JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Длина нейронного волокна в трехмерной структуре области мозга является надежным параметром для количественной оценки конкретных нейрональных структурных целостности или дегенерации. В этой статье подробно стереологический метод количественной оценки для измерения длины холинергического волокна в ядре базалис Мейнерт у мышей в качестве примера.

Аннотация

Длина холинергических или других нейрональных аксонов в различных областях мозга часто коррелирует с конкретной функцией региона. Стереология является полезным методом количественной оценки нейрональных профилей различных структур мозга. Здесь мы предоставляем программно-основанный протокол стереологии для оценки общей длины холинергических волокон в ядре базалис Айнерт (NBM) базального передних мозгов. Метод использует зонд космического шара для оценки длины. Холинергические волокна визуализированы холиновой ацетилтрансферазой (ChAT) иммуностоинг с хреном пероксидаза-диаминобензидин (HRP-DAB) системы обнаружения. Протокол окрашивания также действителен для оценки клетчатки и клеточного номера в различных областях мозга с помощью программного обеспечения стереологии. Протокол стереологии может быть использован для оценки любых линейных профилей, таких как холиноцептивные волокна, дофаминергические/катехоламинговые волокна, серотониновые волокна, астроцитные процессы или даже сосудистые профили.

Введение

Количественные оценки длины и/или плотности нервных волокон в головном мозге являются важными параметрами невропатологических исследований. Длина холинергических, дофаминергических и серотонинергических аксонов в различных областях мозга часто коррелирует с конкретными функциями региона. Поскольку распределение этих аксонов, как правило, неоднородно, стереология на основе дизайна используется для предотвращения предвзятости во время отбора проб. Космический шар зонд стереологии был разработан, чтобы обеспечить эффективные и надежные меры линии, как структуры, такие как нейронные волокна в регионе, представляющих интерес1. Зонд делает виртуальную сферу, которая систематически навязывается в ткани для измерения пересечений линий с поверхностью зонда. Поскольку невозможно поместить сферы зондов в ткани для анализа, коммерчески доступное программное обеспечение обеспечивает виртуальную трехмерную (3D) сферу, которая в основном представляет собой ряд концентрических кругов различных диаметров, представляющих поверхность сферного зонда.

Селективная холинергическая нейродегенерация является одной из последовательных особенностей болезни Альцгеймера (AD)2,3,4. Дисфункциональная холинергическая передача считается причинным фактором для когнитивных снижение АД. Холинергическая дисфункция также проявляется во многих других психических расстройствах, таких как болезнь Паркинсона, наркомания и шизофрения. Различные аспекты холинергической нейродегенерации изучаются в животных моделях (например, снижение ацетилхолина5, ChAT белка6, холинергического волокна нейродегенерации в непосредственной близости от амилоидных бляшек6, и снижение холинергических волокон и синаптических варикозы7,8). Дегенерация волокна, как полагают, происходит раньше, чем потеря нейронов, потому что холинергические потери нейронов не всегда наблюдается в исследованиях. Большинство холинергических нейронов находятся в базальном предмозге и стволе мозга, и их аксоны проекта различных областях мозга, таких как кортики и гиппокампа. NBM расположен в базальном предмозге и оказался одним из часто пострадавших областей мозга в AD.

Метод фракционности стереологии основан на систематической случайной выборке ткани на нескольких уровнях. Раздел выборки фракции (SSF) является некомпьютерным основе систематической выборки разделов для фракционного метода стереологии. Фракция выборки (ASF) является фракцией области региона, интересуемого в разделе. Толщина фракции выборки (TSF) является фракция толщины раздела. Космический шар зонд позволяет нам количественно профили интерес в 3D сфере в дробных местах. Здесь мы используем космический шар зонд для оценки общей длины холинергических волокон в NBM мыши мозга, чтобы проиллюстрировать процедуры. Текущий протокол содержит подробную информацию о обработке тканей, методы отбора проб для стереологии, иммуногистохимическое окрашивание с использованием антитела CHAT, и беспристрастной стереологии для оценки длины холинергического волокна и плотности волокна в NBM мыши мозга.

протокол

Все процедуры для использования этих животных были одобрены Канзас-Сити ветеранов дел медицинский центр институционального ухода за животными и использования комитета. Восемнадцатимесячные мыши, переэкспрессирующие шведский метаант бета-амилоидный белок-предшественник (APPswe) и их c57/BL6 WT littermates, были использованы для экспериментов. Подробная информация о размножении и генотипирования приведена в He et al.8.

1. Перфузия и обработка тканей

  1. Анестезия мышей с помощью интраперитонеальной инъекции с кетамина (100 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг). Пинч-суслик, чтобы подтвердить отсутствие ответа, прежде чем продолжить9.
  2. Транскардиально perfuse с 50 мл ледяного холода 0.1M Dulbecco в фосфатбуферных солей (DPBS) следуют 4% параформальдегида (PFA) в 0.1M фосфатбуфер (PB)10.
    ВНИМАНИЕ: ПФА является токсичным. Используйте средства индивидуальной защиты (PPE) при работе с PFA.
  3. Удалитьмозги 10 и погрузить в 4% PFA в 0,1 М ПБ при 4 кв кв для постфиксации для 24 ч. Вымойте с DPBS 3x.
  4. Изменение до 15% сахарозы раствор в 0,1 DPBS ночь, а затем 30% сахарозы раствор в 0,1 M DPBS еще 48 ч при 4 c.
  5. Удалить ткань из раствора сахарозы и заморозить в криотомкамеры предустановленной температуры -20 градусов по Цельсию. Замороженные образцы могут храниться в герметичных трубках при -80 градусах Цельсия до сечения.
  6. Встраивайте ткани в оптимальную температурную встраиваемую среду (см. Таблицу Материалов)и монтируется на диске образца. Вырезать серийные 30 мкм толщиной разделов в корональной плоскости с помощью криотоме и собрать все разделы, следовательно, в 24 хорошо культуры пластин заполнены криопротекторным раствором (30% глицерола, 30% этиленгликоль, 40% DPBS; Рисунок 1A-C). Хранить в морозильной камере -20 градусов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые секции (например, 50 мкм) предпочтительнее, когда это возможно. Убедитесь, что секции находятся в порядке резки и все разделы полностью в криопротекторе. Пластина 96 скважин может быть использована в качестве альтернативы 24 скважинам для сбора секций.
  7. Накройте колодцы пластинным уплотнителем для предотвращения испарения и высыхания. Храните тарелки при -20 градусах по Цельсию до дальнейшего использования. Разделы, хранящиеся при -20 градусах Цельсия, стабильны в течение нескольких месяцев для иммуногистохимии ChAT.

2. Систематический отбор секций для IHC

ПРИМЕЧАНИЕ: Следует провести экспериментальное исследование для того, чтобы узнать общее количество разделов, необходимых для достижения приемлемого коэффициента ошибки (СЕ). Значение CE является выражением общего количества ошибок в процедуре выборки. Наименьшее значение представляет собой минимальную ошибку, а значение CE ниже 0,1 считается приемлемым программным обеспечением, используемым здесь (см. Таблица материалов)11.

  1. Определите первый и последний разделы для каждого мозга, сравнив морфологические особенности со стандартным атласом мозга мыши, таким как Франклин и Паксинос. NBM начинается с bregma -0.0mm и заканчивается на -1.6 мм. Таким образом, около 50 разделов содержат NBM. Общее количество секций является одним из параметров, необходимых при стереологии. Выбор каждого8-го раздела (SSF No 1/8) дал в общей сложности 6-7 разделов для анализа и дал приемлемый CE как для оценки объема, так и для оценки длины волокна в нашем экспериментальном исследовании.
  2. Случайно начните с одного из первых восьми разделов, а затем системно образца каждый8-й раздел до последнего заднего раздела, содержащего NBM(Рисунок 1C).

3. Иммуногистохимия

  1. Перенесите криоконсервированные секции на комнатную температуру в криопротектор, а затем 0,1 М фосфатный буфер (ПБ) в 6 колодцах.
  2. Вымойте 3x в ПБ.
  3. Инкубировать в 0,3% Н2O2 в метаноле в течение 15 мин.
  4. Вымойте 3x в Трис-буферированный солен (TBS).
  5. Инкубировать в 0,25% Triton X-100 в TBS в течение 30 мин.
  6. Блок с 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота (NBS) в 0,1% Тритон X-100 в TBS в течение 30 мин.
  7. Инкубировать с 1:1,000 разбавления козы анти-человеческих ChAT первичных антител (см. Таблица материалов) в TBS с 0,1% Тритон X-100 и 1% NBS для 48 ч при 4 C.
  8. Вымойте 3x в TBS при комнатной температуре. Выполните все дальнейшие инкубации и мытья при комнатной температуре.
  9. Инкубировать с биотинилатами ячеек антикозла вторичного антитела (см. Таблица материалов) на 1 ч.
  10. Вымойте 3x в TBS.
  11. Инкубировать с комплексом avidin-biotin-peroxidase (см. Таблица материалов).
  12. Вымойте 3x в TBS.
  13. Разрабатывайте с использованием усовершенствованного решения подложки DAB peroxidase (см. Таблицу материалов)в соответствии с рекомендациями производителя.
    ВНИМАНИЕ: DAB является подозреваемым канцерогеном. Он токсичен при контакте и вдыхании. Используйте СИЗ при работе с DAB.
  14. Вымойте секцию пару раз дистиллированной водой и держите в Tris рН 7,6.
  15. Смонтировать участки на желатинированных горках. Все секции из одной ткани можно положить на один слайд. Воздух высушить секции, обезвоживать 2x на 5 мин каждый с 70%, 90%, 95%, и 100% этанола, а затем очистить разделы с двумя 10 мин ксилена вымает. Обложка разделов с помощью монтажа среды (см. Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время обработки обезвоживания и очистки влияет на толщину секций. Таким образом, для всех разделов следует использовать одни и те же условия. В текущем исследовании среднее значение конечной толщины составило 21,11 и 0,45 мкм.
  16. Держите разделы в дым капот высохнуть. Сухие секции готовы к стереологии.

4. Стереология

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу материалов для микроскопа и программного обеспечения, используемого. Цель погружения с числовой диафрагмой (NA) 1,2 будет полезна и должна быть использована в случае необходимости. Слайды должны быть сгруппированы в соответствии с генотипом или группой лечения и закодированы. Полная стереология для одного исследования должна быть выполнена одним и тем же человеком, и лицо, выполняя стереологию, должно быть слепым к идентичности отдельных слайдов или группы, рассмотренной1,12,13.

  1. Откройте новое исследование в программном обеспечении. (Файл (Новое исследование). Откроется диалоговая будка'Инициализация исследования'. Заполните информацию об исследовании, используя Multi-level (Фракция на основе) (Рисунок 2A).
  2. Дважды нажмите на 'Том' под параметрами, который откроет поле диалога тома. Назовите интересующую объект и выберите зонд'Region Point Counting'. Нажмите далее.
  3. Дважды щелкните по следующему параметру:'Длина'.
    1. Укажите название функции (например,'L') Выберите 'Sphere' зонд и нажмите Далее.
  4. Далее нажмите на диалоговую будку'Инициализация исследования',которая откроет полеинициализации случая. Заполните информацию по делу. Группы должны быть закодированы перед началом исследования. Общее количество разделов — это количество разделов, начиная от первого раздела, содержащего интересуемые области, до последнего раздела, содержащего область интереса (см. шаг 2.1). Интервал отбора проб в секции составляет восемь, так как каждый8-й раздел был выбран для окрашивания IHC.
  5. Clicking Next открывает диалоговую коробку'Probe Initialization',которая автоматически устанавливает наименьшее увеличение для выбора региона и оценки объема. Подтвердите настройки и проверьте, можно ли определить область интереса при выбранном нижнем увеличении. Дважды нажмите на"Объем" и заполните 50 000 мкм3 на точку для фракции объема региона. Нажмите готово.
  6. Под объектом (Высокое) Увеличение, установить длина на 63x или 100x. Дважды нажмите на 'Длина', чтобы открыть поле диалога Длина-Сфера и установить диаметр сферы до 10 мкм. Нажмите готово.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Охранная зона должна определяться на основе фактической толщины секций. Оператор должен проверить толщину секций на нескольких участках, чтобы избежать каких-либо повреждений. При необходимости отрегулируйте толщину охранной зоны на основе толщины секции.
  7. Установите соответствующие значения для площади кадра, высоты кадра, зоны охраны и интервала между кадрами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения зависят от неоднородности профилей объектов (волокон) в области исследования. Площадь рамы 400 мкм2,высота рамы 10 мкм, охранная зона 2 мкм, а интервал между рамой 300 мкм дает приемлемые значения CE для оценки длины волокна в NBM. Пилотное исследование должно быть выполнено с этими значениями, прежде чем перейти к следующему случаю.
  8. Следуйте инструкциям, предоставленным программным обеспечением после каждого шага. Инструкции отображаются либо как диалоговая коробка и/или в нижней части экрана.
  9. Вставьте раздел 1.
  10. При низком увеличении (5x) определяют область интереса, делая произвольную границу вокруг НБМ. Нажмите кнопку «Следующая» в левом углу окна видео. Следуйте инструкциям и подтвердить все зеленые точки в NBM. Точки могут быть включены или исключены, нажав на точки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует нет определенной, установленной границы вокруг NBM. Выбор в основном следователь определены. ChAT' холинергических нейронов NBM можно наблюдать во внутренней капсуле (ic) и globus pallidus (GP). В этом протоколе, IC с ChAT' холинергических нейронов и их проекции (волокна) и весь ГП включен в NBM(Рисунок 1D).
  11. Следуйте инструкциям и изменить на 63x для измерения волокна на текущей фракции. На экране появляется диалоговая коробка'Толстостьраздела'. Установите верхнюю и нижнюю поверхность секции для измерения фактической толщины секции. Следует использовать ручное движение оси. Нажмите на готовок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет волокна в области, шаг может быть пропущен, чтобы перейти к следующему местом фракции.
  12. Медленно переместите ось сверху вниз в раме высоты секции и отметьте все пересекающиеся волокна на поверхности зонда виртуальной сферы(рисунок 3). После этого нажмите Далее, чтобы перейти к следующему местоположению.
  13. После завершения всех фракций, программное обеспечение будет просить, чтобы вставить следующий раздел. Повторите шаги 4.9-4.12 для всех шести или семи секций ткани.
    1. В конце, программное обеспечение будет генерировать результат для случая, показывающие значения CE(рисунок 4). Если CE является приемлемым, перейдите к следующему делу. Файл (нью-корпус) . Если CE не является приемлемым(рисунок 4A), программное обеспечение предоставляет рекомендации по изменению некоторых параметров. Во многих случаях уменьшение интервала между кадрами уменьшает значения CE до приемлемого диапазона(рисунок 4B).
  14. После завершения всех случаев, генерировать результаты для каждого случая и группы (Файл

5. Анализ и статистика

  1. Программное обеспечение предоставляет данные для каждого образца и каждой группы. Программное обеспечение само вычисляет фракции, такие как SSF, ASF и TSF, и обеспечивает общий объем ссылки (VREF) и общую длину (L) волокон в референс-регионе (в данном случае, NBM) (Рисунок 4B). Экспортируйте данные и сохраняя или копируя статистическое программное обеспечение, выборное между групповым анализом. В таблице 1 показаны типичные данные о результатах статистического анализа. Проанализируйте плотность волокна (Lv) путем деления общей длины волокна с эталонным объемом.

Результаты

Результаты представительи показаны в таблице 1 и рисунке 5. Группа C, которая была расшифрована как группа APPswe (APP), имела значительно более низкую длину волокна(рисунок 5B)и плотность длины волокна(рисунок 5C) срав?...

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем метод оценки плотности холинергических волокон в НБМ с помощью космического шара (сферы) зонда. Этот зонд оценивает общую длину волокна в интересуемом регионе. Общая длина может быть разделена по объему региона, чтобы получить плотность волокна. Для оценки объем?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами W.З.S. от Медицинской службы исследований и разработок, Департамента по делам ветеранов (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Ассоциацией Альцгеймера (NPSPAD-11-202149), и ресурсами из Биомедицинской биомедицины Среднего Запада Научно-исследовательский фонд.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ABC kitVector LaboratoriesPK6100
Anti-ChAT AntibodyMillipore, MA, USAAB144P
Bovine anti-goat IgG-BSantacruz BiotechnologySC-2347
Bovine Serum, AdultSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB9433
CryostatLieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAD5652
Ethylene GlycolSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA324558
GlycerolSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAG2025
Hydrogen PeroxideSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH1009
Immpact-DAB kitVector LaboratoriesSK4105Enhanced DAB peroxidase substrate solution
KetamineWestward Pharmaceuticals, NJ, USA0143-9509-01
MicroscopeLieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USAAF6000Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding mediumElectron Microscopy Sciences, PA, USA62550-12
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP6148
Permount mounting mediumElectron Microscopy Sciences, PA, USA17986-01
Stereologer SoftwareStereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USAStereologer2000Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAT8787
Trizma BaseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAT1503Tris base
Trizma hydrochlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAT5941Tris hydrochloride
XylazineBayer, Leverkusen, GermanyRompun
Xylenes, Histological gradeSigma-Aldrich, St. Louis, MO534056

Ссылки

  1. Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
  2. Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
  3. Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
  4. Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
  5. Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
  6. Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
  7. Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
  8. He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
  9. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  11. Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
  12. West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
  13. West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
  14. Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
  15. Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
  16. Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
  17. Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
  18. McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
  19. Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
  20. Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
  21. Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156ChATNBMIHC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены