1. התמוססות (PMMA) ב כלורופורם ב 20 מ"ג/mL (למשל, 100 מ"ג של PMMA ב 5 מ ל של כלורופורם) ב 20 mL זכוכית בקבוקון. מניחים פס מגנטי המהומה במבחנה ולאפשר לערבב לפחות 2 h, עד כל מוצקים מומס.
    זהירות: הכלורופורם מזיק אם נשאף. הקפידו להשתמש בממיסים בתוך מכסה המנוע בזמן שלובשים כפפות PVA.
  2. פיפטה 400 μL של פתרון PMMA למרכז של מיקרוסקופ זכוכית בורוסיליקט בתוך מרובע ספין, ו ספין ב 3000 rpm עבור 2 דקות. הכינו את מספר השקופיות הנדרשות לצורך שיטת החישוב, וכן 3-5 נוספים עבור מדידת זווית המגע של המים. אחסן שקופיות בתיבה נקייה (מרוסס ונמחקה עם 70% אתנול) לשימוש עתידי.
    הערה: ציפוי ספין משמש לעתים קרובות כדי להפקיד ציפוי דק, אחיד על משטח שטוח. מסתובב מסובב מצע במהירויות גבוהות, תוך שימוש בכוח צנטריפוגלי כדי להפיץ את פתרון הציפוי על פני השטח.
    1. מדידת המים זווית המגע בשתי תנוחות אקראיות על פני השטח של שקופיות מצופה נוספת (כלומר, לא את השקופיות בשימוש עבור תרבות התא) עם מד זווית כדי להבטיח משטח זכוכית היה מצופה לחלוטין עם פולימר.
      הערה: יש להשתמש רק במים של הטוהר הגבוה ביותר (למשל, זכוכית מזוקקים משולשת) עבור מדידות זווית מגע המים.
  3. ב הקבינט בטיחות ביולוגית (תואר ראשון) לצרף 8-בארות דביק בבית pmma מצופה שקופיות באמצעות מלקחיים סטרילי ובעקבות טכניקה אספטי. לחץ בחוזקה על החלק העליון של הבארות הדביקות כדי לוודא שהם מחוברים בחוזקה. מודיית את השקופיות עם בארות דביק מחוברים ב 37 ° c לילה כדי לאבטח את החותם.
    1. בדוק את החותם של הבארות דביק על ידי הוספת 200 μL של תרבות התא כיתה (אנדוטוקסין-ללא) מים לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 60 דקות ולהבטיח שאין דליפה לפני שתמשיך. היזהרו מהמים, להיזהר לא להפריע ציפוי PMMA.
  4. בצע שטיפת מים אנדוטוקסין בחינם על ידי הוספת 300 μL של מים אנדוטוקסין-חינם לכל טוב, המארג עבור 1 h (שלוש פעמים), 12 h, ו 24 שעות לפני השימוש כדי להסיר את כל הממס הנותר.
  5. מבחן ריכוז אנדוטוקסין של השקופיות כדי לשמש לתרבות התא. מודריטה 200 μL של מים לתגובה אנדוטוקסין ללא הפרעה (טבלת חומרים) בבאר אחת של כל שקופית במשך 1 h. מדידת ריכוז האנדוטוקסין בתמצית באמצעות שיטת האנדוטוקסין של נקודת הקצה (טבלת חומרים).
    הערה: הפרוטוקול הבא הוא ספציפי לערכת שיטת המערכת האנדוטוקסין המופיעה בטבלת החומרים.
  6. השתמש רק במים ומתכלים (כלומר, הפיפטה טיפים, צינורות מיקרוצנטריפוגה וצלחות באר) כי הם מוסמכים pyrogen-free (כלומר, אנדוטוקסין ללא תשלום) עבור עבודה זו. כמו כן, כל כלי זכוכית המשמשים להכנת משטחים מצופים פולימר צריך להיות depyrogenated באמצעות חום יבש עיקור (250 ° צ' צלזיוס עבור 30 דקות) לפני השימוש10. מדידה אנדוטוקסין בתמיסה לחלץ, כפי שמתואר כאן, יכול לגרום הערכה של אנדוטוקסין על פני השטח חומר11,12. כתוצאה מכך, מומלץ לפתח פרוטוקול לציפוי פולימרי, לבצע את תגובת השיטה האנדוטוקסין (כלומר, צעדים 2.5.4-2.5.6 לדגימות ניסוי [מגיב מים] או שולטת ספייק) ישירות בתוך בארות המכילות את המדגם המצופה כדי להבטיח שאין מקורות של אנדוטוקסין שהוכנסו למערכת בשוגג במהלך תהליך הציפוי.
    1. הביאו את כל דגימות הבדיקה (כלומר, תמציות) ושיטת האנדוטוקסין ריאגנטים ל-RT. מהווים מגיב כרומוגניים במאגר שיטות ובתקן אנדוטוקסין במים מגיב, מאפשרים התמוססות עבור 5 דקות ומערבולת בעדינות לפני השימוש. לכסות את כל הבקבוקים עם סרט פרפין כאשר לא בשימוש.
    2. צור 5-8 בנקודת הדילול של התקן של תקן אנדוטוקסין, החל מלמטה ועד הגבול העליון של היריעה על-ידי ביצוע דילול סדרתי של תקן האנדוטוקסין במים מגיב.
    3. כדי לשלוט על שיפור או עיכוב של שיטת האנדוטוקסין בדגימות הבדיקה, להכין שליטה חיובית (נקרא גם בקרת ספייק או מדגם מחודדים) על ידי דילול כמות ידועה של אנדוטוקסין בפתרון בדיקה שאינו בשימוש במדגם.
      הערה: ריכוז השליטה החיובית צריך להיות אותו הריכוז של תקן באמצע העקומה הסטנדרטית. אם הכמות המשוחזרת של היתד האנדוטוקסין (כלומר, ריכוז השליטה החיובית מינוס הריכוז של דגימת הבדיקה הבלתי מחודדים) היא בטווח של 50-200% מהריכוז הנומינלי של היתד האנדוטוקסין, ניתן להתייחס לפתרון החילוץ באופן בלתי משמעותי לבעיה.
    4. הוסף 50 μL של תקנים, דגימות, או שולטת ספייק לכל טוב של צלחת 96-באר בשכפול או בטרילקאט. השתמש במים מגיב כפקד שלילי.
    5. הוסף 50 μL של מגיב כרומוגניים לכל טוב. הוסף מגיב במהירות לכל הבארות. השתמש בשעון עצר כדי לתעד את משך הזמן הדרוש להוספת מגיב לכל הבארות. מכסים את הצלחת עם חותם דביק ו הדגירה ב 37 ° צ' (זמן הדגירה הוא הרבה תלוי ומצוין על תעודת הניתוח כלול בערכה הכימית כרומוגניים). לחילופין, לבדוק את הצלחת כל 15 דקות במהלך הדגירה עד שינוי הצבע הוא נצפתה בכל הבארות רגיל.
    6. לאחר הדגירה, להוסיף 25 μL של 50% חומצה אצטית לכל טוב (הריכוז הסופי של 10% חומצה אצטית לכל טוב) כדי לעצור את התגובה. הוסף חומצה אצטית באותו סדר כמו הוסיף הכימית הרומוגניים. לקרוא ספיגת הצלחת באמצעות קורא צלחת ב 405 ננומטר. מנושף נוזלים ולהשליך לוחית.
      הערה: חומצה אצטית בתוספת צריך לקחת את אותו אורך הזמן כדי להוסיף כל טוב כמו מגיב כרומוגניים לקח (± 30 s).
  7. אולטרה סגול (UV) לעקר את השקופיות עבור 30 דקות לפני ניסויים בתרבות התא.

3. ציפוי תאים משטחי התרבות עם פולימתיתיל סילאוקטן

  1. מערבבים polydiמתיל siloxane (PDMS) אלסטומר ביחס 10:1 משקל (בסיס: ריפוי סוכן). בארון בטיחות ביולוגי, פיפטה כ -10 מ ל. בסיס פולידימתיל לצינור סטרילי שקול את השפופרת והוסף באיטיות את סוכן הריפוי עד להוספת 10%.
    זהירות: השתמש ריאגנטים PDMS באזור מאוורר היטב ולהימנע קשר עין על ידי לבישת משקפי בטיחות.
  2. מערבבים ביסודיות את האלסטומר על-ידי ערבוב עם טיפ-פיאוולוגי סטרילי ומלטף למעלה ולמטה. הוסף כ 200 μL של הפתרון לכל טוב של צלחת 48-באר. להטות את צלחת הבאר לאט כדי להבטיח כיסוי מלא של בארות עם פתרון אלסטורר.
  3. מניחים את צלחת הבאר עם אלסטומר לתוך תנור ואקום להגדיר ב 50 cmHg, 40 ° c. הסר את המכסה ולכסות עם מחיקה בודדת רובד כדי למנוע פסולת אחרים ליפול לתוך הבארות. אפשר להדגירה לפחות 48 h.
    1. לאשר את הבארות מצופה לחלוטין באמצעות בדיקה חזותית. ודא שהאלסטואר נרפא לחלוטין על-ידי לימודיו בעדינות עם טיפ של פיפטה סטרילי לפני הסרתו.
  4. הוסף 300 μL של 70% אתנול (עשוי אתנול מוחלט מים אנטוקסין נטול) ו-דגירה ב-RT עבור 1 h. הסר את אתנול ולבצע שטיפת מים אנדוטוקסין בחינם על ידי הוספת 300 μL של מים אנטוקסין-ללא שימוש לכל טוב והדגירה עבור 1 h (שלוש פעמים), 12 שעות ו-24 שעות לפני השימוש כדי להסיר את הממס הנותר.
    1. דגירה 200 μL של מים ללא הרעלן בשלוש בארות של כל צלחת עבור 1 h. מדידת ריכוז אנדוטוקסין של תמציות המים תוך שימוש בשיטת נקודת הקצה האנדוגנית (שלבים 2.5.1-2.5.6).

4. ציפוי תאים משטחי תרבות עם זכוכית אקרילית (טטרפלואורואתילן)

  1. הפוך את הפתרון 1 מ"ג/mL של פולי (הטטרפלואורואתילן) (למשל, להוסיף 10 מ ג של fPTFE 10 מ ל של ממיס fluorinated ומס [טבלה של חומרים]) בבקבוקון 20 מ ל זכוכית. מניחים פס מגנטי בבקבוקון ומאפשרים לערבב לפחות 24 שעות, עד שכל המוצקים מומס.
  2. הוסף כ 150 μL של הפתרון הפולימרי לכל טוב של פוליסטירן 48-צלחת הבאר (כלומר, לא התרבות רקמה מטופלת). להטות את צלחת הבאר לאט כדי להבטיח כיסוי מלא של כל הבארות עם פתרון פולימרי. החלפת מכסה.
    1. כדי להבטיח את הציפוי האפקטיבי ביותר של בארות, שמיכות זכוכית צריך להיות מצופה מצופה ומשמש למדידת זווית מגע המים (שלב 4.3.1). הציבו שמיכות בתוך הבארות של צלחת 24. הוסף כ 400 μL של פתרון פולימרי לכל היטב המכיל שמיכות. לדחוף את הכיסויים באמצעות מלקחיים סטרילי, להבטיח שהם מכוסים לחלוטין בפתרון פולימרי, ולכסות את צלחת הבאר עם מכסה.
  3. מניחים את צלחת הבאר עם פתרון פולימרי ו/או כיסוי לתוך תנור ואקום להגדיר ב 50 cmHg, 40 ° c. הסר את המכסה ולכסות עם מחיקה בודדת רובד כדי למנוע פסולת אחרים ליפול לתוך הבארות. אפשר להדגירה לפחות 48 h.
    1. מדידת המים זווית המגע של שמיכות מצופה ציפוי עם מד זווית כדי להבטיח ציפוי יעיל.
      הערה: יש להשתמש רק במים של הטוהר הגבוה ביותר (למשל, זכוכית מזוקקים משולשת) עבור מדידות זווית מגע המים.
  4. הוסף 300 μL של 70% אתנול (עשוי אתנול מוחלט מים אנטוקסין נטול) ו-דגירה ב-RT עבור 1 h. הסר את אתנול ולבצע שטיפת מים אנדוטוקסין בחינם על ידי הוספת 300 μL של מים אנטוקסין-ללא שימוש לכל טוב והדגירה עבור 1 h (שלוש פעמים), 12 שעות ו-24 שעות לפני השימוש כדי להסיר את הממס הנותר.
    1. דגירה 200 μL של מים חינם אנדוטוקסין בשלוש בארות של כל צלחת עבור 1 h. מדידת ריכוז אנדוטוקסין של תמציות מים באמצעות שיטת נקודת הקצה כרומוגניים באמצעות הסדר (שלבים 2.5.1-2.5.6).
  5. UV לעקר את צלחות הבאר עבור 30 דקות לפני ניסויים בתרבות התא.

5. הפיכת ליפוסט מתאי 3T3

  1. לגדול 3T3 תאים T150 מרובים מבחנות כדי 70% המפגש. כדי לנתק את התאים, לנקות את התקשורת, לשטוף את המשטח עם 5 מ ל של PBS, ו לאכול PBS. הוסף 5 מ ל של בעלי חיים ללא מוצא, רקומביננטי תא האנזים הדיסוציאציה (לוח חומרים) ו הדגירה ב 37 ° c עבור 3-5 דקות.
  2. ניתוק תאים על-ידי הטיית הבקבוקון בעדינות הלוך ושוב. הוסף 5 מ ל PBS כדי לנטרל את האנזים רקומביננטי המשמש לדיסוציאציה תא. להעביר את התאים המנותקים מצלוחיות לתוך צינור צנטריפוגה ולערבב באמצעות ליטוף. לבצע ספירת תאים חיים באמצעות הומוציטוטומטר ותא הכדאיות של התא.
    הערה: אנזים דיסוציאציה של תא שניתן לנטרל באמצעות דילול ב PBS נבחר כדי למנוע את המבוא של חלבונים מבוססי סרום בהכנה ליפוסט. אם משתמשים בטריפסין כדי לנתק תאים, יש לנטרל אותו בתמיסה המכילה סרום, ולבצע שטיפת PBS נוספת כדי להקטין את כמות החלבונים בסרום הנישא להכנה הליפוסט.
  3. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות. ומריף את התאים המחדש בנפח המקורי (כלומר, 10 mL x מספר של מבחנות) של PBS לשטוף את כל המדיה הנותרים. חזור על.
  4. צנטריפוגה את התאים שוב ב 200 x עבור 5 דקות ומכה את הסופרנטאנט. הוסף את נפח ה-PBS הנדרש כדי להשיג ריכוז תא סופי של 1 x 106 תאים/mL. מניחים את התמיסה התאית למקפיא של 80 ° c עד שהדוגמא קפואה לחלוטין (לפחות 2 שעות).
  5. הפשרת פתרון התא באמבט מים ב37 ° c. פעם אחת לגמרי, מניחים את הפתרון בחזרה למקפיא-80 ° c עד קפוא לחלוטין. חזור על סך של 3 מחזורי הקפאת הפשרה.
  6. ביצוע של חומצה מיקרו-בינואית (BCA) בדיקה על התא לאחר במגוון של דילול (למשל, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) כדי לקבוע את ריכוז החלבון. לדלל את התא לאחר לריכוז חלבון של 468.75 μg/mL, aliquot, ולאחסן ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.
    הערה: ריכוז החלבון הסופי בצלחת 48-באר הוא 125 μg/cm2 (מבוסס על פני שטח של אחד טוב, 0.75 ס"מ2).
  7. לבצע כתם מערבי כדי להעריך את הנוכחות של damps בליפוסט (למשל, החום חלבון 60 [HSP60], הקבוצה הגבוהה ניידות תיבת 1 [HMGB1]) על-ידי טעינת 40-60 לערך של חלבון ליקיה במאגר טעינת אל 1.5 מ"מ עבה 10% אלקטרופורזה ג'ל ולעקוב רגיל מערבי כתם נהלים.

6. הערכת אפקט של שכבות חלבון Adsorbed ו שיחת כמו קולטנים על הפעילות NF-κB של מקרופאגים

הערה: עבור סכמטית של זרימת העבודה הניסיונית ואת לוח הצלחת, להתייחס לדמות 1a ו משלים איור 1, בהתאמה.

  1. לגדל מקרופאגים כתבת בבקבוקון בגודל כראוי 70% המפגש. . ומביסה את הערוץ הpbs הוסף את האנזים דיסוציאציה רקומביננטי cell ואת הדגירה ב 37 ° c עבור 8 דקות.
  2. ניתוק תאים על ידי הקשה בחוזקה על הצדדים של הבקבוקון. הפוך את האנזים רקומביננטי הדיסוציאציה של התא על-ידי הוספת נפח שווה של מדיית גדילה (המכילה 10% FBS). לבצע ספירת תאים חיים באמצעות הומוציטוטומטר ותא הכדאיות של התא.
    הערה: הכדאיות הצפויה עבור מקרופאגים העיתונאי בעקבות דגירה של 8 דקות באנזים הדיסוציאציה של התא הוא 90%.
  3. בתאי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות. האכלה על ידי הסופר ומשהה בנפח המקורי של PBS לשטוף תאים. צנטריפוגה שוב ולהשעות את התאים ב7.3 x 105 תאים/mL באמצעי האחסון (המכיל fbs חום המופעל).
  4. ההשעיה התא הנפרד 3 צינורות שונים: TLR4 מעכב, anti-TLR2, ולא מטופל. התאים דגירה עם 1 μg/mL TLR4 מעכב עבור 60 דקות ב RT או עם 50 μg/mL anti-TLR2 עבור 30 דקות ב RT.
  5. הוסף 200 μl של ליפוסט, 10% fbs, 10% פלזמה מסחרי העכבר (הטבלה של חומרים), או תערובת של פתרונות חלבון לצלחת 48-באר (או שווה ערך) ולאפשר חלבון ספוח ב 37 ° צ' למשך הזמן הרצוי (כלומר, 30 דקות, 60 דקות, או 24 h). מנושף פתרונות חלבונים מבארות, תוך שימוש בפיפטה טרי פסטר עבור כל פתרון חלבון, ולשטוף משטחים עם 250 μL של PBS במשך 5 דקות.. מרוב הערוץ חזור על הסכום בסך של 3 שוטף.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להפעיל שלב זה מוקדם יותר בפרוטוקול בהתאם לזמן הרצוי של הספיחה. התאם את הפרוטוקול בהתאם.
  6. לאחר תקופת דגירה עם מעכב TLR4 או anti-TLR2, תאים פיפטה להשעות מחדש. הוסף 200 μL של פתרון התא לכל באר.
  7. עבור מצב בקרה TLR2 חיובי, הוסף Pam3CSK4 לריכוז סופי של 150 ng/mL. עבור מצב בקרת TLR4 חיובי, הוסף ליפופוליסכריד (LPS) לריכוז סופי של 1.5 μg/mL. מודטה תאים ב 37 ° c עבור 20 h.
  8. לדוגמה 20 μL של סופרנטאנט מכל באר וצלחת בשכפול לתוך צלחת 96. כלול שלוש בארות של 20 מדיית שיטת μL כבקרת רקע. הוסף 200 μL של כתבת SEAP מגיב לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם דביק ו הדגירה עבור 2.5 h ב 37 ° c.
    הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לתנאים הניסיוניים, וצריך להיות מותאם לשינוי חזק בספיגה בין בארות שליטה חיוביות ושליליות.
    1. העבר את יתרת הסופרנטאנט לצינור 1.5 mL (לכל היותר). צנטריפוגה ב 1,000 x g עבור 10 דקות כדי גלולה כל פסולת. העברת סופרנטאנט לצינור 1.5 mL חדש ולחנות ב-80 ° c. ניתוח הסופרנטאנט לנוכחות ציטוקינים פרודלקתיים (לדוגמה, tnf-α, אינטרלויקין 6) באמצעות מבחן חיסוני מקושר אנזימים (אליסה).
  9. הסרת חותם לוחית דבק. לקרוא ספיגת הצלחת באמצעות קורא צלחת ב 635 ננומטר. מנושף נוזלים ולהשליך לוחית.

תוצאות

שיטות ניקוי עבור משטחים מצופי פולימר נבדקו כדי להבטיח שלא היה הפרעה של ציפוי, אשר ניתן היה לראות כשינוי בזווית מגע המים לתוך שמיכות זכוכית ללא ציפוי (איור 2). הטבילה PMMA מצופה מיקרוסקופ שקופיות 70% אתנול עבור 1 h נמצא כדי להסיר את ציפוי PMMA (איור 2, שמאל פאנל), כנראה...

Discussion

המוקד העיקרי של המעבדה שלנו היא התגובה המארחת על שתלים מוצק רקמת רקמה רכה, ובמיוחד איך הנזק התאי שנגרמו במהלך השתלת הליך משפיע על התגובה המארחת. העבודה המוצגת כאן מתארת ניסויים ראשוניים באמצעות כתבת קו מקרופאג cell באמצעות מבחנה לחות הסלולר המכילים לחות, כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות שפור...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

המחברים מכירים בהכרת תודה מבצעית מהמכונים הקנדיים של פרויקט מחקר הבריאות (PTJ 162251), הסנאט של אוניברסיטת המלכה ועדת המחקר המייעצת ותמיכת תשתית של הקרן הקנדית לחדשנות קרן ג'ון אוון (פרויקט 34137) ומשרד המחקר והחדשנות באונטריו קרן המחקר (פרויקט 34137). L.A.M. היה נתמך על ידי אוניברסיטת המלכה R. סמואל מקלפלין מלגת, מדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי של קנדה בוגרת מלגת בוגר הפרס של מאסטר בוגרת אונטריו מלגה. המחברים רוצים להודות לד ר מיירון סצ'ואן על מתנתו הנדיבה של הכתבת NF-κB/AP-1 מקרופאג line ו ד"ר. מיכאל בלנרסט וסנדרה לורנסו לשימוש מערכת הדמיה ג'ל שלהם וקורא צלחת.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2)Biolegend121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor)InvivogenTLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US originInnovativeResearchIGMSC57-K2 EDTA-Compl-10mlMouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Sigma AldrichD6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Fisher Scientific14190250No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research gradeWisent98150
LPS-EKInvivogenTLRL-EKLPSLipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblastsATCCCRL-1658
Pam3CSK4Invivogentlrl-pmsSynthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycinSigma AldrichP4333-100ML
PlasmocinInvivogenANT-MPPMycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cellsInvivogenraw-spNF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061
TrypLE express enzyme (1X)Fisher Scientific12604021animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
ZeocinInvivogenANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6BiolegendB213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-αBiolegendB220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE)Associates of Cape Cope Inc.E0005-5Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mLAssociates of Cape Cope Inc.WP1001Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assayFisher ScientificPI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kitAssociates of Cape Cope Inc.C1500-5Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection mediumInvivogenrep-qb2Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrousSigma Aldrich288306-1L
Ethyl alcohol anhydrousCommercial AlcoholsP006EAANSigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forcepsFisher Scientific16-100-113
Fluorinert FC-40 solventSigma AldrichF9755-100MLFluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free)Fisher ScientificSH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA)Sigma Aldrich182230-25G
Sylgard 184 elastomer kitFisher Scientific50822180
Teflon-AF (fPTFE)Sigma Aldrich469610-1GPoly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate sealsFisher ScientificAB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mLFisher Scientific14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene capsFisher Scientific03-337-4
Clear PS 48-well plateFisher Scientific08-772-52
Clear TCPS 96-well plateFisher Scientific08-772-2C
Clear TCPS 48-well plateFisher Scientific08-772-1C
Cover glasses, circlesFisher Scientific12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25Fisher Scientific10-126-10
sticky-Slide 8 WellIbidi80828
Superfrost microscope slidesFisher Scientific12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150Fisher Scientific08-772-48

References

  1. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 86-100 (2008).
  2. Anderson, J. M., Miller, K. M. Biomaterial biocompatibility and the macrophage. Biomaterials. 5 (1), 5-10 (1984).
  3. Collier, T. O., Anderson, J. M. Protein and surface effects on monocyte and macrophage adhesion, maturation, and survival. Journal of Biomedical Materials Research. 60 (3), 487-496 (2002).
  4. Bianchi, M. E. DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger. Journal of Leukocyte Biology. 81 (1), 1-5 (2007).
  5. McKiel, L. A., Fitzpatrick, L. E. Toll-like Receptor 2-Dependent NF-κB/AP-1 Activation by Damage-Associated Molecular Patterns Adsorbed on Polymeric Surfaces. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3792-3801 (2018).
  6. Babensee, J. E. Interaction of dendritic cells with biomaterials. Seminars in Immunology. 20 (2), 101-108 (2008).
  7. Sintes, J., Romero, X., de Salort, J., Terhorst, C., Engel, P. Mouse CD84 is a pan-leukocyte cell-surface molecule that modulates LPS-induced cytokine secretion by macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 88 (4), 687-697 (2010).
  8. Tom, J. K., Mancini, R. J., Esser-Kahn, A. P. Covalent modification of cell surfaces with TLR agonists improves and directs immune stimulation. Chemical Communications. 49 (83), 9618-9620 (2013).
  9. Abdulkhalek, S., et al. Neu1 sialidase and matrix metalloproteinase-9 cross-talk is essential for toll-like receptor activation and cellular signaling. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36532-36549 (2011).
  10. Gorbet, M. B., Sefton, M. V. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 26 (34), 6811-6817 (2005).
  11. Xing, Z., Pabst, M. J., Hasty, K. A., Smith, R. A. Accumulation of LPS by polyethylene particles decreases bone attachment to implants. Journal of Orthopaedic Research. 24 (5), 959-966 (2006).
  12. Ding, H., et al. Comparison of the cytotoxic and inflammatory responses of titanium particles with different methods for endotoxin removal in RAW264.7 macrophages. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 23 (4), 1055-1062 (2012).
  13. Hoogenboom, R., Becer, C. R., Guerrero-Sanchez, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Solubility and thermoresponsiveness of PMMA in alcohol-water solvent mixtures. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1173-1178 (2010).
  14. Efimenko, K., Wallace, W. E., Genzer, J. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 254 (2), 306-315 (2002).
  15. Godek, M. L., Sampson, J. A., Duchsherer, N. L., McElwee, Q., Grainger, D. W. Rho GTPase protein expression and activation in murine monocytes/macrophages is not modulated by model biomaterial surfaces in serum-containing in vitro cultures. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 17 (10), 1141-1158 (2006).
  16. Park, J. S., et al. Involvement of Toll-like Receptors 2 and 4 in Cellular Activation by High Mobility Group Box 1 Protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (9), 7370-7377 (2004).
  17. Ohashi, K., Burkart, V., Flohé, S., Kolb, H. Cutting Edge: Heat Shock Protein 60 Is a Putative Endogenous Ligand of the Toll-Like Receptor-4 Complex. The Journal of Immunology. 164 (2), 558-561 (2000).
  18. Wong, T., McGrath, J. A., Navsaria, H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. British Journal of Dermatology. 156 (6), 1149-1155 (2007).
  19. van Wachem, P. B., et al. The influence of protein adsorption on interactions of cultured human endothelial cells with polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 21 (6), 701-718 (1987).
  20. Miller, K. M., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage activation and interleukin 1 generation by biomedical polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 22 (8), 713-731 (1988).
  21. Bonfield, T. L., Colton, E., Anderson, J. M. Plasma protein adsorbed biomedical polymers: Activation of human monocytes and induction of interleukin 1. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (6), 535-548 (1989).
  22. González, O., Smith, R. L., Goodman, S. B. Effect of size, concentration, surface area, and volume of polymethylmethacrylate particles on human macrophages in vitro. Journal of Biomedical Materials Research. 30 (4), 463-473 (1996).
  23. Anderson, J. M., et al. Protein adsorption and macrophage activation on polydimethylsiloxane and silicone rubber. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition. 7 (2), 159-169 (1995).
  24. Lord, M. S., Foss, M., Besenbacher, F. Influence of nanoscale surface topography on protein adsorption and cellular response. Nano Today. 5 (1), 66-78 (2010).
  25. Chen, S., et al. Characterization of topographical effects on macrophage behavior in a foreign body response model. Biomaterials. 31 (13), 3479-3491 (2010).
  26. Shen, M., Horbett, T. A. The effects of surface chemistry and adsorbed proteins on monocyte/macrophage adhesion to chemically modified polystyrene surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 57 (3), 336-345 (2001).
  27. Love, R. J., Jones, K. S. The recognition of biomaterials: Pattern recognition of medical polymers and their adsorbed biomolecules. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (9), 2740-2752 (2013).
  28. McNally, A. K., Anderson, J. M. Phenotypic expression in human monocyte-derived interleukin-4-induced foreign body giant cells and macrophages in vitro: Dependence on material surface properties. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1380-1390 (2015).
  29. Gambhir, V., et al. The TLR2 agonists lipoteichoic acid and Pam3CSK4 induce greater pro-inflammatory responses than inactivated Mycobacterium butyricum. Cellular Immunology. 280 (1), 101-107 (2012).
  30. Suzuki, O., Yagishita, H., Yamazaki, M., Aoba, T. Adsorption of Bovine Serum Albumin onto Octacalcium Phosphate and its Hydrolyzates. Cells and Materials. 5 (1), 45-54 (1995).
  31. Johnston, R. L., Spalton, D. J., Hussain, A., Marshall, J. In vitro protein adsorption to 2 intraocular lens materials. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 25 (8), 1109-1115 (1999).
  32. Jin, J., Jiang, W., Yin, J., Ji, X., Stagnaro, P. Plasma proteins adsorption mechanism on polyethylene-grafted poly(ethylene glycol) surface by quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 29 (22), 6624-6633 (2013).
  33. Swartzlander, M. D., et al. Linking the foreign body response and protein adsorption to PEG-based hydrogels using proteomics. Biomaterials. 41, 26-36 (2015).
  34. Chamberlain, M. D., et al. Unbiased phosphoproteomic method identifies the initial effects of a methacrylic acid copolymer on macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (34), 10673-10678 (2015).
  35. Dillman, W. J., Miller, I. F. On the adsorption of serum proteins on polymer membrane surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 44 (2), 221-241 (1973).
  36. Ishihara, K., Ziats, N. P., Tierney, B. P., Nakabayashi, N., Anderson, J. M. Protein adsorption from human plasma is reduced on phospholipid polymers. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (11), 1397-1407 (1991).
  37. Warkentin, P., Wälivaara, B., Lundström, I., Tengvall, P. Differential surface binding of albumin, immunoglobulin G and fibrinogen. Biomaterials. 15 (10), 786-795 (1994).
  38. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 33 (5), 443-454 (2010).
  39. Zhang, Y., Karki, R., Igwe, O. J. Toll-like receptor 4 signaling: A common pathway for interactions between prooxidants and extracellular disulfide high mobility group box 1 (HMGB1) protein-coupled activation. Biochemical Pharmacology. 98 (1), 132-143 (2015).
  40. Mizel, S. B., Honko, A. N., Moors, M. A., Smith, P. S., West, A. P. Induction of macrophage nitric oxide production by Gram-negative flagellin involves signaling via heteromeric Toll-like receptor 5/Toll-like receptor 4 complexes. Journal of Immunology. 170 (12), 6217-6223 (2003).
  41. Das, N., et al. HMGB1 Activates Proinflammatory Signaling via TLR5 Leading to Allodynia. Cell Reports. 17 (4), 1128-1140 (2016).
  42. Pelegrin, P., Barroso-Gutierrez, C., Surprenant, A. P2X7 Receptor Differentially Couples to Distinct Release Pathways for IL-1β in Mouse Macrophage. The Journal of Immunology. 180 (11), 7147-7157 (2008).
  43. Tak, P. P., Firestein, G. S. NF-κB: A key role in inflammatory diseases. Journal of Clinical Investigation. 107 (1), 7-11 (2001).
  44. Ashkenazi, A., Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science. 281 (5381), 1305-1308 (1998).
  45. Erridge, C. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants. Journal of Leukocyte Biology. 87 (6), 989-999 (2010).
  46. Feng, Y., et al. A macrophage-activating, injectable hydrogel to sequester endogenous growth factors for in situ angiogenesis. Biomaterials. 134, 128-142 (2017).
  47. Lonez, C., et al. Cationic lipid nanocarriers activate Toll-like receptor 2 and NLRP3 inflammasome pathways. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 10 (4), 775-782 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering155

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved