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Résumé

Ce protocole fournit aux chercheurs une méthode rapide et indirecte de mesure de l'activité du facteur de transcription NF-B/AP-1, dépendante de TLR, dans une lignée de cellules macrophages murines en réponse à une variété de surfaces polymères et de couches protéiques adsorbées qui modélisent le microenvironnement de l'implant biomatériau.

Résumé

La réponse inflammatoire persistante d'hôte à un biomatériau implanté, connu sous le nom de réaction de corps étranger, est un défi significatif dans le développement et la mise en œuvre des dispositifs biomédicaux et des constructions d'ingénierie de tissu. Les macrophages, une cellule immunitaire innée, sont des acteurs clés dans la réaction du corps étranger parce qu'ils restent au site de l'implant pendant toute la durée de vie de l'appareil, et sont couramment étudiés pour acquérir une compréhension de cette réponse néfaste de l'hôte. De nombreux chercheurs en biomatériaux ont montré que les couches de protéines adsorbées sur les matériaux implantés influencent le comportement des macrophages, et par la suite ont un impact sur la réponse de l'hôte. Les méthodes de cet article décrivent un modèle in vitro utilisant des couches de protéines adsorbed contenant des molécules de dommages cellulaires sur les surfaces de biomatériaux polymères pour évaluer les réponses macrophages. Une lignée de cellules macrophages de journaliste de NF-B/AP-1 et l'essai colorimétrique associé de phosphatase alkaline ont été employés comme méthode rapide pour examiner indirectement l'activité de facteur de transcription de NF-B/AP-1 en réponse aux couches complexes de protéine adsorbée contenant des protéines sanguines et des modèles moléculaires dommages-associés, comme modèle des couches complexes de protéine adsorbed formées sur des surfaces de protéine de biomatériau in vivo.

Introduction

La réaction du corps étranger (FBR) est une réponse chronique de l'hôte qui peut avoir un impact négatif sur la performance d'un matériau ou d'un dispositif implanté (p. ex. dispositifs d'administration de médicaments, biocapteurs), par la libération persistante de médiateurs inflammatoires et en empêchant l'intégration entre le matériau implanté et le tissu environnant1. Cette réponse immunitaire innée est initiée par la procédure d'implantation et se caractérise par la présence à long terme de cellules immunitaires innées et la formation de capsules fibreuses autour de l'implant1. Dans le contexte des réponses matérielles de l'hôte, les interactions macrophage-matérielle ont un impact significatif sur la progression de la réponse de l'hôte et le développement d'un FBR1. Les macrophages sont une population de cellules immunitaires innées diversifiées, recrutées au site de l'implant soit à partir de populations de macrophages résident de tissus ou du sang comme macrophages dérivés de monocytes. Ils commencent à s'accumuler sur le site de l'implant peu de temps après l'implantation, et en quelques jours deviennent la population cellulaire prédominante dans le microenvironnement implantaire. Les macrophages matériels, ainsi que les cellules géantes du corps étranger (FBGC) formées par la fusion des macrophages, peuvent persister à la surface du matériau pendant toute la durée de vie de l'implant2,3. Par conséquent, les macrophages sont considérés comme des acteurs clés dans la réponse du corps étranger en raison de leurs rôles orchestrant les étapes caractéristiques de la FBR: réponse inflammatoire aigue, remodelage des tissus, et la formation de tissu fibrotique1.

Les récepteurs de péage-comme (TLRs) sont une famille des récepteurs de reconnaissance de modèle qui sont exprimés par beaucoup de cellules immunitaires, y compris des macrophages, et ont été montrés pour jouer un rôle significatif dans l'inflammation et la guérison de blessure. En plus des ligands dérivés d'agents pathogènes, les TLR sont capables de lier les molécules endogènes, connues sous le nom de modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), qui sont libérés pendant la nécrose cellulaire et d'activer les voies de signalisation inflammatoires entraînant la production de cytokines proinflammatoires4. Nous et d'autres avons proposé que les dommages encourus pendant les procédures d'implantation de biomatériaux mous libèrent des DAMPs, qui adsorbent alors aux surfaces de biomatériaux en plus des protéines de sang et modulent les interactions suivantes de cellules-matériel5,6. Lorsque les macrophages interagissent avec la couche protéique adsorbed sur un implant, leurs TLR de surface peuvent reconnaître les DAMP adsorbés et activer les cascades de signalisation pro-inflammatoire, conduisant à nf-B et AP-1 transcription facteur d'activation et de production de cytokines proinflammatoires. Nous avons précédemment montré que les macrophages murines ont considérablement augmenté l'activité de NF-B/AP-1 et le facteur de nécrose de tumeur (TNF-, cytokine proinflammatoire) sécrétion en réponse à DAMP-contenant des couches de protéines adsorbed sur une variété de surfaces polymères par rapport aux surfaces avec sérum adsorbed ou plasma seulement (c.-à-d., pas de DAMPs présents), et que cette réponse est largement médiée par TLR2, tandis que TLR4 joue un rôle moindre5.

La lignée de cellules macrophages de reporter NF-B/AP-1 (Tableau des matériaux) utilisée dans ce protocole est une méthode pratique pour mesurer l'activité relative de NF-B et d'AP-1 dans les macrophages5,7,8. En combinaison avec les inhibiteurs de voie de TLR, cette ligne de cellules est un outil utile pour étudier l'activation de TLR et son rôle dans l'inflammation en réponse à une série de stimulus5,7,8. Les cellules de journaliste sont une ligne cellulaire macrophage-like de souris modifiée qui peut produire de façon stable la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) sur l'activation de facteur de transcription NF-B et AP-19. L'analyse colorimétrique enzymatique de phosphatase alcaline(tableau des matériaux)peut alors être utilisée pour quantifier les quantités relatives d'expression SEAP comme mesure indirecte de l'activité NF-B/AP-1. Comme nf-B et AP-1 sont en aval de nombreuses voies de signalisation cellulaire, neutraliser les anticorps et les inhibiteurs ciblant des TLR spécifiques (p. ex. TLR2) ou des molécules adaptatrices TLR (p. ex. MyD88) peuvent être utilisés pour vérifier le rôle d'une voie spécifique. La méthodologie décrite dans cet article fournit une approche simple et rapide pour évaluer la contribution de la signalisation de TLR dans les réponses de macrophage murine à une série de surfaces polymères avec des couches de protéine adsorbées contenant des protéines de sang et des DAMPs comme modèle in vitro des biomatériaux implantés.

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Protocole

1. Préparation des médias et des réactifs

  1. Préparer les médias fibroblastes. Combinez 450 ml du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 ml de pénicilline/streptomycine. Conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois.
  2. Préparer les médias de croissance macrophage journaliste en 50 ml aliquots. Combiner 45 mL de DMEM, 5 mL de FBS, 5 g/mL de réactif d'élimination du mycoplasme(tableau des matériaux),et 200 g/mL de phléomycine D1(Tableau des matériaux). Conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois.
  3. Préparer les médias d'exemple de macrophage de journaliste dans 50 mL aliquots. Combinez 45 ml de DMEM, 5 ml de FLeomycine inactivée par la chaleur (HI-FBS), 5 réagents d'élimination du mycoplasme de g/mL et 200 x g/mL de phléomycine D1. Conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois.

2. Revêtement des surfaces de culture cellulaire avec poly (méthyle méthacrylate)

  1. Dissoudre le poly (méthyle méthacrylate) (PMMA) dans le chloroforme à 20 mg/mL (p. ex., 100 mg de PMMA dans 5 ml de chloroforme) dans une fiole de scintillation en verre de 20 ml. Placer une barre magnétique dans le flacon et laisser remuer pendant au moins 2 h, jusqu'à ce que tous les solides soient dissous.
    MISE EN GARDE: Le chloroforme est nocif s'il est inhalé. Assurez-vous d'utiliser du solvant dans une hotte de fumée tout en portant des gants PVA.
  2. Pipette 400 'L de solution PMMA sur le centre d'une lame de microscope en verre borosilicate dans un couchette de spin, et tourner à 3000 tr/min pendant 2 min. Préparer le nombre de diapositives nécessaires pour l'analyse, ainsi que 3 à 5 supplémentaires pour la mesure de l'angle de contact de l'eau. Rangez les glissières dans une boîte propre (pulvérisée et essuyée avec 70 % d'éthanol) pour une utilisation future.
    REMARQUE: Le revêtement de spin est souvent employé pour déposer un revêtement mince et uniforme sur une surface plane. Un douilleur de spin fait pivoter un substrat à haute vitesse, en utilisant la force centrifuge pour étendre la solution de revêtement sur la surface.
    1. Mesurer l'angle de contact de l'eau à deux positions aléatoires à la surface des toboggans supplémentaires enduits (c.-à-d. pas les diapositives utilisées pour la culture cellulaire) avec un goniomètre pour s'assurer que la surface de verre était complètement recouverte du polymère.
      REMARQUE: Seule l'eau de la plus grande pureté (p. ex., verre triple distillé) doit être utilisée pour mesurer l'angle de contact de l'eau.
  3. Dans un coffret de sécurité biologique (BSC), attachez des puits collants à 8 chambres à des lames enduites PMMA à l'aide de forceps stériles et en suivant une technique aseptique. Appuyez fermement sur le dessus des puits collants pour s'assurer qu'ils sont fortement attachés. Incuber les lames avec des puits collants attachés à 37 oC pendant la nuit pour fixer le joint.
    1. Testez le joint des puits collants en ajoutant 200 L d'eau de qualité de culture cellulaire (sans endotoxine) à chaque puits. Incuber à température ambiante (RT) pendant 60 min et ne pas éviter de fuite avant de procéder. Aspirer l'eau, en prenant soin de ne pas déranger le revêtement PMMA.
  4. Effectuer des lavages d'eau sans endotoxine en ajoutant 300 l'eau sans endotoxine à chaque puits et en couve pendant 1 h (trois fois), 12 h et 24 h avant d'être utilisé pour enlever tout solvant restant.
  5. Testez la concentration d'endotoxines des diapositives à utiliser pour la culture cellulaire. Incuber 200 l d'eau de réactif sans endotoxine(Tableau des matériaux) dans un puits de chaque toboggan pendant 1 h. Mesurer la concentration d'endotoxinedanse dans l'extrait à l'aide d'un point de terminaison d'endotoxine chromogénique(Tableau des matériaux).
    REMARQUE: Le protocole suivant est spécifique au kit d'analyse de l'endotoxine figurant dans le Tableau des matériaux.
  6. N'utilisez que de l'eau et des consommables (c.-à-d. des pointes de pipette, des tubes de microcentrifuge et des plaques de puits) qui sont certifiés sans pyrogène (c.-à-d. sans endotoxine) pour ce travail. En outre, toute verrerie utilisée dans la préparation des surfaces recouvertes de polymères doit être dépyrogénéisée à l'aide de la stérilisation à la chaleur sèche (250 oC pendant 30 min) avant d'utiliser10. La mesure de l'endotoxine dans la solution d'extrait, comme décrit ici, peut avoir comme conséquence une sous-estimation de l'endotoxine sur la surface matérielle11,12. Par conséquent, il est recommandé que lors de l'élaboration d'un protocole de revêtement polymère, effectuer la réaction d'analyse de l'endotoxine (c.-à-d., étapes 2.5.4-2.5.6 pour les échantillons d'essai [l'eau de réactif] ou les contrôles de pointe) directement dans les puits contenant l'échantillon enduit pour s'assurer qu'aucune source d'endotoxine n'est introduite par inadvertance dans le système pendant le processus de revêtement.
    1. Apportez tous les échantillons d'essai (c.-à-d. extraits) et les réactifs d'analyse d'endotoxine à RT. Reconstituer le réactif chromogénique dans la norme de tampon d'essai et d'endotoxine dans l'eau de réactif, permettent de se dissoudre pendant 5 min et tourbillonnent doucement avant d'utiliser. Couvrir toutes les bouteilles de film de paraffine lorsqu'elle n'est pas utilisée.
    2. Créez une courbe de dilution standard de 5 à 8 points de la norme d'endotoxine allant de la limite inférieure à la limite supérieure de l'analyse en effectuant une dilution sérielle de la norme d'endotoxine dans l'eau de réactif.
    3. Pour contrôler l'amélioration ou l'inhibition de l'analyse de l'endotoxine dans les échantillons d'essai, préparez un contrôle positif (également appelé un contrôle de pointe ou un échantillon à pointes) en diluant une quantité connue d'endotoxine dans la solution d'échantillon d'essai inutilisée.
      REMARQUE: La concentration du contrôle positif doit être la même concentration qu'une norme au milieu de la courbe standard. Si la quantité récupérée du pic d'endotoxine (c.-à-d., concentration du contrôle positif moins la concentration de l'échantillon d'essai non épilé) est dans 50-200% de la concentration nominale du pic d'endotoxine, la solution d'extraction peut être considérée pour ne pas interférer de manière significative avec l'essai.
    4. Ajoutez 50 L de normes, d'échantillons ou de commandes de pointe à chaque puits d'une plaque de 96 puits en double ou en triple. Utilisez l'eau de réactif comme un contrôle négatif.
    5. Ajouter 50 l de réactif chromogénique à chaque puits. Ajouter le réactif rapidement à tous les puits. Utilisez une minuterie pour enregistrer le temps qu'il faut pour ajouter du réactif à tous les puits. Couvrir la plaque d'un joint adhésif et incuber à 37 oC (le temps d'incubation dépend du lot et indiqué sur le certificat d'analyse inclus dans le kit de réactif chromogénique). Vous pouvez également vérifier sur la plaque toutes les 15 min pendant l'incubation jusqu'à ce que le changement de couleur soit observé dans tous les puits standard.
    6. Après l'incubation, ajouter 25 ll d'acide acétique à 50 % de l'acide acétique à chaque puits (concentration finale de 10 % d'acide acétique par puits) pour arrêter la réaction. Ajouter de l'acide acétique dans le même ordre que le réactif chromogénique a été ajouté. Lire l'absorption de la plaque à l'aide d'un lecteur de plaque à 405 nm. Aspirer le liquide et jeter la plaque.
      REMARQUE: L'ajout d'acide acétique devrait prendre le même temps à ajouter à chaque puits que le réactif chromogénique a pris (30 s).
  7. Ultraviolet (UV) stériliser les diapositives pendant 30 minutes avant les expériences de culture cellulaire.

3. Surfaces de culture cellulaire de revêtement avec polydimethylsiloxane

  1. Mélanger l'élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) dans un rapport de poids de 10:1 (agent de base : agent de durcissement). Dans un coffret de sécurité biologique, pipette approximativement 10 ml de base de polydiméthylsiloxane dans un tube stérile. Peser le tube et ajouter lentement l'agent de durcissement jusqu'à ce que 10% a été ajouté.
    MISE EN GARDE: Utilisez des réactifs PDMS dans un endroit bien aéré et évitez le contact visuel en portant des lunettes de sécurité.
  2. Mélanger soigneusement l'élastomère en remuant avec une pointe de pipette sérologique stérile et en faisant du vaillant de haut en bas. Ajouter environ 200 l de la solution à chaque puits d'une plaque de 48 puits. Inclinez la plaque de puits lentement pour assurer une couverture complète des puits avec une solution d'élastomère.
  3. Placer la plaque de puits avec de l'élastomère dans un four à vide réglé à 50 cmHg, 40 oC. Retirez le couvercle et couvrez-le d'une lingette à une seule pile pour empêcher d'autres débris de tomber dans les puits. Laisser incuber pendant au moins 48 h.
    1. Confirmer les puits sont complètement enduits par l'inspection visuelle. Assurez-vous que l'élastomère est entièrement guéri en appuyant doucement avec une pointe de pipette stérile avant d'enlever.
  4. Ajouter 300 l'éthanol de 70 % (fabriqué avec de l'éthanol absolu et de l'eau sans endotoxine) et couver à RT pendant 1 h. Enlever l'éthanol et effectuer des lavages d'eau sans endotoxine en ajoutant 300 l d'eau sans endotoxine à chaque puits et en couve pendant 1 h (trois fois), 12 h , et 24 h avant l'utilisation pour enlever tout solvant restant.
    1. Incuber 200 l'eau sans endotoxine dans trois puits de chaque assiette pendant 1 h. Mesurer la concentration endotoxine des extraits d'eau à l'aide d'un point de terminaison d'endotoxine chromogénique (étapes 2.5.1-2.5.6).

4. Surfaces de culture cellulaire de revêtement avec Poly fluoré (tétrafluoroethylene)

  1. Faire une solution de 1 mg/mL de poly fluoré (tétrafluoroéthylène) (fPTFE) (p. ex., ajouter 10 mg de fPTFE à 10 ml de solvant fluoré [Tableau des matériaux]) dans un flacon de scintillation en verre de 20 ml. Placer une barre magnétique dans le flacon et laisser remuer pendant au moins 24 h, jusqu'à ce que tous les solides soient dissous.
  2. Ajouter environ 150 l de la solution de polymère à chaque puits d'une plaque de 48 puits de polystyrène (c.-à-d. non traitée par la culture tissulaire). Inclinez la plaque de puits lentement pour assurer une couverture complète de tous les puits avec une solution de polymère. Remplacer le couvercle.
    1. Afin d'assurer une enrobage fPTFE efficace des puits, les couvercles en verre doivent être enduits dans le fPTFE et utilisés pour la mesure de l'angle de contact avec l'eau (étape 4.3.1). Placer les couvertures à l'intérieur des puits d'une plaque de 24 puits. Ajouter environ 400 L de la solution de polymère à chaque puits contenant un bordereau. Poussez les couvertures vers le bas à l'aide de forceps stériles, en vous assurant qu'ils sont complètement recouverts de solution de polymère, et couvrez la plaque de puits avec un couvercle.
  3. Placer la plaque de puits avec une solution de polymère et/ou des plaques d'eau dans un four à vide réglé à 50 cmHg, 40 oC. Retirez le couvercle et couvrez-le d'une lingette à une seule pile pour empêcher d'autres débris de tomber dans les puits. Laisser incuber pendant au moins 48 h.
    1. Mesurez l'angle de contact avec l'eau des couvertures enduites de fPTFE à l'aide d'un goniomètre afin d'assurer un revêtement efficace.
      REMARQUE: Seule l'eau de la plus grande pureté (p. ex., verre triple distillé) doit être utilisée pour mesurer l'angle de contact de l'eau.
  4. Ajouter 300 l'éthanol de 70 % (fabriqué avec de l'éthanol absolu et de l'eau sans endotoxine) et couver à RT pendant 1 h. Enlever l'éthanol et effectuer des lavages d'eau sans endotoxine en ajoutant 300 l d'eau sans endotoxine à chaque puits et en couve pendant 1 h (trois fois), 12 h , et 24 h avant l'utilisation pour enlever tout solvant restant.
    1. Incuber 200 l'eau sans endotoxine dans trois puits de chaque assiette pendant 1 h. Mesurer la concentration d'endotoxines d'extraits d'eau à l'aide d'un point de terminaison d'endotoxine chromogénique (étapes 2.5.1-2.5.6).
  5. Les UV stérilisent les plaques de puits pendant 30 minutes avant les expériences de culture cellulaire.

5. Fabrication de Lysate à partir de cellules 3T3

  1. Cultivez des cellules 3T3 dans plusieurs flacons T150 à 70% de confluence. Pour détacher les cellules, aspirer les médias, laver la surface avec 5 ml de PBS et aspirer le PBS. Ajouter 5 mL d'enzyme de dissociation cellulaire recombinante sans origine animale(tableau des matériaux)et incuber à 37 oC pendant 3 à 5 min.
  2. Détachez les cellules en inclinant doucement le flacon d'avant en arrière. Ajouter 5 ml de PBS pour neutraliser l'enzyme recombinante utilisée pour la dissociation cellulaire. Transférer les cellules détachées des flacons dans un tube de centrifugeuse et mélanger par pipetting. Effectuez un compte de cellules vivantes à l'aide d'un hémocytomètre et d'un colorant de viabilité cellulaire.
    REMARQUE: Une enzyme de dissociation cellulaire qui peut être neutralisée par dilution dans PBS a été choisie pour éviter l'introduction de protéines à base de sérum dans la préparation du lysate. Si la trypsine est utilisée pour dissocier les cellules, elle doit être neutralisée avec une solution contenant du sérum, et un lavage PBS supplémentaire devrait être effectué pour réduire la quantité de protéines sériques transportées dans la préparation de lysate.
  3. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Aspirer les cellules supernatant et resuspendre les cellules en volume d'origine (c.-à-d. 10 mL x nombre de flacons) de PBS pour laver les supports restants. Répéter.
  4. Centrifuger les cellules à nouveau à 200 x g pendant 5 min et aspirer le supernatant. Ajouter le volume de PBS nécessaire pour atteindre une concentration cellulaire finale de 1 x 106 cellules/mL. Placer la solution cellulaire dans un congélateur de -80 oC jusqu'à ce que l'échantillon soit complètement congelé (au moins 2 h).
  5. Décongeler la solution cellulaire dans un bain d'eau de 37 oC. Une fois complètement décongelée, remettre la solution dans le congélateur de -80 oC jusqu'à ce qu'elle soit entièrement congelée. Répéter l'opération pour un total de 3 cycles de gel-dégel.
  6. Effectuer un test d'acide micro-biinchoninique (BCA) sur le lysate cellulaire à une variété de dilutions (p. ex. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) pour déterminer la concentration en protéines. Diluer le lysate cellulaire à une concentration protéique de 468,75 g/mL, aliquot, et stocker à -80 oC pour une utilisation future.
    REMARQUE: La concentration finale de protéines dans une plaque de 48 puits est de 125 g/cm2 (sur la base de la surface d'un puits, 0,75 cm2).
  7. Effectuer une tache occidentale pour évaluer la présence de DAMP dans le lysate (p. ex., protéine de choc thermique 60 [HSP60], boîte de groupe à haute mobilité 1 [HMGB1]) en chargeant 40 à 60 g de protéines lysate dans un tampon de chargement sur un gel de polyacrylamide de 1,5 mm d'épaisseur et suivez la tache occidentale standard Procédures.

6. Évaluer l'effet des couches de protéines adsorbed et des récepteurs de péage sur l'activité NF-B des macrophages

REMARQUE: Pour un schéma du flux de travail expérimental et de la disposition des plaques, consultez la figure 1A et la figure 1 supplémentaire,respectivement.

  1. Cultivez des macrophages de reporter dans un flacon de taille appropriée à la confluence de 70%. Aspirez les supports, lavez la surface avec PBS et aspirez PBS. Ajouter l'enzyme de dissociation cellulaire recombinante et incuber à 37 oC pendant 8 min.
  2. Détachez les cellules en tapant fermement sur les côtés du flacon. Inactiver l'enzyme de dissociation cellulaire recombinante en ajoutant un volume égal de support de croissance (contenant 10% de FBS). Effectuez un compte de cellules vivantes à l'aide d'un hémocytomètre et d'un colorant de viabilité cellulaire.
    REMARQUE: La viabilité prévue pour les macrophages de journaliste suivant une incubation de 8 min dans l'enzyme de dissociation de cellules est 90%.
  3. Cellules centrifugeuses à 200 x g pendant 5 min. Aspirate supernatant et resuspendre dans le volume original de PBS pour laver les cellules. Centrifugeà encore et resuspendre les cellules à 7,3 x 105 cellules/mL dans les supports d'avertissement (contenant de la chaleur inactivée FBS).
  4. Suspension cellulaire séparée en 3 tubes différents : inhibiteur TLR4, anti-TLR2 et non traité. Incuber les cellules avec un inhibiteur TLR4 de 1 g/mL pendant 60 min à RT ou avec un anti-TLR2 de 50 g/mL pendant 30 min à RT.
  5. Ajouter 200 l de lysate, 10 % de FBS, 10 % de plasma commercial de souris(tableau des matériaux),ou un mélange des solutions protéiques à une plaque de 48 puits (ou équivalent) et laisser la protéine à l'adsorbe à 37 oC pour la quantité désirée de temps (c.-à-d., 30 min, 60 min, ou 24 h). Aspirez les solutions protéiques des puits, en utilisant une pipette Pasteur fraîche pour chaque solution protéique, et lavez les surfaces avec 250 L de PBS pendant 5 min. Aspirate PBS. Répéter l'opération pour un total de 3 lavages.
    REMARQUE: Cette étape peut devoir être commencée plus tôt dans le protocole en fonction du temps d'adsorption désiré. Ajuster le protocole en conséquence.
  6. Après la période d'incubation avec l'inhibiteur TLR4 ou anti-TLR2, les cellules pipettes à resuspendre. Ajouter 200 L de solution cellulaire à chaque puits.
  7. Pour l'état de contrôle positif de TLR2, ajoutez Pam3CSK4 à une concentration finale de 150 ng/mL. Pour l'état de contrôle positif tLR4, ajouter le lipopolysaccharide (LPS) à une concentration finale de 1,5 g/mL. Incuber les cellules à 37 oC pendant 20 h.
  8. Échantillondez 20 ll de supernatant de chaque puits et plaque en double dans une plaque de 96 puits. Inclure trois puits de 20 médias d'analyse ll comme un contrôle de fond. Ajouter 200 l de réagent d'assay de journaliste SEAP à chaque puits. Couvrir la plaque d'un joint adhésif et couver pendant 2,5 h à 37 oC.
    REMARQUE: Le temps d'incubation peut varier en fonction des conditions expérimentales, et devrait être optimisé pour une forte différence d'absorption entre les puits de contrôle positifs et négatifs.
    1. Transférer le reste du supernatant dans un tube de 1,5 ml (par puits). Centrifugeuse à 1 000 x g pendant 10 min pour granuler les débris. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 ml et entreposer à -80 oC. Analyser le supernatant pour la présence de cytokines proinflammatoires (p. ex., TNF-MD, interleukine 6) par l'intermédiaire de l'analyse immunosorbent enzymatique (ELISA).
  9. Retirer le joint adhésif. Lire l'absorption de la plaque à l'aide d'un lecteur de plaque à 635 nm. Aspirer le liquide et jeter la plaque.

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Résultats

Des méthodes de nettoyage des surfaces recouvertes de polymères ont été testées pour s'assurer qu'il n'y avait pas de perturbation du revêtement, ce qui serait considéré comme un changement dans l'angle de contact avec l'eau à un bordereau de verre non couché (Figure 2). Des lames de microscope recouvertes de PMMA dans 70 % d'éthanol pendant 1 h ont été trouvés pour enlever le revêtement PMMA(figure 2, panneau gauche), probablement en raison de la...

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Discussion

L'un des principaux objectifs de notre laboratoire est la réponse de l'hôte aux implants solides de tissus mous biomatériaux, et en particulier comment les dommages cellulaires encourus pendant la procédure d'implantation influe sur la réponse de l'hôte. Les travaux présentés ici décrivent des expériences préliminaires utilisant une lignée de cellules macrophages reporter et du lysate cellulaire contenant du DAMP généré sin in vitro, afin d'étudier l'influence des molécules libérées lors de dommages ce...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient le financement opérationnel du Projet de recherche des Instituts de santé du Canada (PTJ 162251), du Comité consultatif du Sénat de l'Université Queen's et du soutien à l'infrastructure du Fonds de leadership de la Fondation canadienne pour l'innovation John Evan (projet 34137) et du Fonds de recherche du ministère de la Recherche et de l'Innovation de l'Ontario (projet 34137). L.A.M. a reçu l'appui d'une bourse R. Samuel McLaughlin de l'Université Queen's, d'une maîtrise en études supérieures du Conseil canadien des études supérieures en sciences naturelles et en génie du Canada et d'une bourse d'études supérieures de l'Ontario. Les auteurs tient à remercier le Dr Myron Szewczuk pour son généreux don de la lignée de cellules macrophages journaliste NF-B/AP-1 et les Drs Michael Blennerhassett et Sandra Lourenssen pour l'utilisation de leur système d'imagerie gel et lecteur de plaques.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture reagents
anti-mouse/human CD282 (TLR2)Biolegend121802
CLI-095 (TLR4 inhibitor)InvivogenTLRL-CLI95
C57 complement plasma K2 EDTA 10ml, innovative grade US originInnovativeResearchIGMSC57-K2 EDTA-Compl-10mlMouse plasma
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Sigma AldrichD6429-500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Fisher Scientific14190250No calcium, no magnesium
Fetal bovine serum (FBS), research gradeWisent98150
LPS-EKInvivogenTLRL-EKLPSLipopolysaccharide from Escherichia coli K12
NIH/3T3 fibroblastsATCCCRL-1658
Pam3CSK4Invivogentlrl-pmsSynthetic triacylated lipopeptide - TLR1/2 ligand
Penicillin/streptomycinSigma AldrichP4333-100ML
PlasmocinInvivogenANT-MPPMycoplasma elimination reagent
RAW-Blue cellsInvivogenraw-spNF-κB/AP-1 reporter macrophage cell line
Trypan blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061
TrypLE express enzyme (1X)Fisher Scientific12604021animal origin-free recombinant cell dissociation enzyme
ZeocinInvivogenANT-ZN-1
Kits and assays
ELISA precoated plates, mouse IL-6BiolegendB213022
ELISA precoated plates, mouse TNF-αBiolegendB220233
Endotoxin (Escherichia coli) - Control standard endotoxin (CSE)Associates of Cape Cope Inc.E0005-5Endotoxin for standard curve in chromogenic endotoxin assay
LAL water, 100 mLAssociates of Cape Cope Inc.WP1001Used with chromogenic endotoxin assay
Micro BCA protein assayFisher ScientificPI23235
Limulus amebocyte lysate (LAL) Pyrochrome endotoxin test kitAssociates of Cape Cope Inc.C1500-5Chromogenic endotoxin assay reagent
QUANTI-Blue alkaline phosphatase detection mediumInvivogenrep-qb2Alkaline phosphatase assay to indirectly measure NF-κB/AP-1 activity
Polymeric coating reagents
Chloroform, anhydrousSigma Aldrich288306-1L
Ethyl alcohol anhydrousCommercial AlcoholsP006EAANSigma: Reagent alcohol, anhydrous, 676829-1L
Straight tapered fine tip forcepsFisher Scientific16-100-113
Fluorinert FC-40 solventSigma AldrichF9755-100MLFluorinated solvent for fPTFE
Cell culture grade water (endotoxin-free)Fisher ScientificSH30529LS
Poly(methyl methacrylate) (PMMA)Sigma Aldrich182230-25G
Sylgard 184 elastomer kitFisher Scientific50822180
Teflon-AF (fPTFE)Sigma Aldrich469610-1GPoly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluoromethyl)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroethylene]
Consumables
Adhesive plate sealsFisher ScientificAB-0580
Axygen microtubes, 1.5 mLFisher Scientific14-222-155
Borosilicate glass scintillation vials, with white polypropylene capsFisher Scientific03-337-4
Clear PS 48-well plateFisher Scientific08-772-52
Clear TCPS 96-well plateFisher Scientific08-772-2C
Clear TCPS 48-well plateFisher Scientific08-772-1C
Cover glasses, circlesFisher Scientific12-545-81
Falcon tissue culture treated flasks, T25Fisher Scientific10-126-10
sticky-Slide 8 WellIbidi80828
Superfrost microscope slidesFisher Scientific12-550-15
Tissue culture treated flasks, T150Fisher Scientific08-772-48

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