Preparación de Mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario y tejidos ováricos de control para el análisis proteómico cuantitativo

Resumen

Este artículo presenta un protocolo de centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación de gradiente de densidad para separar las mitocondrias de los tejidos de cáncer de ovario humano y controlar los tejidos ováricos para el análisis proteómico cuantitativo, resultando en una muestra mitocondrial de alta calidad y un análisis proteómico cuantitativo de alta calidad y alta reproducibilidad de un proteomo mitocondrial de cáncer de ovario humano.

Resumen

El cáncer de ovario es un cáncer ginecológico común con alta mortalidad pero mecanismo molecular poco claro. La mayoría de los cánceres de ovario se diagnostican en la etapa avanzada, lo que dificulta gravemente la terapia. Los cambios mitocondriales son un sello distintivo de los cánceres de ovario humano, y las mitocondrias son los centros del metabolismo energético, la señalización celular y el estrés oxidativo. La comprensión en profundidad de los cambios del proteoma mitocondrial en los cánceres de ovario en comparación con el control del tejido ovárico beneficiará la comprensión profunda de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, y el descubrimiento de biomarcadores y dianas terapéuticas eficaces y confiables. Aquí se presenta un método eficaz de preparación mitocondrial junto con una etiqueta isobárica para la proteómica cuantitativa de cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) para analizar el cáncer de ovario humano y controlar los proteomes mitocondriales, incluyendo centrifugación de velocidad diferencial, centrifugación de gradiente de densidad, evaluación de la calidad de muestras mitocondriales, digestión proteica con trippsina, etiquetado iTRAQ, fraccionamiento de intercambio catiónico fuerte (SCX), cromatografía líquida (LC), espectrometría de masas en tándem (MS/ MS), análisis de bases de datos y análisis cuantitativo de proteínas mitocondriales. Muchas proteínas se han identificado con éxito para maximizar la cobertura del proteome mitocondrial del cáncer de ovario humano y para lograr el perfil de proteína mitocondrial expresado diferencialmente en cánceres de ovario humano.

Introducción

El cáncer de ovario es un cáncer ginecológico común con alta mortalidad pero mecanismo molecular poco claro^1,2. La mayoría de los cánceres de ovario se diagnostican en la etapa avanzada, lo que dificulta seriamente la terapia. Los cambios mitocondriales son un sello distintivo de los cánceres de ovario humano, y las mitocondrias son los centros del metabolismo energético, la señalización celular y el estrés oxidativo^3,4,5,6,7. La comprensión en profundidad de los cambios del proteoma mitocondrial en los cánceres de ovario en comparación con el control del tejido ovárico beneficiará la comprensión profunda de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, y el descubrimiento de biomarcadores y dianas terapéuticas eficaces y confiables. El metabolismo mitocondrial ha sido propuesto y reconocido como un objetivo para la terapia contra el cáncer, y la terapia antimitocondrial podría ser en última instancia muy beneficiosa para prevenir la recurrencia y metástasis del cáncer⁸. El perfilado metabólico individual también se practica como una herramienta útil para la estratificación del cáncer y las estrategias predictivas^9,10.

El objetivo a largo plazo de esta investigación es desarrollar y utilizar un método proteomico mitocondrial cuantitativo cuantitativo para estudiar el cáncer de ovario para aclarar las alteraciones del proteomo mitocondrial entre el cáncer de ovario y controlar los tejidos ováricos, y sus alteraciones de la red molecular desde un ángulo multiémico sistemático^11,12, que dará lugar al descubrimiento de biomarcadores moleculares dirigidos a las mitocondrias¹³ para la clarificación de los mecanismos moleculares del cáncer de ovario, predicción y tratamiento personalizado de los pacientes con cáncer de ovario. Las etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) etiquetado^3,4 son un método eficaz para cuantificar los cambios de proteína mitocondrial. La preparación de muestras mitocondriales de alta calidad a partir de cáncer de ovario humano y tejidos ováricos de control son el requisito previo para el análisis cuantitativo iTRAQ de proteomos mitocondriales³. La preparación mitocondrial junto con la proteómica cuantitativa iTRAQ se ha utilizado con éxito en programas de investigación a largo plazo sobre el proteomo mitocondrial del cáncer de ovario humano, incluyendo el establecimiento de mapas de referencia del proteome mitocondrial³, el análisis de perfiles mitocondriales expresados diferencialmente^4,14 y modificaciones post-traduccionales, incluida la fosforilación, que ya ha dado lugar al descubrimiento de importantes vías de señalización cambios en la red en los cánceres de ovario humano⁵, incluyendo alteraciones en el metabolismo energético⁴, metabolismo de los lípidos, y sistemas de vía mitophagia³.

Estudios anteriores han encontrado que la centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación de gradiente de densidad es un método eficaz para aislar y purificar las mitocondrias del cáncer de ovario humano y controlar los tejidos ováricos^3,4,5,14. El etiquetado iTRAQ junto con un fuerte intercambio catiónico (SCX)-cromatografía líquida (LC) espectrometría de masas tándem (MS/MS) es la técnica clave para detectar, identificar y cuantificar las proteínas de las muestras mitocondriales preparadas.

Aquí se describen protocolos detallados para la preparación mitocondrial junto con proteómica cuantitativa iTRAQ. Estos se han utilizado con éxito en el análisis de los proteomes mitocondriales del tejido de cáncer de ovario humano. Los protocolos incluyen preparación de muestras, centrifugación de velocidad diferencial, centrifugación de gradiente de densidad, evaluación de la calidad de muestras mitocondriales, digestión de proteínas con trippsina, etiquetado iTRAQ, fraccionamiento SCX, LC, MS/MS, búsqueda de bases de datos y análisis cuantitativo de proteínas mitocondriales. Además, este protocolo se traduce fácilmente para analizar otros proteomas mitocondriales de tejido humano.

Protocolo

Para este protocolo se utilizaron muestras de tejidos ováricos, incluidos los tejidos de cáncer de ovario (n.o 7) y los tejidos ováricos de control normal (n.o 11). El presente protocolo^3,4,5 está aprobado por el Comité de ética médica del Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur, China.

1. Preparación de mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario humano

1. Preparar 250 ml del tampón de aislamiento mitocondrial mezclando 210 mM de manitol, sacarosa de 70 mM, cloruro de potasio de 100 mM (KCl), 50 mM Tris-HCl, ácido tetraacético de diamina de 1 mM (EDTA), 0,1 mM de etilenglicol bis(2-éter de aminoetilo)ácido tetraacético (EGTA), 1 mM de etilenglicol bis(2-éter de aminoetilo)ácido tetraacético (EGTA), 1 mM de ácido tetraacetico (EGTA), 1 mM de etilenglicol bis(2-éter de aminoetilo))ácido tetraacético (EGTA), 1 mM inhibidor de la proteasa de fluoruro de fenilonosulfonil (PMSF), ortovanato sódico de 2 mM (V) y albúmina sérica bovina (BSA) albúme, pH 7,4.
2. Coloque 1,5 g de tejidos de cáncer de ovario en un recipiente de vidrio limpio.
3. Añadir 2 ml del tampón de aislamiento mitocondrial pre-enfriado para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido 3x.
4. Use tijeras oftálmicas limpias para picar completamente el tejido en aproximadamente 1 mm³ piezas, y transfiera los tejidos picados en un tubo centrífugo de 50 ml.
5. Añadir 13,5 ml de tampón de aislamiento mitocondrial que contenga 0,2 mg/ml de nagarse, y luego utilizar un homogeneizador eléctrico para homogeneizar (utilizar la escala 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) los tejidos picados (2 min, 4 oC).
6. Añadir otros 3 ml de tampón de aislamiento mitocondrial en el tejido homogeneiza y mezclarlos bien pipeteando.
7. Centrifugar el tejido preparado homogeneizar (1.300 x g,10 min, 4oC). Retire la fracción nuclear bruta (es decir, el pellet) y mantenga el sobrenadante.
8. Recienterifule el sobrenadante (10.000 x g,10 min, 4 oC). Retire los microsomas (es decir, el sobrenadante) y mantenga el pellet.
9. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial y resuspender el pozo de pellets mediante pipeteo ligero.
10. Centrifugar la suspensión del pellet (7.000 x g,10 min, 4oC). Deseche el sobrenadante y mantenga las mitocondrias brutas (es decir, el pellet).
11. Añadir 12 ml de 25% de medio de gradiente de densidad (es decir, Nycodenz) para resuspender las mitocondrias brutas extraídas.
12. Hacer un gradiente de densidad discontinua rellenando un tubo de abajo a arriba con 5 ml de 34%, 8 ml de 30%, 12 ml de 25% (que contiene las mitocondrias brutas del paso 1.11), 8 ml de 23%, y 3 ml de medio de gradiente de densidad del 20%, y centrifuge (52.000 x g,90 min, 40 min).
13. Utilice una jeringa larga y contundente para recoger las mitocondrias purificadas en la interfaz entre el medio de gradiente de densidad del 25% y el 30% en un tubo limpio.
14. Agregue el tampón de aislamiento mitocondrial en las mitocondrias recogidas para diluirla a un volumen triple. Centrifugar (15.000 x g,20 min, 4oC) y desechar el sobrenadante.
15. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial para resuspender el pellet y centrifugar (15.000 x g,20 min, 4oC). Deseche el sobrenadante y mantenga el pellet.
16. Recoger el pellet final (es decir, las mitocondrias purificadas) y almacenarlo a -20 oC.
    NOTA: Combine todas las mitocondrias purificadas del tejido oncológico de ovario como muestra de mitocondrias para el análisis cuantitativo de la proteómica.

2. Preparación de mitocondrias a partir de tejidos ováricos de control humano

1. Prepare 250 ml del tampón de aislamiento mitocondrial como se describe en el paso 1.1.
2. Coloque 1,5 g de los tejidos ováricos de control normal en un recipiente de vidrio limpio.
3. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial pre-enfriado para lavar ligeramente la sangre de la superficie del tejido 3x.
4. Use tijeras oftálmicas limpias para picar completamente el tejido en aproximadamente 1 mm³ piezas, y transfiera los tejidos picados en un tubo centrífugo de 50 ml.
5. Añadir 8 ml de 0,05% de trippsina/20 mM EDTA en solución salina tamponada de fosfato (PBS) a los tejidos de control picados, y digerir (30 min, temperatura ambiente), lo que ayuda a licuar los tejidos y las células y liberar las mitocondrias. A continuación, centrífuga (200 x g, 5 min). Deseche el sobrenadante y mantenga los tejidos y las células.
6. Añadir 13,5 ml de tampón de aislamiento mitocondrial que contenga 0,2 mg/ml de nagarse, y luego utilizar un homogeneizador eléctrico para homogeneizar (utilizar la escala 2, 10 s 6x, intervalo 10 s) los tejidos picados (2 min, 4 oC).
7. Añadir otros 3 ml de tampón de aislamiento mitocondrial en el tejido homogeneiza y mezclarlos bien pipeteando.
8. Centrifugar el tejido preparado homogeneizar (1.300 x g,10 min, 4oC). Retire la fracción nuclear bruta (es decir, el pellet) y mantenga el sobrenadante.
9. Recienterifule el sobrenadante (10.000 x g,10 min, 4oC). Retire los microsomas (es decir, el sobrenadante) y mantenga el pellet.
10. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial para resuspender bien el pellet mediante pipeteo ligero.
11. Centrifugar la suspensión del pellet (7.000 x g,10 min, 4oC). Deseche el sobrenadante y mantenga las mitocondrias brutas (es decir, el pellet).
12. Añadir 12 ml de 25% de medio de gradiente de densidad para resuspender las mitocondrias brutas extraídas.
13. Haga un gradiente de densidad discontinua rellenando un tubo de abajo a arriba con 8 ml de 38%, 5 ml de 34%, 8 mL de 30%, 12 mL de 25% (que contiene las mitocondrias brutas del paso 2.12), 8 mL de 23%, y 3 mL de medio gradiente de densidad del 20%, y centrifugarlo (52.000 x g,90 min, 4oC).
14. Utilice una jeringa larga y contundente para recoger las mitocondrias purificadas en el rango de entre el 25% y el 30% a la interfaz entre 34% y 38% en un tubo limpio.
15. Agregue el tampón de aislamiento mitocondrial en las mitocondrias recogidas para diluirla a un volumen triple. Centrifugar (15.000 x g,20 min, 4oC) y desechar el sobrenadante.
16. Añadir 2 ml de tampón de aislamiento mitocondrial para resuspender el pellet, y centrifugarlo (15.000 x g,20 min, 4 oC). Deseche el sobrenadante y mantenga el pellet.
17. Recoger el pellet final (es decir, las mitocondrias purificadas) y almacenarlo a -20 oC.
    NOTA: Combine todas las mitocondrias purificadas del tejido ovárico de control como muestras mitocondriales para el análisis cuantitativo de la proteómica.

3. Verificación de la calidad de las muestras mitocondriales de tejido purificado

1. Tome un tubo de muestras mitocondriales purificadas (es decir, los pellets de los tejidos del cáncer de ovario del paso 1.16 y los tejidos ováricos de control del paso 2.17) para su verificación con microscopía electrónica (EM).
   NOTA: El protocolo detallado se describió anteriormente^15,16.
2. Preparar el tampón de extracción de proteína mitocondrial mezclando urea de 8 M, 2 M de tiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM de ditilothreitol (TDT) y 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanulfesonato (CHAPS). Ajuste el pH a 8,52.
3. Tome un tubo de muestras mitocondriales purificadas (es decir, los pellets de los tejidos de cáncer de ovario en el paso 1.16 y los tejidos ováricos de control en el paso 2.17) y agregue el tampón de extracción de proteína mitocondrial (muestras mitocondriales al tampón de extracción de proteínas, 1:5) resuspender el pellet. Congele las muestras en nitrógeno líquido 3x y guárdelas a temperatura ambiente durante 2 h.
4. Centrifugar a 12.000 x g,30 min, 4 oC, recoger el sobrenadante (es decir, la muestra de proteína mitocondrial extraída) y medir el contenido de proteína con un kit de ensayo de proteína de ácido bicinchíninic (BCA).
5. Preparar 50 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8) mezclando 9,08 g de Tris y 40 mL de ddH₂O, ajustando el pH a 8,8 con HCl y añadiendo ddH₂O a un volumen final de 50 ml. Conservar a 4oC.
6. Preparar 50 ml de 1 M Tris-HCl (pH 6.8) mezclando 6,06 g de Tris y 40 mL de ddH₂O, ajustando el pH a 6,8 con HCl y añadiendo ddH₂O a un volumen final de 50 ml. Conservar a 4oC.
7. Preparar 100 ml de solución 30% acrilamida-bis mezclando 29 g de acrilamida, 1 g de bis-acrilamida y 80 ml de ddH₂O, y añadiendo ddH₂O a un volumen final de 100 ml. Guárdelo en una botella marrón a 4oC.
8. Preparar 1.000 ml de tampón de electroforesis de trisglicina 10x mezclando 29 g de glicina, 58 g de Tris, 3,7 g de dodecilo sulfato sódico (SDS) y 800 ml de ddH₂O, y luego añadiendo ddH₂O a un volumen final de 1.000 ml.
9. Preparar 10 ml de tampón de carga mezclando 2 ml de glicerina, 0,02 g de azul bromofenol, 0,4 g de SDS, 2 ml de Tris-HCl pH 6,8 y 7 ml de ddH₂O, y luego añadiendo ddH₂O a un volumen final de 10 ml.
10. Preparar 10 ml de electroforesis de gel de dodecylo sulfato de dodecilo sódico al 10% (SDS-PAGE) mezclando 4 ml de ddH₂O, 3,3 ml de 30% de solución de acrilamida-Bis, 2,5 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml de 10% de SDS, 0,1 ml de persulfato de amonio al 10% y 0,004 ml de tetrametiletilendiamina (TEMED). Vierta la solución de gel de resolución SDS-PAGE en la placa entre las placas de vidrio hasta el nivel de la parte inferior del peine. Añadir 2 ml de alcohol isopropílico en la parte superior. Dejar actuar durante 30 minutos.
11. Retire el alcohol isopropílico y lave la parte superior con ddH₂O 3x. Verter la solución de gel de concentración del 5% que contiene 4,1 ml de ddH₂O, 1,0 ml de solución de acilamida-bis al 30%, 0,75 ml de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml de 10% de SDS, 0,06 ml de persulfato de amonio al 10% y 0,06 mL de TEMED. Inserte inmediatamente el peine en la solución de gel de concentración, deje durante 30 minutos y luego saque el peine.
12. Prepare el tampón de electroforesis tris-glicina 1x diluyendo 100 ml de tampón de electroforesis Tris-glicina 10x con 900 ml de ddH₂O y vierta en el tanque electroforético.
13. Mezclar 30 g de las proteínas mitocondriales del cáncer de ovario y controlar los tejidos ováricos del paso 3.4 con el tampón de carga para alcanzar un volumen final de 20 l. Hervir la mezcla durante 5 min, luego separarla con el gel de resolución 10% SDS-PAGE utilizando una tensión constante de 100 V. Cuando el azul bromfenol llegue al fondo, detenga la electroforesis.
14. Preparar 1.5 L de tampón de transferencia electroforética mezclando 150 ml de tampón de electroforesis Tris-glicina 10x, 1.050 ml de ddH₂O y 300 ml de metanol.
15. Remoje la membrana PVDF en 100% metanol durante 10 min y en tampón de transferencia electroforético durante al menos 5 min. Remoje cinco hojas de papel filtrante en 1 tampón de transferencia elecrorórtica durante al menos 5 minutos.
16. Saque el gel SDS-PAGE que contiene las proteínas y remoje lo en tampón de transferencia electroforético durante 10 minutos.
17. Haga un cassette de transferencia colocando una esponja húmeda en la placa blanca, tres hojas de papel de filtro húmedo, la membrana PVDF, el gel SDS-PAGE con las proteínas, dos hojas de papel de filtro húmedo y la esponja húmeda de abajo a arriba. Evite las burbujas.
18. Coloque el cassette de transferencia en el tanque electroforético, vierta en el tampón de transferencia electroforético y, a continuación, transfiera durante 2 h bajo una corriente constante de 200 mA.
19. Prepare 10x Tris-buffered solución de stock de solución salina (TBS) mezclando 12.114 g de Tris, 29.22 g de NaCl, y agregando ddH₂O a un volumen final de 500 mL. Preparar 2 L de 1x TBST mezclando 200 mL de 10x TBS, 2 mL de Tween-20, y 1.798 mL de ddH₂O. Preparar 100 mL de solución de bloqueo mezclando 100 mL de TBST y 5 g de BSA.
20. Después de la transferencia, sacar la membrana PVDF, lavar ligeramente en TBST durante 5 min, luego bloquearlo en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente.
21. Incubar la membrana PVDF (4oC durante la noche) con diferentes anticuerpos primarios específicos de diferentes orgánulos subcelulares, incluyendo lamina B (núcleo celular; anticuerpo antihumano de cabra 1: solución de bloqueo de 1.000), flotillina-1 (citomembrana; conejo antihumano anticuerpo 1:500 solución de bloqueo), COX4I1 (mitocondrion; conejo antihumano 1:1,000 solución de bloqueo), GM130 (aparato Golgi; anticuerpo antihumano ratón 1:1,000 solución de bloqueo), catalasa (peroxoma; anticuerpo antihumano conejo 1:1,000 bloqueo de bloqueo 1:1,000 bloqueo de bloqueo solución) y la catepsina B (solución de bloqueo de lisósoma; conejo antihumano 1:1.000). Lavar ligeramente en TBST durante 5 min 3x.
22. Incubar la membrana PVDF durante 1 h a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios correspondientes (anticabra conejo, cabra anticonejo o antiratón de cabra). Lavar ligeramente en TBST durante 5 min 3x. Visualícelo con electroquimioluminiscencia (ECL).

4. Análisis iTRAQ-SCX-LC-MS/MS

NOTA: Los procedimientos detallados para la sección 4 se refieren a las instrucciones de iTRAQ(Tabla de materiales).

1. Añadir tampón SDT (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 y 100 mM DTT) a las muestras mitocondriales purificadas (es decir, los pellets de los tejidos del cáncer de ovario del paso 1.16 y los tejidos ováricos de control del paso 2.17). Vórtice la muestra hasta que no haya precipitado visible.
   NOTA: La relación de la muestra mitocondrial a la zona de influencia SDT debe ser 1:5.
2. Hervir la muestra tratada con SDT durante 5 min, enfriar la muestra sobre hielo y luego centrifugar (2.000 x g,2 min).
3. Recoger el sobrenadante como las muestras de proteína mitocondrial extraídas y medir el contenido de proteína con un kit de ensayo de proteína BCA.
4. Tome proteínas mitocondriales extraídas de SDT (200 g de cada muestra) para la reducción, alquilación, digestión con trippsina, desalinización y liofilización^3,4. Realice tres réplicas para cada muestra.
5. Tratar los péptidos trípticos (100 g de cada muestra) del paso 4.4 con solución de bromuro de amonio tetraetilo de 100 mM (pH 8.5), y etiquetar los péptidos trípticos con uno de los reactivos iTRAQ de 6 plexigts de acuerdo con sus instrucciones^3,4. Etiquete cada muestra 3x.
6. Mezclar igualmente 6 muestras de péptidos trípticos etiquetados (tres de tejidos de cáncer de ovario y tres de tejidos ováricos de control), y secar con un concentrador de vacío.
7. Fraccionar los péptidos mixtos etiquetados con iTRAQ con cromatografía SCX en 60 fracciones (una fracción por 1 min), luego combinar cada dos fracciones como una muestra fraccionada SCX (n a 30).
8. Someta cada muestra fraccionada por SCX al análisis LC-MS/MS en un espectrómetro de^masas3,4 junto con un sistema nano LC dentro de un gradiente de separación LC de 60 minutos para obtener datos De MS/MS.
9. Busque en los datos de MS/MS para identificar proteínas con el motor de búsqueda(Tabla de materiales).
10. Utilice las intensidades de iTRAQ reporter-ion para cuantificar cada proteína y determinar las proteínas mitocondriales expresadas diferencialmente (mtDEP) con un cambio de >1.5 o <-1.5 veces, y p < 0.05.

Resultados

Hubo una diferencia en la preparación de las mitocondrias de los tejidos del cáncer de ovario y el control de los tejidos ováricos. Este estudio encontró que era mucho más fácil preparar las mitocondrias de los tejidos del cáncer de ovario que de los tejidos ováricos de control^3,4. Se tuvieron que introducir algunas mejoras en el protocolo para la preparación de las mitocondrias a partir de tejidos ováricos de control. E...

Discusión

Las alteraciones mitocondriales son un sello distintivo del cáncer de ovario. La preparación de muestras mitocondriales de alta calidad a partir de cáncer de ovario humano y tejidos de control para la proteómica cuantitativa a gran escala benefician la comprensión en profundidad de la función mitocondrial en la patogénesis del cáncer de ovario y los cambios en la red molecular mitocondrial, y ayudan a aclarar su mecanismo molecular para el posterior descubrimiento de la terapia diana y biomarcadores eficaces basa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA protein assay kit	Vazyme	E112	BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA)	Solarbio	A8020-5G	Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge	XiangYi	TDZ4--WS
CHAPS	Sigma	C9426-5G	BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma	798681-100G	Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT	Sigma	10197777001	1,4-Dithiothreitol
Easy nLC	Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E0396-10G	BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer	SilentShake	HYQ-3110
iTRAQ reagent kit	Applied Biosystems		Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger	Eppendorf	5424R
Mannitol	Macklin	M813424-100G	Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine	Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse	Solarbio	P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT)	Sigma	56480-25G	Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz	Alere/Axis-Shield	1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor	Solarbio	P0100-1ML	PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride	Macklin	P816354-25G	Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4	Matrix Science, London, UK
PVDF membrane	Millipore	05317	It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific
SCX column	Sigma	58997	It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V)	Macklin	S817660-25G	Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose	Macklin	S824459-500G	Vetec reagent grade, 99%
Thiourea	Sigma	62-56-6	ACS reagent, ≥99.0%
Tris base	Sigma	10708976001	TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use)	Gibco	25200-056	This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea	Sigma	U5378-100G	powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture