Estimation stéréologique de la longueur de la fibre cholinergique dans le noyau Basalis de Meynert du cerveau de souris

Résumé

La longueur de fibre neuronale dans une structure tridimensionnelle d'une région de cerveau est un paramètre fiable pour quantifier l'intégrité structurale neuronale spécifique ou la dégénérescence. Cet article détaille une méthode de quantification stéréologique pour mesurer la longueur de fibre cholinergique dans le basalis de noyau de Meynert chez les souris comme exemple.

Résumé

La longueur des axones cholinergiques ou autres neurones dans diverses régions du cerveau sont souvent corrélées avec la fonction spécifique de la région. La stéréologie est une méthode utile pour quantifier les profils neuronaux de diverses structures cérébrales. Ici, nous fournissons un protocole de stéréologie basé sur un logiciel pour estimer la longueur totale des fibres cholinergiques dans le noyau basalis de Meynert (NBM) du cerveau avant basal. La méthode utilise une sonde de boule d'espace pour des estimations de longueur. Les fibres cholinergiques sont visualisées par l'immunostaining d'acétyltransferase de choline (ChAT) avec le système de détection de peroxidase-diaminobenzidine de raifort (HRP-DAB). Le protocole de coloration est également valide pour l'estimation des fibres et des numéros de cellules dans diverses régions du cerveau à l'aide d'un logiciel de stéréologie. Le protocole de stéréologie peut être employé pour l'estimation de n'importe quels profils linéaires tels que les fibres cholinoceptives, les fibres dopaminergiques/catécholaminergiques, les fibres sérotonergiques, les processus d'astrocyte, ou même les profils vasculaires.

Introduction

Les estimations quantitatives de la longueur et/ou de la densité des fibres nerveuses dans le cerveau sont des paramètres importants des études neuropathologiques. La longueur des axones cholinergiques, dopaminergiques et sérotoninergiques dans diverses régions de cerveau sont souvent corrélées avec les fonctions spécifiques de la région. Étant donné que la distribution de ces axones est généralement hétérogène, la stéologie basée sur la conception est utilisée pour éviter les biais lors de l'échantillonnage. La sonde de boule d'espace de la stéréologie a été conçue pour fournir des mesures efficaces et fiables des structures de ligne-comme telles que les fibres neuronales dans une région d'intérêt^1. La sonde fait une sphère virtuelle qui est imposée systématiquement dans le tissu pour mesurer les intersections de ligne avec la surface de la sonde. Parce qu'il est impossible de mettre des sondes de sphère dans le tissu pour analyse, le logiciel disponible dans le commerce fournit une sphère virtuelle en trois dimensions (3D), qui est essentiellement une série de cercles concentriques de différents diamètres qui représentent la surface de la sonde sphère.

La neurodégénérescence cholinergique sélective est l'une des caractéristiques constantes de la maladie d'Alzheimer (MA)^2,3,4. La transmission cholinergique dysfonctionnelle est considérée comme un facteur causal pour le déclin cognitif dans la MA. Le dysfonctionnement cholinergique est également évident dans beaucoup d'autres désordres mentaux tels que Parkinson, dépendance, et schizophrénie. Différents aspects de la neurodégénérescence cholinergique sont étudiés dans les modèles animaux (par exemple, réduction de l'acétylcholine⁵, protéine ChAT⁶, neurodégénérescence des fibres cholinergiques à proximité des plaques amyloïdes⁶, et diminution des fibres cholinergiques et des varicosities synaptiques^7,8). On croit que la dégénérescence des fibres a lieu plus tôt que la perte neuronale, parce que la perte neuronale cholinergique n'est pas toujours observée dans les études. La plupart des neurones cholinergiques sont dans le cerveau avant basal et le tronc cérébral, et leurs axones projettent à diverses régions du cerveau telles que les cortices et l'hippocampe. NBM est situé dans le cerveau avant basal et s'est avéré être l'une des zones cérébrales couramment affectées dans la MA.

La méthode fractionnée de la stérilologie est basée sur l'échantillonnage aléatoire systématique d'un tissu à plusieurs niveaux. La fraction d'échantillonnage de section (SSF) est l'échantillonnage systématique non informatisé des sections pour la méthode fractionnée de la stérilisation. La fraction d'échantillonnage de surface (ASF) est la fractionnement d'une zone de la région d'intérêt dans la section. La fraction d'échantillonnage d'épaisseur (TSF) est la fractionnement de l'épaisseur d'une section. La sonde de boules spatiales nous permet de quantifier les profils d'intérêt dans une sphère 3D à des endroits fractionnés. Ici, nous utilisons une sonde de boule d'espace pour l'estimation de la longueur totale des fibres cholinergiques dans le NBM du cerveau de souris pour illustrer les procédures. Le protocole actuel fournit des détails sur le traitement des tissus, les méthodes d'échantillonnage pour la stérilologie, la coloration immunohistochimique à l'aide de l'anticorps ChAT, et la stéréologie impartiale pour estimer la longueur des fibres cholinergiques et la densité des fibres dans le NBM du cerveau de souris.

Protocole

Toutes les procédures d'utilisation de ces animaux ont été approuvées par le Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Des souris de dix-huit mois surexprimant la protéine bêta-amyloïde mutante suédoise (APPswe) et leurs compagnons de litière C57/BL6 WT ont été utilisés pour les expériences. Les détails de l'élevage et du génotypage sont donnés dans He et coll.⁸.

1. Perfusion et traitement des tissus

1. Anesthésiez les souris à l'aide d'une injection intrapéritonéale avec de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg). Pincer les orteils pour confirmer un manque de réponse avant de continuer⁹.
2. Perfuse transcardialement avec 50 ml de glace froide 0,1 M De dulbecco phosphate tamponné saline (DPBS) suivie de 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans 0,1M tampon de phosphate (PB)¹⁰.
   CAUTION: PFA est toxique. Utilisez de l'équipement de protection individuelle (EPI) lorsque vous travaillez avec PFA.
3. Enlever les cerveaux¹⁰ et immerger dans 4% de PFA dans 0.1 M PB à 4 oC pour la postfixation pendant 24 h. Laver avec DPBS 3x.
4. Changement à 15% solution de saccharose dans 0.1 DPBS du jour au lendemain, puis 30% solution de saccharose dans 0,1 M DPBS pour un autre 48 h à 4 oC.
5. Retirer le tissu de la solution de saccharose et congeler dans une chambre cryotome préfixée à une température de -20 oC. Les échantillons congelés peuvent être stockés dans des tubes scellés à -80 oC jusqu'à la section.
6. Intégrer les tissus dans un milieu d'intégration optimal de température de coupe (voir Tableau des matériaux)et monter sur un disque de spécimen. Couper des sections en série de 30 m d'épaisseur dans un plan coronal à l'aide d'un cryotome et recueillir toutes les sections par conséquent dans 24 plaques de culture de puits remplies de solution cryoprotectrice (30 % de glycérol, 30 % d'éthylène glycol, 40 % de DPBS; Figure 1A-C). Conserver dans un congélateur de -20 oC.
   REMARQUE : Les sections plus épaisses (p. ex., 50 m) sont préférables lorsque c'est possible. Assurez-vous que les sections sont maintenues en ordre de coupe et que toutes les sections sont complètement cryoprotectrices. Une plaque de puits 96 peut être utilisée comme alternative à 24 plaques de puits pour recueillir des sections.
7. Couvrir les puits d'un scellant plat pour éviter l'évaporation et le séchage. Conserver les assiettes à -20 oC jusqu'à ce qu'elles soient utilisées davantage. Les sections stockées à -20 oC sont stables pendant plusieurs mois pour l'immunohistochimie ChAT.

2. Sélection systématique de sections pour le CSI

REMARQUE : Une étude pilote devrait être effectuée pour connaître le nombre total de sections requises pour obtenir un coefficient d'erreur acceptable (CE). La valeur CE est l'expression de la quantité totale d'erreur dans la procédure d'échantillonnage. La valeur la plus basse représente l'erreur minimale et une valeur CE inférieure à 0,1 est considérée comme acceptable par le logiciel utilisé ici (voir tableau des matériaux)¹¹.

1. Identifiez les premières et dernières sections pour chaque cerveau en comparant les caractéristiques morphologiques avec un atlas standard du cerveau de souris comme Franklin et Paxinos. NBM commence à bregma -0.0mm et se termine à -1.6 mm. Par conséquent, environ 50 sections contiennent NBM. Le nombre total de sections est l'un des paramètres requis pendant la stérilisation. La sélection de chaque section de 8^e (SSF - 1/8) a donné un total de 6-7 sections pour l'analyse et a donné un CE acceptable pour l'estimation de volume et l'estimation de longueur de fibre dans notre étude pilote.
2. Commencer au hasard par l'une des huit premières sections, puis échantillonner systématiquement chaque 8^e section jusqu'à la dernière section postérieure contenant NBM (Figure 1C).

3. Immunohistochimie

1. Transférer les sections cryoconservées à température ambiante dans un tampon de phosphate (PB) de 0,1 m, puis 0,1 million de phosphate dans 6 plaques de puits.
2. Laver 3x en PB.
3. Incuber en 0,3% H₂O₂ dans le méthanol pendant 15 min.
4. Laver 3x dans la saline tris-tamponnée (TBS).
5. Incuber dans 0.25% Triton X-100 dans TBS pendant 30 min.
6. Bloc avec 10% de sérum bovin normal (NBS) dans 0.1% Triton X-100 dans TBS pendant 30 min.
7. Incuber avec une dilution de 1:1.000 de chèvreantihumain ChAT anticorps primaires (voir Tableau des matériaux) dans le SCT avec 0,1% Triton X-100 et 1% NBS pour 48 h à 4 oC.
8. Laver 3x dans le SCT à température ambiante. Effectuer toute l'incubation et le lavage à température ambiante.
9. Incuber avec des anticorps secondaires anti-chèvres bovins biotinylated (voir Tableau des matériaux) pendant 1 h.
10. Laver 3x dans le SCT.
11. Incuber avec le complexe avidin-biotin-peroxidase (voir Tableau des matériaux).
12. Laver 3x dans le SCT.
13. Développer à l'aide d'une solution améliorée de substrat de peroxidase DAB (voir Tableau des matériaux) selon les recommandations du fabricant.
    CAUTION: DAB est un cancérogène suspecté. Il est toxique par contact et par inhalation. Utilisez PPE lorsque vous travaillez avec DAB.
14. Laver la section une couple de fois avec de l'eau distillée et garder dans tris pH 7,6.
15. Montez les sections sur les toboggans gélatinisés. Toutes les sections d'un tissu peuvent être posées sur la même diapositive. Sécher à l'air les sections, déshydrater 2x pendant 5 min chacun e avec 70%, 90%, 95%, et 100% d'éthanol, puis effacer les sections avec deux lavages de xylène de 10 min. Coverslip les sections à l'aide du support de montage (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE : Le temps de traitement de la déshydratation et du dégagement affecte l'épaisseur des sections. Par conséquent, les mêmes conditions doivent être utilisées pour toutes les sections. Dans la présente étude, la valeur moyenne de l'épaisseur finale était de 21,11 à 0,45 m.
16. Gardez les sections du capot de fumée à sécher. Les sections sèches sont prêtes pour la sériologie.

4. Stérilologie

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour le microscope et le logiciel utilisé. Un objectif d'immersion avec une ouverture numérique (NA) 'gt; 1.2 sera utile et devrait être utilisé si nécessaire. Les diapositives doivent être regroupées selon le génotype ou le groupe de traitement et codées. La stéréologie complète d'une étude doit être effectuée par la même personne et la personne qui effectue la séstérilogie doit être aveugle à l'identité des diapositives individuelles ou du groupe examiné^1,12,13.

1. Ouvrez une nouvelle étude dans le logiciel. (Fichier 'gt; Nouvelle Étude). Une boîte de dialogue 'Study Initialization' s'ouvrira. Remplissez l'information de l'étude, à l'aide de multi-niveaux (Fraction Based) (Figure 2A).
2. Double clic sur 'Volume' sous Paramètres, qui ouvrira la boîte de dialogue volume. Nommez la fonction d'intérêt et sélectionnez 'Region Point Counting' sonde. Cliquez ensuite.
3. Double clic sur le paramètre suivant, 'Longueur'.
   1. Fournir un nom de la fonctionnalité (par exemple,'L') Sélectionnez 'Sphere' sonde et cliquez sur Suivant.
4. Ensuite, cliquez sur la boîte de dialogue 'Study Initialization', qui ouvrira la caseInitialization' boîte. Remplissez les informations de cas. Les groupes doivent être codés avant de commencer l'étude. Le nombre total de sections est le nombre de sections allant de la première section contenant la zone d'intérêt à la dernière section contenant la zone d'intérêt (voir l'étape 2.1). L'intervalle d'échantillonnage de section est de huit, parce que chaque section de 8^e a été sélectionnée pour la coloration du CSI.
5. Clicking Next ouvre la boîte de dialogue 'Probe Initialization', qui définira automatiquement le grossissement le plus bas pour la sélection de la région et l'estimation du volume. Confirmez les paramètres et vérifiez si la région d'intérêt peut être identifiée au grossissement inférieur sélectionné. Double cliquez sur 'Volume' et remplissez 50 000 m³ par point pour la fraction de volume de la région. Cliquez sur Fait.
6. Sous objet (Haute) Grossissement, réglé Longueur à 63x ou 100x. Double clic sur 'Longueur' pour ouvrir la boîte de dialogue Longueur-Sphère et définir le diamètre de la sphère à 10 m. Cliquez sur fait.
   REMARQUE : La zone de protection doit être déterminée en fonction de l'épaisseur réelle des sections. L'opérateur doit vérifier l'épaisseur des sections à plusieurs endroits pour éviter tout dommage. Si nécessaire, ajuster l'épaisseur de la zone de protection en fonction de l'épaisseur de la section.
7. Définir les valeurs appropriées pour la zone du cadre, la hauteur du cadre, la zone de protection et l'espacement du cadre.
   REMARQUE : Ces valeurs dépendent de l'hétérogénéité des profils d'objets (fibres) dans la région d'étude. Une zone de trame de 400 m^2,une hauteur de cadre de 10 m, une zone de protection de 2 m et un espacement de 300 m donnent des valeurs CE acceptables pour l'estimation de la longueur des fibres dans NBM. Une étude pilote doit être effectuée avec ces valeurs avant de se diriger vers le cas suivant.
8. Suivez les instructions fournies par le logiciel après chaque étape. Les instructions apparaissent soit sous forme de boîte de dialogue et/ou en bas de l'écran.
9. Insérer la section 1.
10. À faible grossissement (5x), définir la région d'intérêt en faisant une frontière arbitraire autour de la NBM. Cliquez sur le bouton Suivant dans le coin gauche de la fenêtre vidéo. Suivez les instructions et confirmez que tous les points verts sont dans le NBM. Les points peuvent être inclus ou exclus en cliquant sur les points.
    REMARQUE : Il n'y a pas de limite définie et définie autour de la NBM. La sélection est principalement définie par les enquêteurs. Les neurones cholinergiques ChATMD de la NBM peuvent être observés dans la capsule interne (ic) et le globus pallidus (GP). Dans ce protocole, l'ic avec les neurones cholinergiques ChAT et leurs projections (fibres) et gp entier est inclus dans le NBM (Figure 1D).
11. Suivez les instructions et passer à 63x pour les mesures de fibres à la fraction actuelle. La boîte de dialogue 'Section Thickness'apparaît à l'écran. Définir la surface supérieure et inférieure de la section pour mesurer l'épaisseur réelle de la section. Le mouvement manuel de l'axe Z doit être utilisé. Cliquez sur Fait.
    REMARQUE: S'il n'y a pas de fibre dans la zone, l'étape peut être ignorée pour aller à l'emplacement fraction suivante.
12. Déplacez l'axe Z lentement de haut en bas dans la hauteur du cadre de la section et marquez toutes les fibres qui se croisent à la surface de la sonde de la sphère virtuelle (Figure 3). Une fois terminé, cliquez ensuite pour passer à l'emplacement suivant.
13. Après avoir terminé toutes les fractions, le logiciel demandera d'insérer la section suivante. Répétez les étapes 4.9-4.12 pour les six ou sept sections du tissu.
    1. À la fin, le logiciel générera un résultat pour le boîtier montrant les valeurs CE (Figure 4). Si l'EC est acceptable, passez à l'affaire suivante. Fichier 'gt; Nouvelle affaire. Si le CE n'est pas acceptable (Figure 4A), le logiciel fournit des recommandations pour modifier certains paramètres. Dans de nombreux cas, la diminution de l'espacement du cadre réduit les valeurs CE à une plage acceptable (figure 4B).
14. Après avoir terminé tous les cas, générer des résultats pour chaque cas et le groupe (Fichier 'gt; Résultats).

5. Analyse et statistiques

1. Le logiciel fournit des données pour chaque échantillon et chaque groupe. Le logiciel lui-même calcule des fractions telles que SSF, ASF et TSF, et fournit le volume de référence total (V_REF) et la longueur totale (L) des fibres dans la région de référence (dans ce cas, NBM) (Figure 4B). Exporter les données et enregistrer ou copier vers le logiciel statistique de choix pour l'analyse de groupe entre. Le tableau 1 montre les données de résultats typiques pour l'analyse statistique. Analyser la densité des fibres (Lv) en divisant la longueur totale de la fibre avec le volume de référence.

Résultats

Les résultats représentatifs sont présentés dans le tableau 1 et la figure 5. Le groupe C, qui a été décodé en tant que groupe APPswe (APP), avait une longueur de fibre significativement inférieure (figure 5B) et la densité de longueur de fibre (figure 5C) par rapport à leurs compagnons de litière de type sauvage (WILD). Les résultats ont montré qu'il n'y avait pas de ...

Discussion

Ici, nous démontrons une méthode pour estimer la densité des fibres cholinergiques dans le NBM à l'aide d'une boule spatiale (sphère) sonde. Cette sonde estime la longueur totale de la fibre dans la région d'intérêt. La longueur totale peut être divisée par le volume de la région pour obtenir la densité de fibre. Pour estimer le volume de la région, la méthode de comptage des points Cavalieri a été utilisée. La méthode de comptage des points Cavalieri est un estimateur impartial et efficace d'un volume ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABC kit	Vector Laboratories	PK6100
Anti-ChAT Antibody	Millipore, MA, USA	AB144P
Bovine anti-goat IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Bovine Serum, Adult	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Enhanced DAB peroxidase substrate solution
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056