小鼠大脑细胞核巴沙里斯中胆碱能纤维长度的立体估计

摘要

大脑区域三维结构内的神经元纤维长度是量化特定神经元结构完整性或退化的可靠参数。本文详细介绍了一种立体定量方法，以小鼠Meynert细胞核基质内胆碱能纤维长度为例。

摘要

不同大脑区域的胆碱能或其他神经元轴子的长度通常与该区域的特定功能相关。立体学是量化各种大脑结构神经元特征的有用方法。在这里，我们提供一个基于软件的立体学协议，以估计基底前脑Meynert（NBM）细胞核基底中胆碱能纤维的总长度。该方法使用空间球探头进行长度估计。胆碱能纤维通过胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫染色与马萝卜过氧化物酶-二氨基苯甲酸酯（HRP-DAB）检测系统可视化。使用立体学软件，染色协议对于各种大脑区域的纤维和细胞数估计也有效。立体学协议可用于估计任何线性轮廓，如胆囊状纤维、多巴胺可列菌纤维/二代胺纤维、血清素纤维、星形细胞过程，甚至血管型材。

引言

大脑中神经纤维长度和/或密度的定量估计是神经病理学研究的重要参数。不同大脑区域的胆碱能、多巴胺能和血清素轴子的长度通常与该区域的特定功能相关。由于这些斧子的分布通常是异构的，因此使用基于设计的立体学来避免采样过程中的偏差。立体学的空间球探针被设计为^{在感兴趣的区域}提供高效可靠的线状结构，如神经元纤维。探头制作一个虚拟球体，在组织中系统地施加，以测量与探头表面的线交交。由于不可能将球体探头放入组织进行分析，因此市售软件提供了一个虚拟的三维（3D）球体，基本上就是代表球体探头表面的一系列不同直径的同心圆。

选择性胆碱能神经退化是阿尔茨海默氏病（AD）2、3、4的一贯特征之一。功能失调的胆碱能传输被认为是AD认知衰退的一个致能因素。胆碱功能障碍在许多其他精神障碍中也很明显，如帕金森氏症、成瘾和精神分裂症。在动物模型中研究了胆碱能神经退化的不同方面（例如，减少乙酰胆碱5，ChAT蛋白^6，淀粉样斑块⁶附近的胆碱能纤维神经退化，减少胆碱能纤维和突触性静脉曲张^7，8）。纤维退化被认为比神经元损失更早发生，因为在研究中并不总是观察到胆碱能神经元损失。大多数胆碱能神经元在基底前脑和脑干，其轴突项目到各种大脑区域，如皮质和海马。NBM位于基础前脑，发现是AD中常见的大脑区域之一。

立体学的分馏方法基于多级组织的系统随机采样。截面采样分数（SSF）是立体学分馏法中基于计算机的节面系统采样。面积采样分数 （ASF） 是该节中感兴趣区域的分馏。厚度采样分数 （TSF） 是截面厚度的分馏。空间球探头允许我们在分数位置对 3D 球体中感兴趣的轮廓进行量化。在这里，我们使用空间球探针来估计小鼠大脑NBM中胆碱能纤维的总长度，以说明这些过程。目前的方案提供了有关组织处理的细节，立体学的采样方法，使用ChAT抗体的免疫组织化学染色，以及用于估计小鼠大脑NBM中胆碱能纤维长度和纤维密度的无偏立体学。

研究方案

使用这些动物的所有程序都已获得堪萨斯城退伍军人事务医疗中心机构动物护理和使用委员会的批准。实验中，18个月大的小鼠过度表达瑞典突变β-淀粉样蛋白前体蛋白（APPswe）及其C57/BL6 WT杂物。育种和基因分型的细节在He等人^8。

1. 灌注和组织处理

1. 使用氯胺酮（100毫克/千克）和木拉津（10毫克/千克）注射，对小鼠进行麻醉。捏脚趾，以确认缺乏反应之前继续^9。
2. 在0.1M磷酸盐缓冲液^（PB）10中，注入±50 mL的冰冷0.1M Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），后用4%的甲醛（PFA） 进行。
   注意:PFA 是有毒的。使用 PFA 时，请使用个人防护设备 （PPE）。
3. 取出大脑^10，在4°C下浸入0.1M PB中的4%PFA，进行24小时后固定，用DPBS 3x清洗。
4. 在 0.1 DPBS 中过夜，在 0.1 DPBS 中更改为 15% 蔗糖溶液，然后在 0.1 M DPBS 中再在 4°C 下再更换 30% 蔗糖溶液。
5. 从蔗糖溶液中取出组织，并冷冻在预置的冷冻室中，温度为-20°C。冷冻样品可储存在-80°C密封管中，直至切片。
6. 将组织嵌入最佳切割温度嵌入介质（参见材料表），并安装在试样盘上。使用冷冻剂在日冕平面中切割串行 30 μm 厚的部分，并收集所有部分，从而在 24 个充满低温保护剂溶液的孔培养板中收集所有部分（30% 甘油、30% 乙二醇、40% DPBS）;图 1A+C。存放在-20°C冰柜中。
   注:较厚的部分（例如50 μm）在可行的情况下更可取。确保各部分保持切割顺序，并且所有部分完全处于低温保护状态。96 孔板可用作 24 孔板的替代品，以收集截面。
7. 用板封口机盖住井，防止蒸发和干燥。将盘子储存在-20°C，直到进一步使用。在-20°C下储存的节在ChAT免疫性化学中稳定数月。

2. IHC的系统部分选择

注:应进行试点研究，了解实现可接受的误差系数 （CE） 所需的部分总数。CE 值表示采样过程中的总误差量。最低值表示最小误差，低于 0.1 的 CE 值被此处使用的软件（参见材料表^）11认为可以接受。

1. 通过将形态特征与标准小鼠大脑图集（如富兰克林和帕克西诺斯）进行比较，确定每个大脑的第一部分和最后一部分。NBM 从 -0.0mm 开始，在 -1.6 mm 结束。因此，大约50个部分包含国家银行。节的总数是立体学期间所需的参数之一。每^第8节（SSF = 1/8）的选择总共给出了6~7个部分进行分析，并在我们的试验研究中为体积估计和纤维长度估计提供了可接受的CE。
2. 随机从前八个部分之一开始，然后每隔⁸节进行系统采样，直到包含 NBM 的最后一节（图 1C）。

3. 免疫性化学

1. 将冷冻保存部分转移到室温中，在低温保护剂中，然后在6个孔板中转移0.1M磷酸盐缓冲液（PB）。
2. 在 PB 中洗涤 3 倍。
3. 在甲醇中孵育0.3%H₂O₂₁₅分钟。
4. 在Tris缓冲盐水（TBS）中洗涤3倍。
5. 在 TBS 中孵育 0.25% Triton X-100 30 分钟。
6. 在 TBS 中用 0.1% Triton X-100 中 10% 正常牛血清 （NBS） 块 30 分钟。
7. 在 TBS 中用 0.1% Triton X-100 和 1% NBS 在 4°C 下 48 小时孵育山羊抗人 ChAT 原抗体（见材料表）。
8. 在室温下，在 TB 中洗涤 3 倍。在室温下进行所有进一步的孵育和洗涤。
9. 用生物素化牛抗山羊二级抗体孵育1小时（见材料表）。
10. 在 TBS 中洗涤 3 倍。
11. 用阿维林-生物蛋白-过氧化物酶复合物孵育（见材料表）。
12. 在 TBS 中洗涤 3 倍。
13. 根据制造商的建议，使用增强的 DAB 过氧化物酶基板解决方案（参见材料表）进行开发。
    注意:民建联是一种可疑的致癌物质。接触和吸入有毒。使用 DAB 时，请使用个人防护装备。
14. 用蒸馏水清洗部分几次，并保持在Tris pH = 7.6。
15. 在明胶幻灯片上安装各部分。一个组织的所有部分都可以放在同一张幻灯片上。空气干燥部分，脱水2次，每次5分钟，分别用70%、90%、95%和100%乙醇，然后用两个10分钟二甲苯洗洗清除部分。使用安装介质盖上部分（参见材料表）。
    注: 脱水和清除的处理时间会影响各部分的厚度。因此，所有部分都应使用相同的条件。在目前的研究中，最终厚度的平均值为21.11 ± 0.45 μm。
16. 保持烟气罩中的部分干燥。干燥的部分已准备好进行立体学。

4. 立体学

注:参见所用显微镜和软件的材料表。具有数字光圈 （NA） > 1.2 的浸入式目标将非常有用，如果需要，应使用。幻灯片应根据基因型或治疗组进行分组并编码。一项研究的完整立体学应由同一人进行，而执行立体学的人应对被检查的^1、12、13的个别幻灯片或小组的身份视而不见。

1. 在软件中打开一个新的研究。（文件 > 新研究）将打开"学习初始化"对话框。使用多级（基于分数）（图2A）填写学习信息。
2. 双击"参数"下的"音量"，这将打开"音量"对话框。命名感兴趣的特征并选择"区域点计数"探测器。单击"下一步"。
3. 双击下一个参数"长度"。
   1. 提供要素的名称（例如，"L"）选择"球体"探测，然后单击"下一步"。
4. 接下来，单击"学习初始化"对话框，该对话框将打开"案例初始化"框。填写案例信息。在开始研究之前，必须对组进行编码。节数是从第一节开始的节数，该节包含感兴趣区域到最后一节包含感兴趣区域的部分（请参阅步骤 2.1）。截面采样间隔为 8，因为为 IHC 染色选择每⁸节。
5. 单击"下一步"将打开"探测初始化"对话框，该对话框将自动设置区域选择和体积估计的最低放大倍数。确认设置，并检查是否可以在选定的较低放大倍率上识别感兴趣的区域。双击"体积"，为区域体积分数每点填充 50，000 μm^3。单击"完成"。
6. 在"对象（高）放大"下，将长度设置为63倍或100倍。双击"长度"以打开"长球"对话框，并将球体的直径设置为 10 μm。
   注: 防护区应根据各路段的实际厚度确定。操作员必须检查多个站点的各路段的厚度，以避免任何损坏。如有必要，根据截面厚度调整防护区厚度。
7. 为帧区域、帧高度、防护区域和帧间距设置适当的值。
   注: 这些值取决于研究区域中对象轮廓（光纤）的异质性。帧面积为400μm2，帧高度为10μm，防护区为2μm，帧间距为300μm，为NBM中的光纤长度估计提供了可接受的CE值。在进行下一个案例之前，必须使用这些值进行试验性研究。
8. 按照软件在每个步骤后提供的说明进行操作。说明显示为对话框和/或屏幕底部。
9. 插入第 1 节。
10. 在低放大倍率（5倍）下，通过在国家/地区周围设置任意边界来定义感兴趣的区域。单击视频窗口左角的"下一步"按钮。按照说明操作，确认所有绿点都位于国家/地区。可以通过单击点来包括或排除这些点。
    注: NBM 周围没有明确的设定边界。选择主要是调查员定义的。NBM 的 ChAT® 胆碱能神经元可在内部胶囊 （ic） 和球状苍白 （GP） 中观察到。在此协议中，CAT® 胆碱能神经元及其投影（纤维）和整个GP的ic包含在NBM中（图1D）。
11. 按照说明，以电流分数进行光纤测量，更改为 63 倍。"截面厚度"对话框出现在屏幕上。设置截面的顶部和底部表面以测量截面的实际厚度。应使用手动 Z 轴移动。单击"完成"。
    注: 如果区域中没有光纤，则可以跳过该步骤以转到下一个分数位置。
12. 在截面的帧高度中从上到下缓慢移动 Z 轴，并在虚拟球体探头表面上标记所有相交的光纤（图 3）。完成后，单击"下一步"转到下一个位置。
13. 完成所有分数后，软件将要求插入下一节。对组织的所有六个或七个部分重复步骤 4.9_4.12。
    1. 最后，软件将生成显示 CE 值的案例的结果（图 4）。如果 CE 可以接受，则继续下一种情况。文件 > 新案例.如果 CE 不可接受（图 4A），该软件会提供更改某些参数的建议。在许多情况下，减小帧间距会将 CE 值减小到可接受的范围（图 4B）。
14. 完成所有案例后，为每个案例和组生成结果 （文件 > 结果）。

5. 分析和统计

1. 该软件提供每个样本和每个组的数据。软件本身计算 SSF、ASF 和 TSF 等分数，并提供参考区域中光纤的总参考量 （V_REF）和总长度 （L）（本例中为 NBM）（图4B）。导出数据，并将数据保存或复制到组分析之间选择的统计软件。表 1显示了用于统计分析的典型结果数据。通过将总光纤长度与参考体积分开来分析光纤密度 （Lv）。

结果

代表性结果如图1和图5所示。被解码为APpswe群（APP）的C组，其纤维长度（图5B）和纤维长度密度（图5C）与其野生型（WILD）杂物相比，具有显著降低。结果表明，所分析的两组国家/地区NBM的体积无显著差异（图5A）。

讨论

在这里，我们演示了一种使用空间球（球）探测器估计NBM中胆碱能纤维密度的方法。此探头估计了感兴趣区域的总光纤长度。总长度可以除以区域的体积来获得光纤密度。为了估计区域的体积，使用了卡瓦利埃里点计数方法。Cavalieri 点计数方法是对任何区域的 3D 参考体积的无偏和高效的估计。该方法通过计算点（表示面积分数）计算截面上截面上的面积估计值，然后乘以分析^{为 11}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABC kit	Vector Laboratories	PK6100
Anti-ChAT Antibody	Millipore, MA, USA	AB144P
Bovine anti-goat IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Bovine Serum, Adult	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Enhanced DAB peroxidase substrate solution
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056