冠状血管化后心血管预后冠状动脉祖细胞和可溶性生物标志物

摘要

严重不良心血管事件的发展，影响冠状血管后心血管预后，受冠状动脉损伤和血管修复程度的影响。使用新型冠状细胞和可溶性生物标志物，对血管损伤和修复反应，有助于预测MACEs的发展和预后。

摘要

重大心血管不良事件 （MACEs） 对冠状血管化患者的心血管预后产生负面影响，因为冠状缺血损伤。冠状动脉损伤的程度和血管修复机制是影响MACEs未来发展的因素。内血管特征，如斑块特征和冠状动脉复杂性已证明MACEs的预后信息。然而，冠状动脉内循环生物标志物的使用已被假定为早期识别和预后MACE的一种方便方法，因为它们更密切地反映了涉及冠状动脉损伤和修复的动态机制。血管成形术期间冠状循环生物标志物的测定，如单核祖细胞（MPCs）的亚种群数量，以及反映炎症、细胞粘附和修复的可溶性分子的浓度，允许评估未来的发展和MACEs的预后6个月冠状血管性血管性。该方法的转化性与外周血液循环生物标志物相比，在预测MACEs方面性能更好，对心血管预后的影响，可应用于患者的风险分层冠状动脉疾病经历血管性。

引言

冠状血管化和支架是冠状动脉疾病 （CAD） 患者的抢救程序。然而，重大心血管不良事件（MACEs），包括心血管死亡、心肌梗死、冠状动脉恢复症和心绞痛发作或心力衰竭，可能在冠状动脉介入后数月发生，导致不定期到医院就诊。MACEs在全世界很普遍，其死亡率很高^。

冠状缺血损伤诱导早期血管反应和重组机制，涉及动员MPC由于其分化能力和/或血管抑制电位，以及可溶性分子，如细胞间粘附分子（ICAM），基质金属蛋白酶（MMPs）和反应氧物种，反映细胞粘附，组织重塑和氧化应激。虽然内在血管特征，如斑块特征和冠状动脉复杂性已经被用来预测MACEs，一些研究表明，与冠状内皮发生损伤和修复机制相关的生物标志物对于CAD提交冠状血管成形^{的2、3、4、5}患者的心血管事件的早期识别和预后非常有用。

持续的兴趣，了解CAD损伤和修复背后的机制，促使研究者研究冠状循环生物标志物，因为冠状动脉取样更密切地反映血管损伤和修复^6。然而，在人类研究中，冠状生物标志物的表征一直很少，7、8、9。因此，本研究的目的是描述一种确定冠状循环MPC和可溶性分子的量的方法，反映血管损伤和修复，并表明这些生物标志物是否与MACE和接受冠状血管化的CAD患者的临床预后有关。该方法基于使用血管相关、循环的MpCs和可溶性分子，通过采样最接近血管损伤的位置获得。对于下肢缺血、中风、血管炎、静脉血栓和其他涉及血管损伤和修复的损伤的临床研究，它也可能有用。

研究方案

该协议符合人类研究伦理委员会的体制准则。

1. 冠状血管造影、超声和血液取样

1. 在冠状动脉介入之前，请求基线临床和人口统计信息。收集个人数据:年龄、性别、当前吸烟状态、体重指数（BMI）、高血压、血脂异常、糖尿病、药物和当前冠状血管造影指标。
2. 使用径向方法通过心脏导管进行冠状血管造影。此程序应在由专家心脏病学家在血管动力学室的荧光镜指导下进行。
   注:识别有价值的容器。在本研究中，可评价的血管被定义为截面大于1.5毫米和流明狭窄超过50%的动脉。
3. 将血管内超声导管推进到感兴趣的区域并记录图像。使用适当的软件定位和测量最小的发光区域。
4. 使用冠状导管从离斑块最近的位置收集10 mL的血液。
5. 患者出院后，定期安排医学评估，跟踪研究终点。如果无法进行电话联系或医生访问延迟超过 2 个月，请请求授权人员（以前设计）验证研究端点。
   注:考虑以下任何一个MACE:1）心血管死亡，2）新的心肌梗死，3）不稳定的心绞痛促使在24小时内进行计划外的医疗访问，4）支架恢复性，如冠状血管造影所示，5）脱损发作心力衰竭需要临床关注。

2. 循环MpC的确定（图2）

1. 从采集到1小时内处理血液。将采集的血液6 mL转移到15 mL锥形管中，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释1:1（v/v），pH = 7.4。
2. 将2 mL的密度梯度介质添加到三个试管中。小心地将稀释血液的三个等量等分分转移到每个含有密度梯度介质的试管中。
   注:密度梯度介质和稀释血液的总体积不应超过试管最大容量的四分之三。
3. 在1，800 x g，4°C下离心30分钟。将层之间的界面上的带子转移到新管中。在1，800 x g下加入2 mL的PBS和离心机，4°C6分钟。颗粒将包含 MpC。
4. 洗过几次小球。吸出以前的溶液，在新鲜的PBS中轻轻重新悬浮细胞颗粒。对于后续的施水，在1，800 x g，4°C下离心2分钟。 重复这个过程6倍。
5. 在PBS的1mL中重新悬浮细胞颗粒。将细胞悬浮液的20 μL与0.4%试盘蓝色混合，稀释1:1（v/v）。在光显微镜下将滴片涂在血细胞仪上，并计算未染色的细胞。
6. 继续确定 MpC。标记 5 mL 流式细胞测定管，每管 1 x 10⁶个细胞分分。准备相应的等型匹配对照抗体。在1，800 x g，4°C下离心6分钟，并丢弃上清液。
7. 加入在100μL中稀释的抗体孵育溶液中的初级抗体，包括1xPBS（pH = 7.4）、2 mM乙烯二甲酸乙酸（EDTA）和0.05%牛血清白蛋白（BSA）。重新悬浮10秒，在4°C下孵育20分钟，防光。该协议可以在此步骤中暂停，将淋巴细胞固定在PBS中的4%甲醛中，并在4°C下储存至24小时的样品。
   注:本协议中使用的主要抗体的最终浓度为CD45 1:50、CD34 1:20、KDR 1:50、CD184 1:20、CD133 1:50。
8. 在1，800 x g，4°C下离心2分钟，并丢弃上清液。在 500 μL 的 1x PBS （pH = 7.4），2 mM EDTA 中重新悬浮。
9. 执行流式细胞测定分析。使用等型匹配控制抗体设置背景染色。然后，选择在 FSC/SSC 图处传播的淋巴细胞，试图排除残留的粒细胞、细胞碎片和其他颗粒，这些颗粒通常位于图中左下分布的较低位置。这种分布被视为 100%。
10. 使用包含大量具有常见免疫表型 CD45⁺和 CD34⁺的细胞的门。对于双阳性免疫表型，使用以前识别 CD45 的门^[， CD34^]， 并添加 KDR （VEGFR-2）⁺CD133⁺或 CD184⁺.通过特定的细胞表面标记识别 MPC 子群体。以封闭事件的百分比进行报告。
11. 确定 MpC 的主要子群体。在本研究中，主要免疫机型是CD45+CD34⁺CD133⁺CD45⁺CD34⁺CD34⁺CD44 + CD34+ CD133⁺CD134 + CD45⁺CD34⁺CD44⁺CD44 + CD184。
    注:使用的细胞表面标记物为CD45（淋巴细胞）、CD34（内皮和/或血管细胞）、KDR（VEGFR-2、内皮细胞膜标记）、CD133（内皮祖细胞）和CD184（造血干细胞和内皮细胞）。

3. 等离子体可溶性生物标志物的测定

1. 使用酶连结免疫吸附测定（ELISA）确定SICAM-1和MMP-9的浓度（图3，上行）。
   1. 在3000 x g下将血液样本离心，室温5分钟，并收集血浆。
   2. 标记标准、样品管和控制管。使用 ELISA 套件中提供的洗涤缓冲液将预涂孔与洗涤板中的预涂孔进行平衡。
   3. 将标准、样品和控制转移到井中。密封并在37°C孵育90分钟。
      注意:不要让井完全干燥。
   4. 丢弃内容物并添加生物锡检测抗体。密封并在37°C孵育60分钟。
   5. 丢弃内容物并洗 3x。用链球菌工作溶液密封斑块并按顺序孵育，随后在37°C下使用四甲基苯丙胺基质30分钟，防光。在孵育之间洗涤3倍。当颜色发展时，添加停止溶液，并在微孔板 ELISA 读取器中读取光学密度吸收。
2. 使用免疫磁多路复用测定确定肿瘤坏死因子α（TNF+）和白细胞介素1β（IL-1+）的浓度（图3，下行）。
   1. 标记标准、样品管和控制管。
   2. 将磁珠小瓶涡流30s.将珠子悬浮液转移到适当尺寸的管子上，然后转移到多路复用检测板中的孔。周期性涡旋可避免珠子的沉淀。
   3. 牢固地插入手持磁性板垫片。等待 2 分钟，让珠子积聚在每个井的底部，并迅速将手持磁板处理器和板组件倒置，放在水槽或废物容器上。切记使用手持磁板器维护井内的珠子。
   4. 将150 μL的洗涤缓冲液加入每个井中，等待30s，让珠子在底部积聚。如步骤 3.2.3 中的内容的那样丢弃。然后，加入25μL的通用测定缓冲液（在试剂盒中提供），然后加入25μL的制备标准、样品和控制。
   5. 密封板并在室温下孵育至少 60 分钟，防光，在 500 rpm 时持续摇动。或者，在4°C下孵育过夜，防光，如果可能，在500rpm下持续摇动。
   6. 加入150μL的洗涤缓冲液洗涤2次，等待30s。通过插入手持磁盘清洗器丢弃内容物。等待 2 分钟，在水槽或废物容器上反转。
   7. 在室温下连续孵育25μL检测抗体混合物，然后25μL的链球菌-PE溶液在室温下孵育30分钟，密封和防光，在500rpm时持续摇动。如步骤 3.2.6 所述，在孵育之间洗涤 2 倍。
   8. 获取读数。添加 120 μL 的读取缓冲液。密封板并在室温下孵育 5 分钟，防光，在 500 rpm 时持续摇动。在多路复用测定读取器上运行读数。根据每个解毒剂调整读数参数。

结果

从52名接受冠状血管造影的患者中采集冠状、静脉坐宗和外周血（图1），显示高血压和血脂异常的高患病率。在临床随访中，11 （21.1%）在冠状血管造影术发生6个月后，MACEs:死亡（n = 1），需要住院治疗的心绞痛（n = 6），心肌梗死（n = 2），和/或心力衰竭的证据（n = 4）。

大多数MPC的基线冠状动脉浓度?...

讨论

从受影响的冠状动脉采集血液可能很困难。有时，冠状动脉几乎无法到达。在这种情况下，从静脉主塞采样可能是一种选择。我们进行了验证测试，比较冠状动脉中的循环生物标志物与静脉阴热，没有显著差异。然而，循环生物标志物的性能只用于冠状动脉取样。因此，从静脉主塞获得的生物标志物的性能仍有待探索。

最好在采血后的前 3 小时内处理 MpC 的样本。因此，心脏...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm