卵巢癌组织线粒体的制备与控制卵巢组织进行定量蛋白质组学分析

摘要

本文提出了一种将微分速度离心与密度梯度离心相结合，将线粒体从人类卵巢癌组织中分离出来并控制卵巢组织的定量蛋白质组学分析方案，生成人类卵巢癌线粒体蛋白体的高通量和高可重复性定量蛋白质组学分析的高质量线粒体样本。

摘要

卵巢癌是一种常见的妇科癌症，死亡率高，但分子机制不明确。大多数卵巢癌在晚期被诊断，这严重阻碍了治疗。线粒体变化是人类卵巢癌的标志，线粒体是能量代谢、细胞信号和氧化应激的中心。深入了解卵巢癌中线粒体蛋白酶与控制卵巢组织的变化，将有助于深入了解卵巢癌的分子机制，以及发现有效可靠的生物标志物和治疗靶点。这里介绍了一种有效的线粒体制备方法，结合相对和绝对定量 （iTRAQ） 定量蛋白质组学的等值标记，用于分析人类卵巢癌和控制线粒体蛋白酶， 包括差分速度离心、密度梯度离心、线粒体样品质量评估、蛋白消化与胰蛋白酶、iTRAQ 标签、强阳离子交换分馏 （SCX）、液相色谱 （LC）、串联质谱 （MS/MS），数据库分析和线粒体蛋白的定量分析。许多蛋白质已被成功识别，以最大限度地覆盖人类卵巢癌线粒体蛋白酶，并实现人类卵巢癌中不同表达的线粒体蛋白特征。

引言

卵巢癌是一种常见的妇科癌症，死亡率高，但^{分子机制1，2}不清楚。大多数卵巢癌在晚期被诊断，这严重阻碍了治疗。线粒体变化是人类卵巢癌的标志，线粒体是能量代谢、细胞信号和氧化应^{激3、4、5、6、7}的中心。深入了解卵巢癌中线粒体蛋白酶与控制卵巢组织的变化，将有助于深入了解卵巢癌的分子机制，以及发现有效可靠的生物标志物和治疗靶点。线粒体代谢已被提出并确认为癌症治疗的目标，抗线粒体治疗最终可能非常有利于预防癌症的复发和^转移。个体代谢分析也已经实践为癌症分层和预测策略^{的有用工具9，10。}

这项研究的长期目标是开发和使用定量线粒体蛋白质组学方法来研究卵巢癌，以澄清卵巢癌与控制卵巢组织之间的线粒体蛋白质组变化，以及其分子网络从系统多组分^{角度11、12}的变化，从而发现线粒体靶向分子生物标记^物13，以澄清卵巢癌的分子机制，预测，并个性化治疗卵巢癌患者。相对和绝对定量（iTRAQ）^标签3、4的等值标签是定量线粒体蛋白质变化的有效方法。从人类卵巢癌中制备高质量的线粒体样本和控制卵巢组织是iTRAQ定量分析线粒体^蛋白酶3的先决条件。线粒体制剂与iTRAQ定量蛋白质组学已成功地用于有关人类卵巢癌线粒体蛋白质组的长期研究项目，包括建立线粒体蛋白质组参考^图3，分析微分表达线粒体剖^面4、14和翻译后修饰，包括磷酸化，这已经导致发现重要的信号通路网络变化在人类卵巢^癌5，包括能量代谢^{的变化4，}脂质代谢，和米托巴细胞通路^系统3。

此前的研究发现，微差速离心与密度梯度离心相结合是从人类卵巢癌中分离和纯化线粒体，控制卵巢^{组织3、4、5、14}的有效方法。iTRAQ 标签与强阳离子交换 （SCX） -液相色谱 （LC）-串联质谱法 （MS/MS） 相结合，是检测、识别和量化制备线粒体样本中的蛋白质的关键技术。

这里，描述了线粒体制备与iTRAQ定量蛋白质组学的详细方案。这些已经成功地用于分析人类卵巢癌组织线粒体。这些方案包括样品制备、差分速度离心、密度梯度离心、线粒体样品的质量评估、胰蛋白酶的蛋白质消化、iTRAQ标记、SCX分馏、LC、MS/MS、数据库搜索以及线粒体蛋白的定量分析。此外，该协议很容易翻译分析其他人体组织线粒体蛋白酶。

研究方案

该协议使用卵巢组织样本，包括卵巢癌组织（n = 7）和正常对照卵巢组织（n = 11）。本议定书3、4、5号方案经中南大学湘雅医院医学伦理委员会批准。

1. 从人类卵巢癌组织制备线粒体

1. 通过混合 210 mM 甘醇、70 mM 蔗糖、100 mM 氯化钾 （KCl）、50 mM Tris-HCl、1 mM 二胺四乙酸 （EDTA）、0.1 mM 乙二醇二（2-氨基乙醚）四甲酸 （EGTA） 1 mM，制备 250 mL 线粒体隔离缓冲液苯甲烷硫磷酸（PMSF）蛋白酶抑制剂，2 mM正畸钠（V）和0.2%牛血清白蛋白（BSA），pH 7.4。
2. 将约1.5克卵巢癌组织放入干净的玻璃盘中。
3. 加入2 mL的预冷冻线粒体隔离缓冲液，轻轻清洗组织表面3x的血液。
4. 使用干净的眼科剪刀将组织完全切成约 1 mm³件，并将切碎的组织转移到 50 mL 的离心管中。
5. 加入含有0.2mg/mL nagarse的线粒体隔离缓冲液13.5 mL，然后使用电均质器对切碎的组织（使用刻度2，10s 6x，间隔10秒）切碎组织（2分钟，4°C）。
6. 再将3 mL线粒体隔离缓冲液加入组织均质，并通过移液将其混合均匀。
7. 离心制备的组织均质化（1，300 x g，10分钟，4°C）。去除粗核馏分（即颗粒），并保持上清液。
8. 重新离离上清液（10，000 x g，10分钟，4°C）。取出微体（即上清）并保持颗粒。
9. 加入2 mL线粒体隔离缓冲液，通过轻移液重新悬浮颗粒。
10. 离心颗粒悬浮液（7，000 x g，10 分钟，4 °C）。丢弃上清液并保留粗线粒体（即颗粒）。
11. 加入12 mL的25%密度梯度介质（即Nycodenz），以重新悬浮提取的粗线粒体。
12. 通过从下到上填充管，从下到上填充5 mL 34%，8 mL 30%，12 mL 25%（包含步骤1.11的粗线粒），8 mL的23%，和3 mL的20%密度梯度介质，并将其离心（52，000 x g，90分钟，4°C）进行不连续的密度梯度。
13. 使用长而钝的注射器将25%和30%密度梯度介质之间的界面上的纯化线粒体收集到干净的管中。
14. 将线粒体隔离缓冲液添加到收集的线粒体中，将其稀释至三倍体积。离心机（15，000 x g，20分钟，4°C），并丢弃上清液。
15. 加入2 mL的线粒体隔离缓冲液，以重新悬浮颗粒，并加入离心机（15，000 x g，20分钟，4°C）。丢弃上清液并保留颗粒。
16. 收集最终颗粒（即纯化线粒体），并将其储存在-20°C。
    注:将卵巢癌组织中所有纯化的线粒体作为线粒体样本，用于定量蛋白质组学分析。

2. 从人类控制卵巢组织制备线粒体

1. 如步骤 1.1 所述，准备 250 mL 的线粒体隔离缓冲液。
2. 将±1.5克正常控制卵巢组织放入干净的玻璃盘中。
3. 加入2 mL的预冷冻线粒体隔离缓冲液，轻轻清洗组织表面3x的血液。
4. 使用干净的眼科剪刀将组织完全切成约 1 mm³件，并将切碎的组织转移到 50 mL 的离心管中。
5. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中加入8 mL的0.05%胰蛋白酶/20 mM EDTA，加入切碎的控制组织，并消化（30分钟，室温），这有助于对组织和细胞进行解说并释放线粒体。然后离心（200 x g，5分钟）。丢弃上清液，并保留组织和细胞。
6. 加入含有0.2mg/mL nagarse的线粒体隔离缓冲液13.5 mL，然后使用电均质器对切碎的组织（使用刻度2，10s 6x，间隔10秒）切碎组织（2分钟，4°C）。
7. 再将3 mL线粒体隔离缓冲液加入组织均质，并通过移液将其混合均匀。
8. 离心制备的组织均质化（1，300 x g，10分钟，4°C）。去除粗核馏分（即颗粒），并保持上清液。
9. 重新离心上清液（10，000 x g，10分钟，4°C）。取出微体（即上清）并保持颗粒。
10. 加入2 mL线粒体隔离缓冲液，通过轻移液将颗粒重新悬浮。
11. 离心颗粒悬浮液（7，000 x g，10 分钟，4 °C）。丢弃上清液并保留粗线粒体（即颗粒）。
12. 加入12 mL的25%密度梯度介质，以重新悬浮提取的粗线粒体。
13. 通过从下到上填充8 mL的38%，5 mL的34%，8 mL的30%，12 mL的25%（包含从步骤2.12的粗线粒体），8 mL的23%，和3 mL的20%密度梯度介质，并离心机它（52，000 x g，90 min， 4 °C） 的管，使不连续的密度梯度。
14. 使用长而钝的注射器将纯化线粒体收集在25%至30%的界面到34%至38%的界面范围内的纯化线粒体到干净的管中。
15. 将线粒体隔离缓冲液添加到收集的线粒体中，将其稀释至三倍体积。离心机（15，000 x g，20分钟，4°C），并丢弃上清液。
16. 加入2 mL的线粒体隔离缓冲液，以重新悬浮颗粒，并将其离心（15，000 x g，20分钟，4°C）。丢弃上清液并保留颗粒。
17. 收集最终颗粒（即纯化线粒体），并将其储存在-20°C。
    注:将对照卵巢组织的所有纯化线粒体合并为线粒体样本，用于定量蛋白质组学分析。

3. 纯化组织线粒体样本质量的验证

1. 取一管纯化线粒体样本（即步骤1.16中卵巢癌组织的颗粒和步骤2.17中的控制卵巢组织），用电子显微镜（EM）进行验证。
   注:详细的协议在之前^{描述了15，16。}
2. 通过混合8M尿素、2M硫尿、40mMTris、1mM EDTA、130 mM二硫硫醇（DTT）和4%（w:v）3-（3-胆碱丙基）-1-丙烯酸（CHAPS），制备线粒体蛋白提取缓冲液。将 pH 调整到 8.52。
3. 取一管纯化线粒体样本（即步骤1.16中卵巢癌组织的颗粒和步骤2.17中的控制卵巢组织），并添加线粒体蛋白提取缓冲液（线粒体样本到蛋白质提取缓冲液，1:5）到重新悬浮颗粒。将样品冷冻在液氮3x中，在室温下储存2小时。
4. 在12，000 x g，30分钟，4°C下离心，收集上清液（即提取的线粒体蛋白样品），用双辛酸（BCA）蛋白质检测试剂盒测量蛋白质含量。
5. 通过混合 9.08 g 的 Tris 和 40 mL 的 ddH₂O，使用 HCl 将 pH 调整到 8.8，并将 ddH₂O 添加到 50 mL 的最终体积，从而制备 50 mL 的 1.5 M Tris-HCl （pH 8.8）。储存在4°C。
6. 通过混合 6.06 g 的 Tris 和 40 mL 的 ddH₂O，使用 HCl 将 pHH 调整为 6.8，并将 ddH₂O 添加到 50 mL 的最终体积，制备 50 mL 的 1 M Tris-HCl （pH 6.8）。储存在4°C。
7. 通过混合29克丙烯酰胺、1克二丙烯酰胺和80 mL的ddH₂O，并将ddH₂O添加到100 mL的最终体积中，制备100 mL的30%丙烯酰胺-二维溶液。将其储存在4°C的棕色瓶子中。
8. 通过混合 29 克甘氨酸、58 g 三聚氰胺、3.7 克硫酸钠 （SDS） 和 800 mL ddH₂O，制备 1，000 mL 的 10x 三星甘氨酸电泳缓冲液，然后将 ddH₂O 添加到 1，000 mL 的最终体积中。
9. 通过混合 2 mL 的甘油、0.02 克溴酚蓝、0.4 g SDS、2 mL 的 Tris-HCl pH 6.8 和 7 mL ddH₂O，然后将 ddH₂O 添加到 10 mL 的最终体积，制备 10 mL 的负载缓冲液。
10. 通过混合 4 mL ddH₂O， 制备 10 mL 的 10% 硫酸二甲酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 溶解凝胶， 3.3 mL 的 30% 丙烯酰胺-Bis 溶液，2.5 m L 的 1.5 M Tris-HCl （pH 8.8），0.1 mL 的 10% SDS，0.1 mL 的 10% 过硫酸铵，以及 0.004 mL 的四甲基二甲二胺 （TEMED）。将 SDS-PAGE 解析凝胶溶液倒入玻璃板之间的板中，至梳子底部的水平。在顶部添加 2 mL 的等丙醇。离开30分钟。
11. 去除同丙醇，用ddH₂O 3x清洗顶部。倒入含有 4.1 mL ddH₂O、1.0 mL 30% 丙酰胺-二聚醚溶液、0.75 mL 1 M Tris-HCl （pH 6.8）、0.06 mL 10% SDS、0.06 mL 10% 硫酸铵和 0.006 mL 的 TEMED 的 5% 浓度凝胶溶液。立即将梳子插入浓缩凝胶溶液中，离开 30 分钟，然后拿出梳子。
12. 通过稀释 100 mL 的 10x Tris-甘氨酸电泳缓冲液，使用 900 mL ddH₂O 制备 1x 三甘氨酸电泳缓冲液，然后倒入电泳罐中。
13. 将卵巢癌中的30μg线粒体蛋白混合，并将步骤3.4中的卵巢组织与加载缓冲液控制，最终体积达到20μL。将混合物煮沸5分钟，然后用10%的恒定电压将混合物与10%SDS-PAGE解析凝胶分离。 当溴酚蓝色到达底部时，停止电泳。
14. 通过混合 150 mL 的 10x Tris-甘氨酸电泳缓冲液、1，050 mL ddH₂O 和 300 mL 甲醇，制备 1.5 L 电泳传输缓冲液。
15. 将PVDF膜浸泡在100%甲醇中10分钟，在电泳转移缓冲液中浸泡至少5分钟。
16. 拿出含有蛋白质的SDS-PAGE凝胶，将其浸泡在电泳转移缓冲液中10分钟。
17. 将湿海绵放在白板上，三张湿滤纸，PVDF膜，带蛋白质的SDS-PAGE凝胶，两片湿滤纸，以及从下到上湿海绵，制作转印盒。避免任何气泡。
18. 将传输盒放入电泳罐中，倒入电泳传输缓冲液中，然后在恒定的 200 mA 电流下传输 2 小时。
19. 通过将 12.114 g 的 Tris、29.22 g NaCl 混合在 500 mL 的最终体积中添加 ddH₂O，制备 10x Tris 缓冲盐 （TBS） 库存溶液。通过混合 200 mL 的 10x TBS、2 mL 的 Tween-20 和 1，798 mL 的 ddH₂O，通过混合 100 mL 的 TBST 和 5 g BSA 来制备 100 mL 的阻断溶液。
20. 转移后，拿出PVDF膜，在TBST中轻轻洗涤5分钟，然后在室温下将其阻断溶液1小时。
21. 用不同亚细胞细胞器特有的不同原抗体孵育PVDF膜（4°C），包括层状B（细胞核;山羊抗人抗体1:1，1000阻断溶液），flotillin-1（细胞膜;兔抗人抗体1:500阻断液），COX4I1（味精;兔抗人1:1，000阻断溶液），GM130（Golgi仪器;小鼠抗人抗体1:1，000阻断溶液），催化酶（过氧化物;兔抗人抗体1:1，000阻断）溶液），和卡他普辛B（液化体;兔抗人抗体1:1，000阻断溶液）。在TBST中轻轻洗涤5分钟3次。
22. 在室温下用相应的二级抗体（兔子抗山羊、山羊抗兔子或山羊抗小鼠）孵育PVDF膜1小时。在TBST中轻轻洗涤5分钟3次。使用电化学发光 （ECL） 可视化它。

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS 分析

注:第 4 节的详细程序请参阅 iTRAQ 说明（材料表）。

1. 将SDT缓冲液（4%SDS、100 mM Tris-HCl pH 7.6和100 mM DTT）添加到纯化的线粒体样本中（即步骤1.16中卵巢癌组织的颗粒和步骤2.17中的控制卵巢组织）。涡旋样品，直到没有可见的沉淀物。
   注: 线粒体样本与 SDT 缓冲比应为 1:5。
2. 将 SDT 处理的样品煮沸 5 分钟，在冰上冷却样品，然后离心（2，000 x g，2分钟）。
3. 收集上清液作为提取的线粒体蛋白样本，用BCA蛋白检测试剂盒测量蛋白质含量。
4. 服用SDT提取的线粒体蛋白（每个样品200微克）用于还原、烷基化、用胰蛋白酶消化、海水淡化和冻^干3、4。为每个示例执行三个复制。
5. 使用步骤4.4中处理100mM四乙基溴化铵溶液（pH 8.5）中的胰蛋白肽（每个样品100μg），并根据其^说明3，4将胰蛋白肽与6-丛iTRAQ试剂之一贴上标签。标记每个样本 3 倍。
6. 均匀地混合6个标记的胰蛋白肽样品（3个来自卵巢癌组织，3个来自对照卵巢组织），用真空浓缩器干燥。
7. 将带有 SCX 色谱的混合 iTRAQ 标记肽分馏为 60 个分数（每 1 分钟一个分数），然后将每两个馏分合并为 SCX 分馏样品（n = 30）。
8. 在质谱^仪3、4上对每个SCX分馏样品进行LC-MS/MS分析，并在60分钟LC分离梯度内与纳米LC系统相结合，以获得MS/MS数据。
9. 搜索MS/MS数据，通过搜索引擎识别蛋白质（材料表）。
10. 使用 iTRAQ 报告器-ion 强度量化每种蛋白质，并确定线粒体差异表达蛋白 （mtDEPs），其变化为 >1.5 或 <-1.5 倍，p < 0.05。

结果

从卵巢癌组织和控制卵巢组织对线粒体的制备有差异。这项研究发现，从卵巢癌组织制备线粒体比从控制卵巢^组织3，4容易得多。必须对从控制卵巢组织制备线粒体的方案进行一些改进。首先，在组织均质化之前，有必要在添加到切碎控制组织的PBS溶液中加入8 mL的0.05%胰蛋白酶/20 mM EDTA，随后在室温下消化30分钟，在200 x g?...

讨论

线粒体改变是卵巢癌的标志。从人类卵巢癌中制备高质量的线粒体样本，控制组织用于大规模定量蛋白质组学，有助于深入了解卵巢癌发病机制和线粒体分子网络变化中的线粒体功能，有助于阐明其分子机制，为后续发现基于线粒^体4、5、8的目标疗法和有效的生物标志物。微分速度离心与密度梯度离心相结合，有效地从人类卵...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA protein assay kit	Vazyme	E112	BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA)	Solarbio	A8020-5G	Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge	XiangYi	TDZ4--WS
CHAPS	Sigma	C9426-5G	BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma	798681-100G	Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT	Sigma	10197777001	1,4-Dithiothreitol
Easy nLC	Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E0396-10G	BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer	SilentShake	HYQ-3110
iTRAQ reagent kit	Applied Biosystems		Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger	Eppendorf	5424R
Mannitol	Macklin	M813424-100G	Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine	Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse	Solarbio	P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT)	Sigma	56480-25G	Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz	Alere/Axis-Shield	1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor	Solarbio	P0100-1ML	PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride	Macklin	P816354-25G	Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4	Matrix Science, London, UK
PVDF membrane	Millipore	05317	It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific
SCX column	Sigma	58997	It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V)	Macklin	S817660-25G	Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose	Macklin	S824459-500G	Vetec reagent grade, 99%
Thiourea	Sigma	62-56-6	ACS reagent, ≥99.0%
Tris base	Sigma	10708976001	TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use)	Gibco	25200-056	This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea	Sigma	U5378-100G	powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture