마우스 뇌의 마이너트 핵 기저에서 콜린성 섬유 길이의 입체 추정

요약

뇌 영역의 3차원 구조 내의 뉴런 섬유 길이는 특정 뉴런 구조적 무결성 또는 변성을 정량화하는 신뢰할 수 있는 파라미터이다. 본 문서는 예를 들어 마우스에서 Meynert의 핵 기저부 내에서 해 섬유 길이를 측정하는 입체 정량화 방법을 자세히 설명합니다.

초록

다양 한 뇌 영역에서 해 또는 다른 신경 축 색의 길이 종종 영역의 특정 기능과 상관. 입체학은 다양한 뇌 구조의 신경 프로필을 정량화하는 유용한 방법입니다. 여기에서 우리는 기저 전뇌의 Meynert (NBM)의 핵 기저에 있는 해 섬유의 총 길이를 추정하기 위하여 소프트웨어 기지를 둔 입체 프로토콜을 제공합니다. 이 메서드는 길이 추정에 대 한 공간 볼 프로브를 사용 합니다. 콜린성 섬유는 고추냉이 과산화 페멀티미노벤지딘(HRP-DAB) 검출 시스템으로 면역염색콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)에 의해 가시화된다. 염색 프로토콜은 또한 입체 소프트웨어를 사용하여 다양한 뇌 영역에서 섬유 및 세포 수 추정에 유효합니다. 입체 프로토콜은 담막염 섬유, 도파민성/카테콜라미네르균 섬유, 세로토닌섬유, 성상 세포 공정 또는 혈관 프로파일과 같은 선형 프로파일의 추정에 사용될 수 있습니다.

서문

뇌의 신경 섬유의 길이 및/또는 밀도의 정량적 추정은 신경 병리학 연구의 중요한 매개 변수입니다. 다양한 뇌 영역에서 콜린성, 도파민성 및 세로토닌성 축색의 길이는 종종 이 지역의 특정 기능과 상관관계가 있습니다. 이러한 축색의 분포는 일반적으로 이기종이기 때문에, 디자인 기반 의 입체학은 샘플링 하는 동안 바이어스를 피하기 위해 사용 됩니다. 입체학의 스페이스 볼 프로브는 관심 있는 영역에서 신경 섬유와 같은 라인형 구조의 효율적이고 신뢰할 수 있는 측정을 제공하도록 설계되었습니다^1. 프로브는 조직에 체계적으로 부과되는 가상 구체를 만들어 프로브의 표면과 라인 교차점을 측정합니다. 분석을 위해 구체 프로브를 조직에 넣는 것은 불가능하기 때문에 시판되는 소프트웨어는 구 프로브의 표면을 나타내는 다양한 직경의 일련의 동심원인 가상 3차원(3D) 구를 제공합니다.

선택적 콜린성 신경변성은 알츠하이머병(AD)의 일관된 특징 중 하나이며^2,3,4. 기능 장애 해 전송 AD에 인지 감소에 대 한 원인 요인으로 간주 됩니다. 해 기능 장애는 또한 파 킨 슨 병 등 다른 많은 정신 질환에서 분명 하다, 중독, 그리고 정신 분열 증. 해 신경 변성의 다른 양상은 동물 모델에서 연구된다 (예를 들어, 아세틸 콜린 감소^5,ChAT 단백질^6,아밀로이드 플라크 부근의 해 섬유 신경 변성^6,해 섬유 및 시냅스 정맥류의 감소^7,8). 섬유 변성은 신경 손실 보다 일찍 일어날 것으로 추정 된다, 해 신경 손실 은 항상 연구에서 관찰 되지 않기 때문에. 해 신경의 대부분은 기저 전뇌와 뇌 줄기에, 그리고 그들의 축색은 코르티메와 해마와 같은 다양한 뇌 영역에 프로젝트. NBM은 기저 전뇌에 위치하고 AD에서 일반적으로 영향을받는 뇌 영역 중 하나 인 것으로 나타났습니다.

입체학의 분획기 방법은 여러 수준에서 조직의 체계적인 무작위 샘플링을 기반으로합니다. 단면 샘플링 분율(SSF)은 스테레오로지의 분획기 방법에 대한 섹션의 비컴퓨터 기반의 체계적인 샘플링이다. 영역 샘플링 분율(ASF)은 섹션에서 관심 영역의 영역의 분획입니다. 두께 샘플링 분수(TSF)는 단면두께의 분수입니다. 스페이스 볼 프로브를 사용하면 분수 위치에서 3D 구의 관심 프로파일을 정량화할 수 있습니다. 여기서 우리는 마우스 뇌의 NBM에서 해 섬유의 총 길이의 추정을 위한 공간 볼 프로브를 사용하여 절차를 설명한다. 현재 프로토콜은 조직 처리, 입체학을 위한 샘플링 방법, ChAT 항체를 이용한 면역 조직화학적 염색, 마우스 뇌의 NBM에서 콜린성 섬유 길이 및 섬유 밀도를 추정하기 위한 편견 없는 입체학에 대한 세부 정보를 제공합니다.

프로토콜

이 동물을 사용하기위한 모든 절차는 캔자스 시티 재향 군인 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 스웨덴 돌연변이 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APPswe) 및 그들의 C57/BL6 WT 리터메이트를 과발현하는 18개월 된 마우스를 실험에 사용하였다. 번식과 하노이핑에 대한 자세한 내용은 He et al.⁸.

1. 관류 및 조직 처리

1. 케타민 (100 mg /kg)과 자일라진 (10 mg / kg)으로 복강 내 주사를 사용하여 마우스를 마취하십시오. ^9를계속하기 전에 응답의 부족을 확인하기 위해 발가락을 꼬집어 .
2. ~50 mL의 얼음 차가운 0.1M 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)를 0.1M 인산완충액(PB)에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로트랜스감투한다.
   주의: PFA는 독성이 있습니다. PFA로 작업할 때는 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오.
3. 뇌^10을 제거하고 4°C에서 0.1 M PB에서 4% PFA에 담그고 24시간 동안 접착을 위해 DPBS 3x로 세척하십시오.
4. 0.1 DPBS에서 15% 자당 용액으로 하룻밤 동안 변경한 다음 0.1 M DPBS에서 30% 자당 용액을 4°C에서 또 다른 48시간 동안.
5. 자당 용액에서 조직을 제거하고 -20 °C의 온도로 미리 설정된 저온 층 챔버에서 동결합니다. 냉동 시료는 단면화될 때까지 -80°C에서 밀봉된 튜브에 보관할 수 있습니다.
6. 최적의 절삭 온도 임베딩 매체에 조직을 포함하고(재료 표참조) 시편 디스크에 장착합니다. 극저온을 이용하여 관상면에서 직렬 30 μm 두께의 단면을 자르고 냉동보호용액(30% 글리세롤, 30% 에틸렌 글리콜, 40% DPBS)으로 채워진 24개의 웰 배양 플레이트에서 모든 단면을 수집한다. 그림 1A-C). -20°C 의 냉동고에 보관하십시오.
   참고: 가능한 경우 두꺼운 단면(예: 50 μm)이 바람직합니다. 단면이 절단 순서로 유지되고 모든 섹션이 완전히 냉동 보호제에 있는지 확인하십시오. 96 웰 플레이트는 섹션을 수집하는 24 웰 플레이트의 대안으로 사용할 수 있습니다.
7. 증발과 건조를 방지하기 위해 플레이트 실러로 우물을 덮습니다. 플레이트를 -20°C에서 추가로 사용할 때까지 보관하십시오. -20°C에서 저장된 단면은 ChAT 면역화학에 대해 수개월 동안 안정하다.

2. IHC에 대한 체계적인 섹션 선택

참고: 허용 가능한 오류 계수(CE)를 달성하는 데 필요한 섹션의 총 수를 알기 위해 파일럿 연구를 수행해야 합니다. CE 값은 샘플링 프로시저의 총 오차 량의 표현식입니다. 가장 낮은 값은 최소 오차를 나타내고 0.1보다 낮은 CE 값은 여기에 사용된 소프트웨어에서 허용되는 것으로 간주됩니다(재료 표^{참조) 11.}

1. 프랭클린과 Paxinos와 같은 표준 마우스 뇌 아틀라스와 형태학적 특징을 비교하여 각 뇌의 첫 번째 및 마지막 섹션을 식별합니다. NBM은 브레그마 -0.0mm에서 시작하여 -1.6mm로 끝납니다. 따라서 약 50개의 섹션에는 NBM이 포함되어 있습니다. 섹션의 총 수는 입체학 중에 필요한 매개 변수 중 하나입니다. ^8번째 섹션(SSF = 1/8)을 모두 선택하면 분석을 위해 총 6~7개의 섹션이 제공되었으며 파일럿 연구에서 부피 추정 및 섬유 길이 추정 모두에 대해 허용 가능한 CE를 산출했습니다.
2. 처음 8개 섹션 중 하나로 임의로 시작한 다음 NBM(그림 1C)을포함하는 마지막 후방 섹션까지^8번째 섹션마다 체계적으로샘플링합니다.

3. 면역화학

1. 냉동 보존 된 부분을 저온 보호제에서 실온으로 옮은 다음 6 개의 웰 플레이트에서 0.1M 인산완충 (PB)을 전달합니다.
2. PB에서 3회 세척합니다.
3. 메탄올에서 0.3% H_2O2를 15분 동안 배양한다.
4. 트리스 버퍼링 식염수(TBS)로 3x 세척합니다.
5. 30 분 동안 TBS에서 0.25 % 트리톤 X-100으로 배양하십시오.
6. 30 분 동안 TBS에서 0.1 % 트리톤 X-100에서 10 % 정상 소 혈청 (NBS)으로 차단하십시오.
7. 4°C에서 0.1% 트리톤 X-100 및 1% NBS를 가진 TBS에서 염소 항인간 ChAT 1차 항체의 1:1,000 희석을 배양하였다.
8. 실온에서 TBS로 3회 세척하십시오. 실온에서 모든 추가 배양 및 세척을 수행합니다.
9. 생체 용 소 항 염소 보조 항체로 배양 (재료 표참조) 1 시간 동안.
10. TBS에서 3회 씻으소서.
11. 아비딘-비오틴-과산화공복합체와 배양하십시오(재료 표참조).
12. TBS에서 3회 씻으소서.
13. 제조업체의 권장 사항에 따라 향상된 DAB 과산화아제 기판 용액(재료 표참조)을 사용하여 개발합니다.
    주의: DAB는 발암 물질로 의심되는 물질입니다. 그것은 접촉과 흡입에 의해 유독합니다. DAB로 작업할 때는 PPE를 사용합니다.
14. 증류수로 섹션을 몇 번 씻고 Tris pH = 7.6에 보관하십시오.
15. 젤라틴 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 한 조직의 모든 섹션은 동일한 슬라이드에 넣을 수 있습니다. 공기를 건조, 70 %, 90 %, 95 %, 100 % 에탄올각 5 분 동안 2 x를 탈수 한 다음 두 개의 10 분 자일렌 세안으로 섹션을 취소합니다. 장착 매체를 사용하여 단면을 덮어넣습니다(재료 표참조).
    참고: 탈수 및 클리어링 처리 시간은 단면의 두께에 영향을 줍니다. 따라서 모든 섹션에 동일한 조건을 사용해야 합니다. 현재 연구에서, 최종 두께에 대한 평균 값은 21.11±0.45 μm이었다.
16. 연기 후드의 섹션을 건조상태로 유지하십시오. 건조한 부분은 입체학을 할 준비가 되어 있습니다.

4. 입체학

참고: 사용된 현미경 및 소프트웨어에 대한 재료 표를 참조하십시오. 숫자 조리개(NA) > 1.2가 있는 침수 조제는 유용하며 필요한 경우 사용해야 합니다. 슬라이드는 유전자형 또는 치료 그룹에 따라 그룹화되고 코딩되어야 합니다. 한 연구에 대한 완전한 입체학은 동일한 사람에 의해 수행되어야하며 입체학을 수행하는 사람은^1,12,13을조사 한 개별 슬라이드 또는 그룹의 정체성에 눈이 멀어야합니다.

1. 소프트웨어에서 새 스터디를 엽니다. (파일> 새 스터디). '연구초기화'대화 상자가 열립니다. 다단계(분수 기반)(그림2A)를사용하여 스터디 정보를 작성합니다.
2. [볼륨] 매개변수아래에서'볼륨'을두 번 클릭하면 볼륨 대화 상자가 열립니다. 관심 기능의 이름을 지정하고'지역 포인트 계산'프로브를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
3. 다음 매개 변수인'길이'를두 번 클릭합니다.
   1. 피처 이름(예:'L')선택 '구' 프로브를 클릭 하 고 다음을클릭 합니다.
4. 다음으로 '케이스 초기화' 상자를 엽니다'연구 초기화' 대화 상자를 클릭 합니다. 케이스 정보를 입력합니다. 스터디를 시작하기 전에 그룹을 코딩해야 합니다. 섹션의 총 수는 관심 영역을 포함하는 첫 번째 섹션부터 관심 영역을 포함하는 마지막 섹션까지의 첫 번째 섹션부터 시작되는 섹션의 수입니다(2.1단계 참조). IHC 염색을 위해^8번째 섹션마다 선택되었기 때문에 단면 샘플링 간격은 8입니다.
5. 다음을 클릭하면'프로브 초기화'대화 상자가 열리며, 이 대화 상자는 영역 선택 및 체적 추정에 대한 가장 낮은 배율을 자동으로 설정합니다. 설정을 확인하고 선택한 낮은 배율에서 관심 영역을 식별할 수 있는지 확인합니다. '볼륨'을 두 번 클릭하고 영역 볼륨 분율에 대해 포인트당 50,000 μm^3을 채웁니다. 완료를 클릭합니다.
6. 오브젝트(높음) 배율아래 길이를 63x 또는 100x로 설정합니다. '길이'를두 번 클릭하여 길이-구 대화 상자를 열고 구의 지름을 10 μm로 설정합니다.
   참고: 보호 영역은 단면의 실제 두께에 따라 결정되어야 합니다. 작업자는 손상을 방지하기 위해 여러 현장에서 단면의 두께를 확인해야 합니다. 필요한 경우 단면 두께에 따라 가드 영역 두께를 조정합니다.
7. 프레임 영역, 프레임 높이, 가드 영역 및 프레임 간격에 대해 적절한 값을 설정합니다.
   참고: 이러한 값은 연구 영역의 개체 프로파일(섬유)의 이질성에 따라 달라집니다. 프레임 면적 400 μm^2,프레임 높이 10 μm, 가드 존 2 μm, 프레임 간격 300 μm은 NBM의 섬유 길이 추정에 적합한 CE 값을 제공합니다. 다음 사례로 이동하기 전에 이러한 값으로 파일럿 스터디를 수행해야 합니다.
8. 각 단계 후 소프트웨어에서 제공하는 지침을 따르십시오. 지침은 대화 상자 및/또는 화면 하단에 나타납니다.
9. 섹션 1을 삽입합니다.
10. 낮은 배율(5x)에서는 NBM 주위에 임의의 경계를 만들어 관심 영역을 정의합니다. 비디오 창의 왼쪽 모서리에 있는 다음 단추를 클릭합니다. 지침에 따라 모든 녹색 점이 NBM에 있는지 확인합니다. 포인트를 클릭하여 포함하거나 제외할 수 있습니다.
    참고: NBM 주위에 는 명확한 설정 경계가 없습니다. 선택은 대부분 조사자가 정의합니다. NBM의 ChAT+ 해 뉴런은 내부 캡슐(ic) 및 글로부스 팔리두스(GP)에서 관찰될 수 있다. 이 프로토콜에서, ChAT+ 해 뉴런및 그들의 프로젝션(섬유) 및 전체 GP를 포함하는 ic는 NBM(도1D)에포함된다.
11. 지침에 따라 현재 분획에서 섬유 측정을 위해 63x로 변경합니다. 화면에'단면 두께'대화 상자가 나타납니다. 단면의 위쪽 및 아래쪽 표면을 설정하여 단면의 실제 두께를 측정합니다. 수동 Z 축 이동을 사용해야 합니다. 완료 를 클릭합니다.
    참고: 영역에 섬유가 없는 경우 단계를 건너뛰고 다음 분수 위치로 이동합니다.
12. Z축을 섹션의 프레임 높이에서 위에서 아래로 천천히 이동하고 가상 구 프로브의 표면에 교차하는 모든 섬유를 표시합니다(그림3). 완료되면 다음 을 클릭하여 다음 위치로 이동합니다.
13. 모든 분수를 완료 한 후, 소프트웨어는 다음 섹션을 삽입하도록 요청합니다. 조직의 모든 6 개 또는 7 개의 섹션에 대해 4.9-4.12 단계를 반복합니다.
    1. 결국, 소프트웨어는 CE 값을 보여주는 케이스에 대한 결과를 생성한다(그림4). CE가 허용되는 경우 다음 사례로 진행합니다. 파일 > 새로운 케이스. CE가 허용되지 않는경우(그림 4A)소프트웨어는 일부 매개 변수를 변경하는 권장 사항을 제공합니다. 대부분의 경우 프레임 간격을 줄이면 CE 값이 허용 가능한 범위로줄어듭니다(그림 4B).
14. 모든 서비스 케이스를 완료한 후 각 서비스 케이스 및그룹(파일 > 결과)에대한 결과를 생성합니다.

5. 분석 및 통계

1. 이 소프트웨어는 각 샘플 및 각 그룹에 대한 데이터를 제공합니다. 소프트웨어 자체는 SSF, ASF 및 TSF와 같은 분획을 계산하고, 참조 영역(이 경우 NBM)에서 섬유의 총 기준 부피(V_REF)및 총 길이(L)를제공한다(그림 4B). 데이터를 내보내고 그룹 분석 간에 선택한 통계 소프트웨어에 저장하거나 복사합니다. 표 1은 통계 분석을 위한 일반적인 결과 데이터를 보여줍니다. 총 섬유 길이를 기준 부피와 나누어 섬유 밀도(Lv)를 분석합니다.

결과

대표적인 결과는 표 1 및 도 5에나와 있다. APPswe 군(APP)으로 디코딩된 그룹 C는 야생형(WILD) 리터메이트에 비해 섬유길이(도 5B)및 섬유 길이 밀도(도5C)가현저히 낮았다. 그 결과 분석된 두 그룹 간의 NBM의 부피에는 유의한 차이가 없음을보여주었다(도 5A).

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토론

여기서 우리는 우주볼(sphere) 프로브를 이용하여 NBM에서 콜린성 섬유의 밀도를 추정하는 방법을 입증한다. 이 프로브는 관심 영역의 총 섬유 길이를 추정합니다. 전체 길이는 섬유 밀도를 얻기 위해 영역의 부피에 의해 나눌 수 있다. 영역의 부피를 추정하기 위해 카발리에리 포인트 카운트 방법을 사용하였다. Cavalieri 포인트 카운트 방법은 모든 지역에 대한 3D 기준 볼륨의 편견없고 효율적인 추정...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABC kit	Vector Laboratories	PK6100
Anti-ChAT Antibody	Millipore, MA, USA	AB144P
Bovine anti-goat IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Bovine Serum, Adult	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Enhanced DAB peroxidase substrate solution
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056