Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein Protokoll der Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation vor, um Mitochondrien von menschlichen Eierstockkrebsgeweben zu trennen und Eierstockgewebe für die quantitative Proteomik-Analyse zu kontrollieren, eine hochwertige mitochondriale Probe und eine quantitative Proteomikanalyse mit hohem Durchsatz und hoher Reproduzierbarkeit eines humanen Ovarialkarzinoms mitochondrialem Proteom.

Zusammenfassung

Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen menschlicher Eierstockkrebserkrankungen, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, der Zellsignalisierung und des oxidativen Stresses. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Eine effektive mitochondriale Präparationsmethode in Verbindung mit einem isobarischen Tag für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) quantitative Proteomik werden hier vorgestellt, um menschlichen Eierstockkrebs zu analysieren und mitochondriale Proteome zu kontrollieren, einschließlich Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, starke Kationenaustauschfraktionierung (SCX), Flüssigkeitschromatographie (LC), Tandem-Massenspektrometrie (MS/ MS), Datenbankanalyse und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Viele Proteine wurden erfolgreich identifiziert, um die Abdeckung des humanen Ovarialkarzinoms zu maximieren und das differenziell exprimierte mitochondriale Proteinprofil bei menschlichen Eierstockkrebs zu erreichen.

Einleitung

Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus^1,2. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von menschlichen Eierstockkrebs, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, Zellsignalisierung, und oxidativen Stress^3,4,5,6,7. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Mitochondrialer Stoffwechsel wurde vorgeschlagen und als Ziel für die Krebstherapie anerkannt, und antimitochondriale Therapie könnte letztlich sehr vorteilhaft für die Verhinderung des Wiederauftretens und Metastasierung von Krebs⁸sein. Individuelle metabolische Profilerstellung wird auch bereits als nützliches Werkzeug für Krebsschichtung und Vorhersagestrategien^9,10praktiziert.

Das langfristige Ziel dieser Forschung ist die Entwicklung und Verwendung einer quantitativen mitochondrialen Proteomik-Methode zur Untersuchung von Eierstockkrebs zur Klärung von mitochondrialen Proteomveränderungen zwischen Eierstockkrebs und Kontrolle von Eierstockgeweben und deren molekularen Netzwerkveränderungen aus einem systematischen Multiomics-Winkel^11,12, was zur Entdeckung von mitochondrienzielorientierten molekularen Biomarkern¹³ zur Klärung der molekularen Mechanismen von und personalisierte Behandlung von Eierstockkrebspatienten. Isobarische Tags für die relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) Kennzeichnung^3,4 sind eine effektive Methode, um die mitochondrialen Proteinveränderungen zu quantifizieren. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus humanem Eierstockkrebs und die Kontrolle von Eierstockgeweben sind die Voraussetzung für die quantitative iTRAQ-Analyse von mitochondrialen Proteomen³. Mitochondriale Präparat in Verbindung mit iTRAQ quantitative proteomics wurde erfolgreich in langfristigen Forschungsprogrammen über den menschlichen Eierstockkrebs mitochondrialen Proteom verwendet, einschließlich der Einrichtung von mitochondrialen Proteom Referenzkarten³, die Analyse von differenziell exprimierten mitochondrialen Profilen^4,14 und post-translational Modifikationen, einschließlich Phosphorylierung, die bereits zur Entdeckung eines wichtigen Signalwegs geführt hat Netzwerkveränderungen bei menschlichen Eierstockkrebs⁵, einschließlich Veränderungen im Energiestoffwechsel⁴, Fettstoffwechsel, und Mitophagie-Signalweg-Systeme³.

Frühere Studien haben herausgefunden, dass Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation eine effektive Methode ist, um Mitochondrien von menschlichem Eierstockkrebs zu isolieren und zu reinigen und Eierstockgewebe^3,4,5,14zu kontrollieren. Die iTRAQ-Etikettierung in Verbindung mit starker Kationenaustausch (SCX)-Flüssigchromatographie (LC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) ist die Schlüsseltechnik, um die Proteine aus den vorbereiteten mitochondrialen Proben zu erkennen, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Hier werden detaillierte Protokolle für die mitochondriale Präparation in Verbindung mit der quantitativen iTRAQ-Proteomik beschrieben. Diese wurden erfolgreich bei der Analyse von humanen Eierstockkrebsgewebe mitochondrialen Proteomen eingesetzt. Die Protokolle umfassen die Vorbereitung von Proben, Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, SCX-Fraktionierung, LC, MS/MS, Datenbanksuche und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Darüber hinaus übersetzt dieses Protokoll leicht, um andere menschliche Gewebe mitochondriale Proteome zu analysieren.

Protokoll

Für dieses Protokoll wurden Eierstockgewebe einschließlich Eierstockkrebsgewebe (n = 7) und normales Kontroll-Ovarialgewebe (n = 11) verwendet. Das vorliegende Protokoll^3,4,5 ist von der Xiangya Hospital Medical Ethics Committee of Central South University, China, genehmigt.

1. Präparation von Mitochondrien aus menschlichem Eierstockkrebsgewebe

1. Vorbereiten 250 ml des mitochondrialen Isolationspuffers durch Mischen von 210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 100 mM Kaliumchlorid (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM Diaminetetraessigsäure (EDTA), 0,1 mM Ethylenglykol bis(2-Aminoethylether)Tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Proteaseinhibitor, 2 mM Natriumorthovanadate (V) und 0,2% Rinderserumalbumin (BSA), pH 7,4.
2. Legen Sie 1,5 g Eierstockkrebsgewebe in eine saubere Glasschale.
3. Fügen Sie 2 ml des vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffers hinzu, um das Blut von der Gewebeoberfläche 3x leicht zu waschen.
4. Verwenden Sie eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in ca. 1 mm³ Stück zu zerkleinern und das gehackte Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenrohr zu übertragen.
5. Fügen Sie 13,5 ml mitochondrialen Isolationspuffer mit 0,2 mg/ml Nagarse hinzu, und verwenden Sie dann einen elektrischen Homogenisator, um die Hackfleischgewebe (2 min, 4 °C) zu homogenisieren (Verwendung skalieren 2, 10 s 6x, Intervall 10 s).
6. Fügen Sie weitere 3 ml mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.
7. Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe homogenat (1.300 x g, 10 min, 4 °C). Entfernen Sie die rohe Kernfraktion (d. h. das Pellet) und halten Sie den Überstand.
8. Recentrifuge der Überstand (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Entfernen Sie die Mikrosomen (d. h. den Überstand) und halten Sie das Pellet.
9. Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu und setzen Sie das Pellet durch leichte Pipettierung gut aus.
10. Zentrifugieren Sie die Pelletsuspension (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die rohen Mitochondrien (d. h. das Pellet) auf.
11. Fügen Sie 12 ml mit 25% Dichtegradientenmedium (d.h. Nycodenz) hinzu, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen.
12. Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, indem Sie ein Rohr von unten nach oben mit 5 ml 34%, 8 ml von 30%, 12 ml von 25% (mit den rohen Mitochondrien ab Schritt 1,11), 8 ml von 23% und 3 ml 20% Dichtegradientenmedium und Zentrifuge (52.000 x g, 90 min, 4 °C) füllen.
13. Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien an der Schnittstelle zwischen dem 25% und 30% Dichtegradientenmedium in ein sauberes Rohr zu sammeln.
14. Fügen Sie den mitochondrialen Isolationspuffer in die gesammelten Mitochondrien ein, um sie auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C) und den Überstand entsorgen.
15. Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet wieder auszusetzen, und Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet.
16. Das endgültige Pellet (d.h. die gereinigten Mitochondrien) sammeln und bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Kombinieren Sie alle gereinigten Mitochondrien aus dem Eierstockkrebsgewebe als Mitochondrienprobe für die quantitative Proteomik-Analyse.

2. Herstellung von Mitochondrien aus dem eierrischen Gewebe der menschlichen Kontrolle

1. Bereiten Sie 250 ml des mitochondrialen Isolationspuffers vor, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
2. Legen Sie 1,5 g des normalen Kontroll-Ovarialgewebes in eine saubere Glasschale.
3. Fügen Sie 2 ml vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Blut leicht von der Gewebeoberfläche 3x zu waschen.
4. Verwenden Sie eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in ca. 1 mm³ Stück zu zerkleinern und das gehackte Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenrohr zu übertragen.
5. Fügen Sie 8 ml 0,05% Trypsin/20 mM EDTA in phosphatgepufferter Saline (PBS) in das gehackte Kontrollgewebe und verdauen (30 min, Raumtemperatur), was hilft, das Gewebe und die Zellen zu lysieren und Mitochondrien freizusetzen. Dann Zentrifuge (200 x g, 5 min). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die Gewebe und Zellen auf.
6. Fügen Sie 13,5 ml mitochondrialen Isolationspuffer mit 0,2 mg/ml Nagarse hinzu, und verwenden Sie dann einen elektrischen Homogenisator, um die Hackfleischgewebe (2 min, 4 °C) zu homogenisieren (Verwendung skalieren 2, 10 s 6x, Intervall 10 s).
7. Fügen Sie weitere 3 ml mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.
8. Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe homogenat (1.300 x g, 10 min, 4°C). Entfernen Sie die rohe Kernfraktion (d. h. das Pellet) und halten Sie den Überstand.
9. Recentrifuge der Überstand (10.000 x g, 10 min, 4°C). Entfernen Sie die Mikrosomen (d. h. den Überstand) und halten Sie das Pellet.
10. Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet durch leichte Pipettierung gut auszusetzen.
11. Zentrifugieren Sie die Pelletsuspension (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die rohen Mitochondrien (d. h. das Pellet) auf.
12. Fügen Sie 12 ml mit 25% DichteGradientenmedium hinzu, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen.
13. Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, indem Sie ein Rohr von unten nach oben mit 8 ml von 38%, 5 ml von 34%, 8 ml von 30%, 12 ml von 25% (mit den rohen Mitochondrien von Schritt 2,12), 8 ml von 23% und 3 ml mit 20% Dichtegradienten medium und Zentrifuge (52.000 x g, 90 min, 4 ° C) füllen.
14. Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien im Bereich von der Schnittstelle zwischen 25% und 30% bis zur Schnittstelle zwischen 34% und 38% in ein sauberes Rohr zu sammeln.
15. Fügen Sie den mitochondrialen Isolationspuffer in die gesammelten Mitochondrien ein, um sie auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C) und den Überstand entsorgen.
16. Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet wieder aufzuhängen, und zentrifugieren Sie es (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet.
17. Das endgültige Pellet (d.h. die gereinigten Mitochondrien) sammeln und bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Kombinieren Sie alle gereinigten Mitochondrien aus dem Kontroll-Ovarialgewebe als mitochondriale Proben für die quantitative Proteomik-Analyse.

3. Überprüfung der Qualität von gereinigten gewebemitochondrialen Proben

1. Nehmen Sie eine Röhre mit gereinigten mitochondrialen Proben (d. h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe ab Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes ab Schritt 2.17) zur Überprüfung mit Elektronenmikroskopie (EM).
   HINWEIS: Das detaillierte Protokoll wurde zuvor beschrieben^15,16.
2. Bereiten Sie den mitochondrialen Proteinextraktionspuffer durch Mischen von 8 M Harnstoff, 2 M Thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM Dithiothreitol (DTT) und 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonat (CHAPS) vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,52 ein.
3. Nehmen Sie eine Röhre mit gereinigten mitochondrialen Proben (d. h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe in Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes in Schritt 2.17) und fügen Sie mitochondrialen Proteinextraktionspuffer (mitochondriale Proben zum Proteinextraktionspuffer, 1:5) das Pellet wieder aussetzen. Die Proben in flüssigem Stickstoff 3x einfrieren und bei Raumtemperatur 2 h lagern.
4. Zentrifuge bei 12.000 x g,30 min, 4 °C, sammeln Sie den Überstand (d.h. die extrahierte mitochondriale Proteinprobe) und messen Sie den Proteingehalt mit einem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay-Kit.
5. 50 ml von 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) durch Mischen von 9,08 g Tris und 40 ml ddH₂O vorbereiten, den pH-Wert mit HCl auf 8,8 einstellen und ddH₂O zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
6. 50 ml von 1 M Tris-HCl (pH 6,8) durch Mischen von 6,06 g Tris und 40 ml ddH₂O vorbereiten, den pH-Wert mit HCl auf 6,8 einstellen und ddH₂O zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
7. 100 ml 30% Acrylamid-Bis-Lösung durch Mischen von 29 g Acrylamid, 1 g Bisacrylamid und 80 ml ddH2 O und Zugabe von ddH₂O auf ein Endvolumen von 100 ml vorbereiten. Bewahren Sie sie in einer braunen Flasche bei 4 °C auf.
8. 1.000 ml 10x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer durch Mischen von 29 g Glycin, 58 g Tris, 3,7 g Natriumdodecylsulfat (SDS) und 800 ml ddH₂O vorbereiten und dann ddH₂O zu einem Endvolumen von 1.000 ml hinzufügen.
9. 10 ml Ladepuffer durch Mischen von 2 ml Glycerin, 0,02 g Bromphenolblau, 0,4 g SDS, 2 ml Tris-HCl pH 6,8 und 7 ml ddH₂O vorbereiten und dann ddH₂O zu einem Endvolumen von 10 ml hinzufügen.
10. 10 ml 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auflösendes Gel durch Mischen von4 ml ddH2 O vorbereiten, 3,3 ml 30% Acrylamid-Bis-Lösung, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% Ammoniumpersulfat und 0,004 ml Tetramethylethylendiniin (TEMED). Gießen Sie die SDS-PAGE-Auflösungsgellösung in die Platte zwischen den Glasplatten auf die Ebene des Bodens des Kamms. Fügen Sie 2 ml Isopropylalkohol auf die Oberseite. Lassen Sie für 30 min.
11. Entfernen Sie den Isopropylalkohol und waschen Sie die Oberseite mit ddH₂O 3x. Gießen Sie die 5%ige Gellösung mit 4,1 ml ddH₂O, 1,0 ml 30% Acylamid-bis-Lösung, 0,75 ml von 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml 10% Ammoniumpersulfat und 0,006 ml TEMED. Den Kamm sofort in die Konzentrationsgellösung einlegen, 30 min lassen und dann den Kamm herausnehmen.
12. Bereiten Sie den 1x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer vor, indem Sie 100 ml 100-Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer mit 900 ml ddH₂O verdünnen und in den elektrophoretischen Tank gießen.
13. Mischen Sie 30 g der mitochondrialen Proteine aus dem Eierstockkrebs und kontrollieren Sie Eierstockgewebe von Schritt 3.4 mit Ladepuffer bis zu einem Endvolumen von 20 l. Kochen Sie das Gemisch für 5 min, und trennen Sie es dann mit dem 10% SDS-PAGE Auflösungsgel mit einer konstanten Spannung von 100 V. Wenn das Bromphenolblau den Boden erreicht, stoppen Sie die Elektrophorese.
14. 1,5 l elektrophoretischen Transferpuffer vorbereiten, indem 150 ml 10x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer, 1.050 ml ddH₂O und 300 ml Methanol gemischt werden.
15. Die PVDF-Membran in 100% Methanol für 10 min und im elektrophoretischen Transferpuffer für mindestens 5 min einweichen. Fünf Blatt Filterpapier in 1x elecrophoretischem Transferpuffer für mindestens 5 min einweichen.
16. Nehmen Sie das SDS-PAGE-Gel heraus, das die Proteine enthält, und tränken Sie es 10 min im elektrophoretischen Transferpuffer.
17. Machen Sie eine Transferkassette, indem Sie einen nassen Schwamm auf die weiße Platte, drei Blatt nasses Filterpapier, die PVDF-Membran, das SDS-PAGE-Gel mit den Proteinen, zwei Blatt nasses Filterpapier und den nassen Schwamm von unten nach oben legen. Vermeiden Sie Blasen.
18. Legen Sie die Transferkassette in den elektrophoretischen Tank, gießen Sie den elektrophoretischen Transferpuffer ein und übertragen Sie dann 2 h unter einem konstanten 200 mA Strom.
19. Bereiten Sie 10x Tris-gepufferte Salin (TBS) Stofflösung vor, indem Sie 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl mischen und ddH₂O zu einem Endvolumen von 500 ml hinzufügen. Bereiten Sie 2 L 1x 1x TBST vor, indem Sie 200 ml 10x TBS, 2 ml Tween-20 und 1.798 ml ddH₂O mischen. Bereiten Sie 100 ml Blockierlösung durch Mischen von 100 ml TBST und 5 g BSA vor.
20. Nach dem Transfer die PVDF-Membran herausnehmen, in TBST 5 min leicht waschen und dann in Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur blockieren.
21. Inkubieren Sie die PVDF-Membran (4 °C über Nacht) mit verschiedenen primären Antikörpern, die für verschiedene subzelluläre Organellen spezifisch sind, einschließlich Lamin B (Zellkern; Ziegenantihumanantikörper 1: 1.000 Blockierlösung), Flottillin-1 (Zytomembran; Kaninchen-Antihuman Antikörper 1:500 Blockierlösung), COX4I1 (Mitochondrion; Kaninchen antihuman 1:1,000 Blockierlösung), GM130 (Golgi-Apparat; Maus-Antihuman-Antikörper 1:1.000 Blockierlösung), Kataalase (Peroxisome; Kaninchen-Antihuman-Antikörper 1:1.000 Blockierung und Kathepsin B (Lysosom; Kaninchen antihumanantikörper 1:1,000 Blocking Solution). In TBST für 5 min 3x leicht waschen.
22. Inkubieren Sie die PVDF-Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit den entsprechenden sekundären Antikörpern (Kaninchen-Anti-Ziege, Ziege Anti-Kaninchen oder Ziege Anti-Maus). In TBST für 5 min 3x leicht waschen. Visualisieren Sie es mit Elektrochemilumineszenz (ECL).

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS Analyse

HINWEIS: Die detaillierten Verfahren für Abschnitt 4 beziehen sich auf die iTRAQ-Anweisungen (Tabelle der Materialien).

1. SDT-Puffer (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 und 100 mM DTT) zu den gereinigten mitochondrialen Proben hinzufügen (d.h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe ab Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes ab Schritt 2.17). Wirbeln Sie die Probe, bis es keinen sichtbaren Niederschlag gibt.
   HINWEIS: Das mitochondriale Verhältnis zu SDT-Puffer sollte 1:5 betragen.
2. Die SDT-behandelte Probe 5 min aufkochen, die Probe auf Eis abkühlen und dann Zentrifuge (2.000 x g, 2 min) abkühlen.
3. Sammeln Sie den Überstand als extrahierte mitochondriale Proteinproben und messen Sie den Proteingehalt mit einem BCA-Protein-Assay-Kit.
4. Nehmen Sie SDT-extrahierte mitochondriale Proteine (200 g jeder Probe) zur Reduktion, Alkylierung, Verdauung mit Trypsin, Entsalzung und Lyophilisierung^3,4. Machen Sie drei Replikationen für jedes Beispiel.
5. Behandeln Sie die tryptischen Peptide (100 g jeder Probe) ab Schritt 4.4 mit 100 mM Tetraethylammoniumbromidlösung (pH 8.5) und beschriften Sie die tryptischen Peptide mit einem der 6-Plexi-iTRAQ-Reagenzien gemäß den Anweisungen^3,4. Beschriften Sie jedes Sample 3x.
6. Mischen Sie gleich 6 markierte tryptische Peptidproben (drei aus Eierstockkrebsgewebe und drei aus der Kontrolle von Eierstockgeweben) und trocknen Sie mit einem Vakuumkonzentrator.
7. Fraktionieren Sie die gemischten iTRAQ-markierten Peptide mit SCX-Chromatographie in 60 Fraktionen (eine Fraktion pro 1 min), und kombinieren Sie dann alle zwei Fraktionen als SCX-fraktionierte Probe (n = 30).
8. Unterziehen Sie jede SCX-fraktionierte Probe einer LC-MS/MS-Analyse auf einem Massenspektrometer^3,4 gekoppelt mit einem Nano-LC-System innerhalb eines LC-Trenngradienten von 60 min, um MS/MS-Daten zu erhalten.
9. Durchsuchen Sie die MS/MS-Daten, um Proteine mit der Suchmaschine (Tabelle der Materialien) zu identifizieren.
10. Verwenden Sie die iTRAQ Reporter-Ionen-Intensitäten, um jedes Protein zu quantifizieren und mitochondriale Differentialexprimien (mtDEPs) mit einer Veränderung von >1,5 oder <-1,5-fach und p < 0,05 zu bestimmen.

Ergebnisse

Es gab einen Unterschied in der Herstellung der Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und der Kontrolle von Eierstockgeweben. Diese Studie ergab, dass es viel einfacher war, Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben vorzubereiten als aus der Kontrolle von Eierstockgeweben^3,4. Das Protokoll zur Herstellung von Mitochondrien aus kontrollischen Eierstockgeweben musste verbessert werden. Zunächst war es vor der Gewebehomogenisierung ...

Diskussion

Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von Eierstockkrebs. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus menschlichem Eierstockkrebs und Kontrollgewebe nützen dem tiefen Verständnis der mitochondrialen Funktion bei Eierstockkrebspathogenese und mitochondrialen molekularen Netzwerkveränderungen und helfen dabei, den molekularen Mechanismus für die spätere Entdeckung der Zieltherapie und wirksamer Biomarker auf Basis von Mitochondrien^4,5<...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA protein assay kit	Vazyme	E112	BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA)	Solarbio	A8020-5G	Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge	XiangYi	TDZ4--WS
CHAPS	Sigma	C9426-5G	BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma	798681-100G	Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT	Sigma	10197777001	1,4-Dithiothreitol
Easy nLC	Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E0396-10G	BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer	SilentShake	HYQ-3110
iTRAQ reagent kit	Applied Biosystems		Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger	Eppendorf	5424R
Mannitol	Macklin	M813424-100G	Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine	Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse	Solarbio	P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT)	Sigma	56480-25G	Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz	Alere/Axis-Shield	1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor	Solarbio	P0100-1ML	PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride	Macklin	P816354-25G	Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4	Matrix Science, London, UK
PVDF membrane	Millipore	05317	It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific
SCX column	Sigma	58997	It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V)	Macklin	S817660-25G	Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose	Macklin	S824459-500G	Vetec reagent grade, 99%
Thiourea	Sigma	62-56-6	ACS reagent, ≥99.0%
Tris base	Sigma	10708976001	TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use)	Gibco	25200-056	This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea	Sigma	U5378-100G	powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture